Summary
Yuvarlak solucanlar Caenorhabditis elegans ana bilgisayar-patojen etkileşimleri incelemek için mükemmel bir modeldir. Burada açıklanan solucan mitis grubu streptokok üyeleri ile enfekte ve oksidatif stres tepkisi bu grup organizmalar tarafından üretilen H2O2 karşı aktivasyonu belirlemek için bir iletişim kuralıdır.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans), yaşayan bir yuvarlak solucanlar, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri eğitim için çekici bir model ortaya çıkmıştır. Sunulan Protokolü mitis grubu streptokok H2O2üretim yoluyla neden patojenitesi belirlemek için bu modeli kullanır. Mitis grubu streptokok bakteriyemi, endokardit ve orbital sellülit gibi birçok insan hastalığa neden ortaya çıkan bir tehdit vardır. Burada açıklanan bu solucanların H2O2 yanıt olarak yaşama belirlemek için bir protokol patojenler bu grup tarafından üretilmektedir. Gen skn-1 bir oksidatif stres yanıt transkripsiyon faktörü için kodlamayı kullanarak, bu model Streptokok enfeksiyonu karşı gerekli olan ana bilgisayar genlerin tanımlamak için önemlidir gösterilir. Ayrıca, etkinleştirme oksidatif stres yanıtının SKN-1 yeşil flüoresan protein (GFP) eritilmiş olan bir transgenik muhabir solucan yük kullanarak bu patojenler huzurunda izlenebilir gösterilir. Bu deneyleri fırsat oksidatif stres tepkisi H2O2 exogenously olarak biyolojik bir kaynak tarafından elde edilen çalışma Reaktif oksijen türleri (ROS) kaynakları ek sağlamak.
Introduction
Mitis grubu streptokok oropharyngeal boşluğu1insan commensals vardır. Ancak, bu organizmaların bu niş kaçış ve invazif hastalıkları2çeşitli neden. Bu mikroorganizmalar tarafından neden olduğu enfeksiyonlar bakteriyemi, endokardit ve orbital sellülit2,3,4,5,6içerir. Ayrıca, kan dolaşımına enfeksiyonlar olarak sorumlu ajanlar ortaya çıkıyor içinde immün, Nötropenik ve kemoterapi5,7,8,9 uğramıştır kanserli hastalarda .
Mekanizmaları temel mitis grup Patogenez olduğunu belirsiz, çünkü birkaç virülans faktörleri tespit edilmiştir. Mitis grup oral mikrobiyal topluluklar10içinde önemli bir rol oynamaya göstermiştir H2O2, üretmek için bilinir. Daha yakın zamanlarda, çeşitli çalışmalarda H2O2 için rol epitel hücre ölüm11,12indükler bir Sitotoksin olarak çizer. Bu gruba ait S. pnömoni, DNA hasarı ve alveoler hücreleri13' te apoptosis indükler H2O2 yüksek düzeyde üretmek için kanıtlanmıştır. Bir akut pnömoni hayvan modeli kullanarak, aynı araştırma H2O2 bakteri tarafından üretimi virülans avantaj confers göstermek. Pnömokok menenjit çalışmaları da bu patojen kaynaklı H2O2 sinerjik nöronal hücre ölüm14tetiklemek için pneumolysin ile hareket göstermiştir. Bu gözlemler açıkça kurmak için onların patojen bakteri bu grubu tarafından üretilen bu H2O2 önemlidir.
İlginçtir, bu da grubunun üyeleri mitis S. mitis ve oralis S. neden H2O215,16üretimi yoluyla nematodunun C. elegans ölümü gösterilmiştir. Bu evrimleşmiş Yuvarlak solucanlar birçok biyolojik süreçlerin çalışmaya basit, genetik olarak uysal model olarak kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, solucan ana bilgisayar-patojen etkileşimleri17,18eğitim için bir model olarak ortaya çıkmıştır. Ayrıca, çeşitli çalışmalarda oksidatif stres bu organizma19,20,21kullanarak okuyan önemini çizer. Onun kısa hayat döngüsü, yetenek RNAi tarafından ilgi devirme genler ve yeşil flüoresan protein (GFP) kullanımı-gen ekspresyonu izlemek için yuvarlak gazetecilere bir çekici model sistemi yapmak öznitelikleri bazılarıdır. Daha da önemlisi, oksidatif stres ve solucan doğuştan gelen bağışıklık düzenleyen yolları memeliler20,22ile son derece korunmuş.
Bu protokol için o C. elegans streptokok kaynaklı H2O2tarafından neden patojenitesi aydınlatmak için nasıl kullanılacağı gösterilmiştir. Değiştirilmiş hayatta kalma tahlil gösterilir ve mitis grubunun üyeleridir solucanlar hızla öldürmek mümkün yoluyla üretim H2O2. Reaktif oksijen türleri sürekli biyolojik kaynağı mitis grubunun üyeleri kullanarak (ROS), aksine solucanlar oksidatif stres neden kimyasal kaynaklardan sağlanır. Ayrıca, bakteri H2O2 (çeşitli engelleri geçmek zorunda diğer kaynaklarına göre) bağırsak hücrelere doğrudan hedef hangi sağlar hızla, solucanlar kolonize edebiliyoruz. Tahlil ya 1) tarafından belirlenmesi skn-1 mutant suşu veya 2) tarafından aşağı RNAi solucanlar N2 vahşi-türü göreli ve vektör kontrol tedavi solucanlar kullanma skn-1 eleştiri hayatta kalma doğrulanır. SKN-1 C. elegans23,24,25oksidatif stres yanıtında düzenleyen bir önemli transkripsiyon faktörü var. Hayatta kalma deneyleri ek olarak, bir SESN-1B/C::GFP transgenik muhabir ifade bir solucan yük mitis grupla aktivasyonu oksidatif stres yanıt yolu ile H2O2 üretim izlemek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. senin (Todd-Hewitt Maya ekstresi) Ağar kaplamalar hazırlanması
- Medya 1 L için 30 g Todd-Hewitt tozu, 2 g, Maya özü ve agar bir 2 L Erlenmeyer şişesi için 20 g ekleyin. Şişeye içeriği için 970 mL deiyonize su ekleyin ve bir heyecan bar bulunmaktadır. Otoklav medya 121 ° C sıcaklık ve basınç için 30 dk 15 lb/inç2 . Bundan sonra bir heyecan tabağa ortam küme ve nazik karıştırma ile soğutma için izin.
- Medya laminar akış altında uygun ölçekli steril Petri yemekler (100 mm x 15 mm yemekleri büyüme ve bakteri, deneyleri öldürmek için 35 mm x 10 mm yemekleri için) içine dökün. Laminer başlık altında 2 h için kuru medya izin. Bundan sonra tabakları 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.
2. nematodunun büyüme orta (NGM) ve tabak (NGM RNAi) besleme RNAi hazırlanması
- Bir heyecan çubuğunu kullanarak, 2.5 g pepton ve NaCl 3 g 970 ml deiyonize suyla bir 2 L Erlenmeyer şişesi geçiyoruz. 20 g agar medyaya ekleyin. Otoklav 121 ° C sıcaklık ve basınç 15 lb/inç2 30 dakika süreyle medya medya heyecan tabağa ayarla ve nazik karıştırma ile soğutma için izin.
- Aşağıdaki çözümleri NGM plakaları hazırlanması için medya ekleyin: 1 M potasyum fosfat tampon 25 mL (pH = 6.0), 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL (5 mg/mL % 95 etanol) kolesterol , 1 mL (% 10 etanol içinde v/w) nistatin ve 25 mg/mL streptomisin 1 mL.
- Aşağıdaki çözümleri NGM plakaları besleme RNAi hazırlanması için medya ekleyin: 25 mL 1 M potasyum fosfat tampon (pH = 6.0), 1 M MgSO4, 1 M CaCl2' nin (5 mg/mL % 95 etanol) kolesterol 1 mL 1 mL 1 mL , 1 mL (% 10 etanol içinde v/w) nistatin, 50 mg/mL carbenicillin 1 mL ve 1 mL Im IPTG.
- Medya steril Petri yemekler laminar akış altında 60 mm x 15 mm dökün. Laminer başlık altında 2 h için kuru medya izin. Daha sonra tabaklar 4 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.
3. C. elegans bakımından
- Tohum NGM plakaları gecede edindiği 50 µL tarafından E. coli OP50 plakaların Center'da büyüdü. E. coli kültür Luria-Bertani (LB) medyada önceden hazırlanmış ve birkaç ay boyunca 4 ° C'de depolanan. Kuruyucu ve laminer bir başlık altında 24 h için kuru ve bundan sonra plakaları polistren kapsayıcısında depolamak izin.
- Diseksiyon mikroskop altında 10 12 gravid yetişkinlere steril solucan pick kullanarak almak ve solucanlar bir E. coli için transfer OP50 numaralı seribaşı NGM plaka. 20 ° C'de plakaları gecede kuluçkaya.
- Ertesi gün, Yetişkin bir steril solucan pick kullanarak kaldırın ve embriyo L4 larva 20 ° c (~2.5 gün) için geliştirmek izin.
4. yaş zaman uyumlu nüfus Worms hazırlanması
-
2-dört NGM plakaları M9W kullanarak gravid yetişkin yıkama ve onları bir 15 mL konik tüp içinde toplamak.
- M9W hazırlamak için: 3 g-in NaCl, Na2HPO46 g ve 3 g KH2PO4 birleştirmek ve 1 litre deiyonize su son bir hacim içinde çözülür. Otoklav çözüm ve 1 mL 1 M MgSO4ekleyin.
- 450 x g 1 dk. için de tüp spin sonra solucan Pelet olduğu yerde kalacak sağlarken süpernatant dikkatle boşaltmak.
- 400 µL %8.25 sodyum hipoklorit (ev çamaşır suyu) ve solucan lizis çözüm hazırlamak için 5 N NaOH 100 µL ekleyin. Lizis çözüm solucan Pelet ve içeriği yetişkin solucanlar % 70'i lysed kadar tüp flicking karıştırın. Tüp yok yumurta overbleaching emin olmak için bir diseksiyon mikroskop altında içeriğini düzenli olarak gözlemlemek.
- Çamaşır suyu karışımı M9W 10 mL konik tüp içeriğini ekleyerek sulandırmak.
- 450 x g 1 dk. Decant süpernatant için de tüp spin sonra M9W 10 mL ekleyin.
- 4.5 iki kez daha tekrarlayın.
- Elde edilen yumurta Pelet M9W 3-5 mL resuspend. Tüpü bir tüp rotator yerleştirin. Tüpler, oda sıcaklığında (RT) 18 rpm hızında gecede döndürmek izin.
- Ertesi gün, tüp 450 x g L1 larva cips için 1 dakika için de spin. Tarafından ~ 250 µL tüp sıvı geride bırakarak aspirasyon, M9W çoğunu kaldırın. L1 larva resuspend ve yer üç 5 µL solucan süspansiyon bir Petri kabına kapak, o zaman tahmin solucanlar diseksiyon mikroskop kullanarak µL başına sayısı üzerine düşer.
5. indüksiyon RNAi solucanlar
- Steril bir kullanarak döngü veya çekme, donmuş hisse senetleri (Ahringer ve Vidal kitaplıkları) 100 mm x 15 mm LB Ağar kaplamalar 50 µg/mL carbenicillin ve 15 µg/mL tetrasiklin içeren üzerine gelen istenen RNAi içeren E. coli suşları dışarı çizgi. Plakayı 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- Seçin ve istenen RNAi zorlanma izole bir koloni 50 µg/mL carbenicillin ile desteklenmiş lb 2 mL içeren steril 15 mL konik tüpler içine aşılamak. Tüpler için bir orbital shaker 150 rpm'de 16 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- Ertesi gün, gece yetiştirilen kültür 65 mm x 15 mm NGM RNAi besleme plakaları steril bir ayırıcı kullanarak üzerine 150 µL yayıldı. Plakayı 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
- RT için kuluçka 37 ° C'de sonra soğuması plakaları izin NGM plakaları besleme RNAi M9W için E. coli (solucanlar adımları yaş zaman uyumlu nüfus elde edilen) ~ 200 L1 larva içeren uygun bir hacmi seribaşı ekleyin. Larvalar L4 sahne (~2.5 gün) ulaşana kadar 20 ° C'de plakaları kuluçkaya.
6. hazırlanması Mitis grubu Streptokok enfeksiyonu için
- Streptokok istenen suşları senin agar 100 mm x 15 mm üzerinde çizgi (tabak 4 ° C'de depolanmış, 37 ° c plaka ilgili suşları çizgiler önce önceden sıcak), 37 ° c gece (~ 18 h) levhalar da mikroaerofilik tr sağlayan bir mum kavanoza kuluçkaya vironment (çizgili kaplamalar haftada 4 ° C'de depolanabilir) streptokoklara büyümesi için.
- Streptokok klinik yalıtır yaymak için tryptic soya kan agar kullanın. Plakayı 37 ° c (~ 18 h) mum kavanozda gecede kuluçkaya.
- Ertesi gün, tabakları mum kavanozdan kaldırmak ve izole kolonileri bir kısır döngü kullanarak seçin. Senin suyu 2 mL içeren 15 mL steril konik tüpler aşılamak. Streptokok klinik yalıtır yaymak için THY ek suyu koyun kan % 5 v/v ile. Sıkı Kapaklar kapatın ve tüpler statik koşullarda 37 ° C'de kuluçkaya.
7. hayatta kalma deneyleri
Not: Bu tahlil adımlar şekil 1' de tasvir edilmektedir. H2O2 mitis tarafından türetilmiş göstermek için Grup solucan öldürülmesi için sorumludur, medya katalaz veya mutant suşu ΔspxB ile ek ve tamamlayıcı zorlanma ΔspxB; spxB + S. gordonii , paylaşabileceğiniz var olmak kullanılmış. SpxB H2O2 mitis grubunda üretim için sorumlu olduğu pyruvate oksidaz için kodlar.
- 35 mm x 10 mm önceden sıcak senin plakaları ile 37 ° c Streptokok istenen suşlarının gecelik yetişkin kültürlerin 80 µL ekleyin ve bakteri tamamen steril bir ayırıcı kullanarak agar yüzeyi boyunca yayıldı. Plakayı 37 ° c (~ 18 h) mum kavanozda gecede kuluçkaya. Bir denetim olarak 80 µL E. coli OP50 gecede yetiştirilen kültür ile tohum iki 35 mm x 10 mm NGM plakalar. Plakayı 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
- Mitis grubu tarafından üretilen H2O2 solucanlar öldürülmesi için sorumlu olduğunu doğrulamak için 50 µL katalaz c THY üzerine 1000 parça içeren eklemek plaka. Steril bir ayırıcı kullanarak katalaz çözüm yaymak ve laminar akışı 30 dk. tohum 7.1 adımda anlatıldığı gibi bundan sonra ilgili streptokok suşları ile plakalar için Kuru plakalara sağlar.
- Ertesi gün, tabakları mum kavanozdan kaldırmak ve izin RT için 10-15 dk. için steril bir solucan kullanarak soğutmak için plakaları almak, transfer 30 L4 larva NGM veya NGM RNAi plakaları için streptokok besleme senin plaka numaralı seribaşı. Kullanım iki numaralı seribaşı senin pilakalar ve Streptokok suşu başına 60 solucanlar toplam. 25 ° C'de plakaları kuluçkaya
- Diseksiyon mikroskop kullanarak, canlı ve ölü L4 larva birkaç timepoints her plaka üzerinde saymak. Başlangıçta, ölü gibi solucanlar Puan edinildi veya her 30 dk live. Solucanlar hızla ölmek başlattığınızda, bundan sonra onları 15 dk aralıklarla puan. Steril solucan çekme yavaşça solucanlar eşya ve ölü ya da diri olup olmadığını belirlemek için kullanın. Hiçbir hareket dürtmeye karşılık ise bir solucan ölü kabul edilir.
- Tahlil tamamlamak için 5-6 saat sürer. İki kez daha denemeyi tekrarlamak. Tahlil tamamlanmasından sonra iki tabak verilerden havuz. Her grubun veri girişi, hayatta kalma eğrileri karşılaştırın ve Kaplan-Meier Sağkalım analizi istatistiksel yazılım kullanarak gerçekleştirin.
8. mikroskopi için özel yastıkları hazırlanması
- % 2 w/v özel deiyonize su ile çözüm bir mikrodalga Isıtma tarafından çözülür. 5 mL çözeltisi hacmi 20 slayt hazırlamak yeterlidir.
- Laboratuvar bant boyuna iki cam slayt boyunca sopa. Bu özel yastıkları kalınlığını belirler. Temiz cam slayt iki bantlanmış slaytlar arasına yerleştirin.
- Temiz slayt ortasına erimiş özel yer 100 µL. Hemen başka bir temiz bardak erimiş özel üstüne yerleştirin ve hafifçe aşağı bir yastık yapmak için tuşuna basın. Kuvvetlendirmek ve daha sonra üst slayt kaldırmak özel izin. Özel yastık kullanıma hazırdır.
9. SKN-1 yerelleştirme yanıt streptokok enfeksiyonu olarak gözlenmesi
Not: Bu tahlil adımlar Şekil 2' de tasvir edilmektedir. Yerelleştirme SKN-1 SKN-1B/C::GFP transgenik solucan zorlanma kullanarak tespit edilmiştir. Yerelleştirme (WT) SKN-1 H2O2 mitis grup, vahşi-türü tarafından üretimi nedeniyle, ΔspxB ve tamamlayıcı zorlanma ΔspxB; spxB + S. gordonii , göstermek için kullanılmıştır. Ayrıca, transgenik muhabir zorlanma SKN-1B/C::GFP ve RNAi girişim teknik bileşenleri p38 MAPK yolun SKN-1 lokalizasyonu düzenleyen göstermek için kullanılmıştır.
- 35 mm x 10 mm önceden sıcak senin plakaları ile 37 ° c Streptokok istenen suşlarının gecelik yetişkin kültürlerin 80 µL ekleyin ve bakteri tamamen steril bir ayırıcı kullanarak agar yüzeyi boyunca yayıldı. Plakayı 37 ° c (~ 18 h) mum kavanozda gecede kuluçkaya. Bir denetim olarak 80 µL E. coli OP50 gecede yetiştirilen kültür ile tohum üç 35 mm x 10 mm NGM plakalar. Bu tabakları 37 ° c ~ 18 h için kuluçkaya.
- Ertesi gün, tabak mum kavanozdan kaldırmak ve plakaları için 10-15 dk. yıkama L4 larva M9W NGM üzerinden kullanarak RT için serin ve NGM RNAi besleme tabak sağlar. 15 mL konik tüpler de solucan toplamak.
- Tüpler, 450 x g 1 dk. Decant süpernatant spin ve M9W 10 mL ekleyin.
- 9,3 üç kez daha yineleyin.
- Solucanlar M9W ~ 250 µL içinde resuspend ve yer üç 5 µL damla solucan süspansiyon üzerine temiz bir petri kapak ve solucanlar bir diseksiyon mikroskop kullanarak µL başına sayısı tahmin ediyoruz.
- ~ 100 L4 larva her senin streptokok tohumlari ve seribaşı NGM E. coli plakaları ekleyin. Bakteri türünün başına üç tabak kullanın. Plakalar için 2-3 h 25 ° C'de kuluçkaya
- Bundan sonra tabakları da kuluçka kaldırmak, M9W ile yıka ve 15 mL konik tüpler de solucan toplamak.
- Solucanlar 3 yıkama x açıklandığı gibi adımlar 9.3.
- Aspirasyon tarafından M9W çoğunu kaldırın ve solucan Pelet M9W içeren 2 mM sodyum azid veya 2 mM tetramisole hidroklorid 500 µL ekleyin. Bu hareket yok ne zaman mikroskop altında görüntüsü oluşur sağlanması solucanlar, anestezi.
Uyarı: Kişisel koruyucu donanım (PPE) sodyum azid işlerken kullanın. Kimyasal bir başlık altında azid çözüm hazırlamak. - RT, solucan granül 15dk için kuluçkaya. O zaman, nokta 15 µL üzerine hazırlanan özel yastık solucan süspansiyon. Yavaşça No 1.5 coverslip imzalat solucan içeren özel yastık yerleştirin.
- Floresan mikroskop kullanarak, filtreler FITC ve DAPI SKN-1 kullanan yerelleştirme görselleştirin. 10 x ve 20 x büyütme resim solucanlar.
- Yerelleştirme SKN-1 düzeyine göre solucanlar puan. Hiçbir nükleer yerelleştirme, SKN-1B/C::GFP anterior veya posterior solucanın lokalizasyonu ve SKN-1B/C::GFP tüm bağırsak hücreleri içinde nükleer yerelleştirme düşük, orta ve yüksek düzeyde yerelleştirme, anılan sıraya göre kategorize edilir.
- Floresan Filmler puanlama sonra chi-kare ve istatistiksel yazılım kullanarak Fisher'in kesin testleri tarafından istatistiksel farkları belirlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
S. mitisgrubunun üyeleri mitis, S. Oraliş ve S. gordonii hızla solucanlar, S. mutans çoğunlukla, S. salivarius, ve patojenik olmayan E. coli öldürdü OP50 (şekil 3A). S. mitis, S. Oraliş ve S. gordonii için medyan sağkalım 300 dk, 300 dk ve 345 min, sırasıyla yapıldı. Öldürme H2O2tarafından aracılı eğer belirlemek için katalaz senin agar takviye. Solucanlar öldürülmesi katalaz (şekil 3B) huzurunda kaldırıldı. Daha fazla streptokok türetilmiş H2O2 öldürme solucanlar, hayatta kalma ΔspxB mutant suşu, WT zorlanma ve tamamlayıcı zorlanma ΔspxB; spxB + S. gordonii , aracılı olup olmadığını onaylamak için analiz edildi. Ölüm solucan değil vahşi türüne göre ΔspxB mutant suşu üzerinde gözlenen ve tamamlayıcı suşları (şekil 3C). Bu verileri mitis grubu tarafından üretilen H2O2 solucanlar öldürülmesi aracılık eder göstermektedir. Solucanlar kanser hastaları (şekil 3D) kandan elde edilen mitis grubu streptokok klinik yalıtır sinin ne zaman biz de benzer öldürme Kinetik gözlenen. Verilere göre mitis grubu streptokok tarafından üretilen H2O2 neden patojenitesi değerlendirildi.
Streptokok enfeksiyonlarına karşı gerekli olan ana bilgisayar genlerin tanımlamak için skn-1 , hangi oksidatif stres yanıt transkripsiyon faktörü için kodlar yere serdi C. elegans. O zaman, hayatta kalma vektör kontrol tedavi solucanlar göre karşılaştırıldı. Vektör kontrol tedavi worms (şekil 4A) göre skn-1 devirme solucanlar yaşama önemli bir azalma gözlendi. Bu veriler daha fazla skn-1 mutant suşu kullanarak doğrulandı ve onun hayatta kalma N2 vahşi tipi solucanlar kıyasla. Biz benzer bir öldürme fenotip skn-1 mutant olarak skn-1 nakavt ile görülen SKN-1 solucanlar mitis grubu (şekil 4B) üzerinde yaşama etkisinde gösteren gözlenen.
Daha sonra bu H2O2 de solucan SKN-1B/C::GFP lokalizasyonu neden mitis grubu tarafından üretilen belirlendi. SKN-1B/C::GFP lokalizasyonu vahşi tipi ve tamamlayıcı lekeleri ve değil içinde yanıt-e doğru ΔspxB mutant suşu gordonii S. (şekil 5A, B) maruz solucanlar gözlendi. Ayrıca, SKN-1 aktivasyonu belirlemek için bileşenleri p38 MAPK yolun yere serdi. SKN-1B/C::GFP azaltılmış Yerelleştirme nsy-1, sek-1, pmk-1 ve 1 skn devirme solucanlar vektör kontrol tedavi solucanlar göreli olarak gözlendi. Veri MAPK SKN-1 etkinleştirme mitis grubu (şekil 5C, D) tarafından üretilen H2O2 yanıt için gereklidir p38 öneriyor.
Resim 1 : Hayatta kalma deneyleri hazırlanmasında ilgili adımları gösteren Akış şeması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : SKN-1 yerelleştirme enfeksiyon sırasında katılan adımlar gösteren Akış şeması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : H2O2- C. elegans öldürme mitis grubu streptokok tarafından aracılı. Kaplan-Meier hayatta kalma eğrileri(a) S. gordonii, S. Oraliş, S. mitis, S. salivarius, S. mutans çoğunlukla ve E. coli OP50 maruz L4 larvaları. (B) S. gordonii, S. Oraliş, S. mitis, S. salivarius, S. mutans çoğunlukla ve E. coli OP50 senin plakaları 1000 U katalaz huzurunda. (C) S. gordonii WT, ΔspxB mutant ve ΔspxB; spxB + N2 L4 larva üzerinde suşları tamamlıyor. (D) S. oralis (VGS #3), S. oralis (VGS #4), S. mitis (VGS #10), S. mitis (VGS #13) ve E. coli OP50. Deneyler temsilcisi bilgilerse iki tekrarlanan veya daha fazla kez = n ile her koşul için 60 solucanlar. Kaplan-Meier log rank analiz hayatta kalma eğrileri karşılaştırmak ve medyan sağkalım hesaplamak için kullanıldı. İstatistiksel olarak anlamlı olmak olarak kabul < 0,05 P değerleri. Bu şekil değiştiren ve izni15ile uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : SKN-1 solucanlar üzerinde hayatta kalmak için gerekli S. gordonii. (A)hayatta kalma tedavi vektör kontrolü ve skn-1 devirme solucanlar S. gordoniiiçin maruz. N2 (B) hayatta kalma ve skn-1(zu67) mutant solucanlar S. gordoniiüzerinde beslenir. Deneyler temsilcisi bilgilerse iki tekrarlanan veya daha fazla kez = n ile her koşul için 60 solucanlar. Kaplan-Meier log rank analiz hayatta kalma eğrileri karşılaştırmak ve medyan sağkalım hesaplamak için kullanıldı. İstatistiksel olarak anlamlı olmak olarak kabul < 0,05 P değerleri. Bu şekil değiştiren ve izni15ile uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Streptokok H2O2 aracılı etkinleştirme SKN-1 p38 MAPK yolu üzerinde bağımlı. (A)temsilcisi görüntüleri SKN-1B/C::GFP lokalizasyonu WT, ΔspxB mutant ve ΔspxB; spxB + tamamlayıcı S. gordoniisuşları maruz solucanlar. Yakın çekimler her görüntünün üst sağ köşe kısımlarda gösterilir. Ölçek çubuğu = 100 µm. (B) nükleer SKN-1B/C::GFP lokalizasyonu ve solucanlar yüzdesi derecesini WT, ΔspxB mutant ve ΔspxB; spxB + tamamlayıcı S. gordoniisuşları beslenen her kategoride. Önemli ölçüde SKN-1B/C::GFP nükleer yerelleştirme seviyesinin düşük WT ve ΔspxB; spxB + tamamlayıcı suşları S. gordoniiiçin karşılaştırıldığında ΔspxB mutant (p < 0.0001) olarak tespit edildi. SKN-1B/C::GFP Yerelleştirme nsy-1, sek-1, pmk-1, skn-1 nakavt ve vektör kontrolü (C) temsilcisi görüntülerini S. gordoniisolucanlar tedavi. Yakın çekimler her görüntünün üst sağ köşe kısımlarda gösterilir. Ölçek çubuğu 100 µm. = (D) SKN-1B/C::GFP nükleer yerelleştirme derecesini ve solucanlar her kategoride yüzdesi beslenen nsy-1, sek-1, pmk-1, skn-1 nakavt ve tedavi vektör kontrolü S. gordoniisolucanlar. SKN-1B/C::GFP nükleer yerelleştirme seviyesinin düşük önemli ölçüde gözlendi nsy-1 (p < 0,01), sek-1 (p < 0.001), pmk-1 (p < 0.0001), vector öğesine göreve skn-1 nakavt (p < 0.0001) denetimi S. gordoniisolucanlar değerlendirilmesi. Büyüktür 100 solucanlar her zorlanma için maruz görüntüsü ve deneme üç kez tekrarlandı. Bu şekil değiştiren ve izni15ile uyarlanmış. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan yöntemleri de üreten anaerobik altında yetiştirilen H2O2 Enterococcus faeciumgibi diğer Patojen bakteriler için kullanılabilir ya da mikroaerofilik koşulları26. Genellikle, en patojenik organizmalar için bu hafta için hayatta kalma deneyleri tamamlamak için birkaç gün sürer. Ancak, H2O2 mitis grubunun üyeleri tarafından sağlam üretim nedeniyle, bu deneyleri içinde 5-6 h açıklanan koşullar altında tamamlanamadı. Bu ekran bir kısa süre boyunca çeşitli gen adaylar ana bilgisayar bağışıklık dahil ve oksidatif stres tepkisi yeteneği sağlar.
Bu protokol için H2O2 bakteriler tarafından üretilen çeşitli engelleri aşıyorlar eksojen ROS kaynaklarının aksine solucanın bağırsak hücreleri ile doğrudan temas olduğunu. Bu H2O2 bağırsak hücreleri teslim sağlar; Bu nedenle, daha sağlam bir öldürme yanıt belgili tanımlık kurt görülmektedir. Fluorescently etiketli bakteri kullanarak, bu solucanlar için bağırsak15tam kolonizasyon için 30 dk patojenlere maruz gerekir belirlendi. Bu 1 haftalık çizgi plakaları streptokok suşların daha az onların canlılık ve H2O2üretmek için yetenek sağlamak için kullanmak tavsiye edilir. Buna ek olarak, streptokoksik suşları H2O en iyi üretim için da mikroaerofilik koşullarında yetiştirilen gerekir2. L4 larva veya 1 gün eski yetişkin bu tahlil için kullanılabilir. Tüm solucanlar bir deneyde kullanılan aynı yaş ve cinsiyet olduğunu çok önemlidir. Genç kurt daha yavaş ile karşılaştırıldığında büyük hünsa ölmek eğilimindedir. Onların gelişmekte olan vulva, vücudun geri kalanıyla tezat açık bir düzeltme eki olarak orta gövde görünür çünkü L4 hayvanlar daha kolay ayırt edilirler. Yok E. coli OP50 numaralı seribaşı streptokok tabak transfer önemlidir. E. coli ile plakalar öldürme kirlenme zayıflama veya solucanların öldürmekten ‹ptal neden olabilir. Kirlenmesini önlemek için solucanlar E. coli çim uzak almak gereklidir. Ne zaman hayatta kalma deneyleri puanlama, pompalama, baş ve vücut hareketleri davranışını yiyecek arama faringeal gözlemlemek için tavsiye edilir. Solucan ölü olduğundan emin olmak için yavaşça burun, vücut veya kuyruk kenarına eşya ve uygulamaları herhangi bir hareket önerilir.
RNAi besleme ve solucanlar mitis grup üzerinde yaşama H2O2karşı savunma söz konusu adaylarını tanımlamak için kombine. Solucan H2O2 yanıt olarak yaşama için bu kodlar için bir oksidatif stres yanıt transkripsiyon faktörü, onun gereksinimi gen skn-1 ' i kullanarak aşağıda gösterildiği. Bu nedenle, bu tahlil çeşitli genler için ekran için adapte olmak ve potansiyel adaylar oksidatif stres tepkisi ve dokunulmazlık için gerekli tanımlar. RNAi kurtlardan besleme yaş L1 larva E. coli çimenler ifade RNAi için senkronize ekleyerek elde edilir. Solucan eşitleme iletişim kuralı sırasında çamaşır suyu ve sodyum hidroksit huzurunda solucan cuticles lizis izlemek için önemlidir. Embriyo kısmen kalın yumurta kabuğu tarafından korunmaktadır süre yetişkin ve larva kütikül sürekli eriyecektir. Ancak, blead sodyum hidroksit karışımı huzurunda uzun süreli inkübasyon embriyo ölüme neden olabilir. Bu nedenle, belirli aralıklarla beyazlatma sırasında diseksiyon mikroskop altında solucan içeren tüp gözlemlemek önemlidir. Bir adım daha eşitleme kuralında dikkate almak tutuklandı L1 larva korumaktır. Tutuklanan larva tüp rotator oda sıcaklığında 5 gün muhafaza edilebilir. Bu larvalar tarama sonra 1-2 gün içinde RNAi beslenmesi için kullanmak için tavsiye edilir. Uzun süreli bakım M9W dauer sahne oluşumuna neden.
Son olarak, SKN-1 GFP için erimiş ifade transgenik solucan mitis grup huzurunda oksidatif stres yanıtının harekete geçirmek izlemek için kullanıldı. RNAi tarafından gösterilen p38 MAPK bileşenler SKN-1B/C::GFP yerelleştirme bağırsak hücreleri çekirdekleri için gereklidir. SKN-1B/C::GFP, yerelleştirme gözlemlemek için bu zorlanma L3 veya L4 aşamaları olarak yerelleştirme SKN-1 Yetişkin aşamasında azaltmak eğilimi kullanmak önemlidir. SKN-1B/C::GFP lokalizasyonu daha iyi gözlemlemek için bu FITC ve DAPI filtre ayarlarını kullanarak elde edilen görüntüleri örtüşmesi için tavsiye edilir. Autofluorescence tarafından oluşturulan lipofuscins kontrast solucan SKN-1 yerelleşme gözlenmesi için sağlamak. Ancak, aynı zamanda sinyal zayıf ifade GFP gazetecilere gelen solucan gut çeşitli kaynaklar tarafından yayılan autofluorescence tarafından maskeli gösterilmiştir. Autofluorescence yaş ile artırmak için gösterilmiştir ve yüksek bağırsak ve rahim C. elegans27. Bu sorunun üstesinden gelmek için bir üçlü grup GFP filtre kurulumu SKN-1B/C::GFP Yerelleştirme C. elegans28içinde izlemek için yapılan bir çalışmada kullanılmıştır. Bu kurulum GFP sinyal GFP ve autofluoresence yeşil ve sarı kanallarında sırasıyla görüntüleme autofluoresence ayırır.
C. elegans bu protokol için ana bilgisayar-patojen etkileşimleri çalışma ve nasıl mitis grubu tarafından üretilen H2O2 patojen nedenleri tespit için kullanılır. Daha da önemlisi, bu modeli kullanarak, endoplasmic Retiküler stres, mitokondrial hasar, mitophagy, autophagy ve oksidatif stres H2O2 etkileri ele. Ayrıca, hangi tarafından H2O2 bağışıklık yanıtı hücrenin çekirdek işlemleri kesintiye tarafından temin için virülans faktörü gibi davranır mekanizmaları tespit edilebilir. Bu nedenle, bu solucan ana bilgisayar-patojen etkileşimler yeni görüşler keşfetmek için güçlü modeli sistem olarak tanınıyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Biz Dr Bing-Yan Wang, Dr Gena Tribble (University of Texas, diş hekimliği Okulu), teşekkür Dr Richard Lamont (Louisville Üniversitesi, diş hekimliği Okulu) ve Dr. Samuel laboratuar ve klinik suşları sağlamak için Shelburne (MD Anderson Kanser Merkezi) mitis grubu Streptokok. Ayrıca Dr. Keith Blackwell (genetik bölümü, Harvard Tıp Okulu) C. elegans suşları için teşekkür ediyoruz. Son olarak, biz Dr Danielle Garsin ve onun lab (University of Texas, McGovern Tıp Fakültesi) reaktifler ve solucan suşları çalışma yapmak için verdiğiniz için teşekkür ederiz. Bazı solucan suşları NIH ofisi araştırma altyapı programları (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından temin edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Media and chemicals | |||
| Agarose | Sigma Aldrich | A9539-50G | |
| Bacto peptone | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Bacto Todd Hewitt Broth | Fisher Scientific | DF0492-17-6 | |
| BD BBL Sheep Blood, Defibrinated | Fisher Scientific | B11947 | |
| BD Difco Agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB Broth | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| Blood agar (TSA with Sheep Blood) | Fisher Scientific | R01200 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C1345-1G | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| IPTG | Fisher Scientific | MP21021012 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Nystatin | Acros organics | AC455500050 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| Sodium Azide | Sigma Aldrich | S2002-25G | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% Sodium Hypochlorite | |||
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| Tetracyclin | Sigma Aldrich | 87128-25G | |
| (−)-Tetramisole hydrochloride | Sigma Aldrich | L9756 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Consumables | |||
| 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25 mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid (35 mm x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
| No. 1.5 18 mm x 18 mm Cover Slips | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Petri Dish with Clear Lid (60 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Plain Glass Microscope Slides (75 mm x 25 mm) | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| Software | |||
| Prism | Graphpad | ||
| Bacterial Strains | |||
| S. oralis ATCC 35037 | |||
| S. mitis ATCC 49456 | |||
| S. gordonii DL1 Challis | |||
| E. coli OP50 | |||
| E. coli HT115 | |||
| Worm Strains | |||
| Strain | Genotype | Transgene | Source |
| N2 | C. elegans wild isolate | CGC | |
| EU1 | skn-1(zu67) IV/nT1 [unc-?(n754) let-?] (IV;V) | CGC | |
| LD002 | IdIs1 | SKN-1B/C::GFP + rol-6(su1006) | Keith Blackwell |
References
- Human Microbiome Project, C. Structure, function and diversity of the healthy human microbiome. Nature. 486 (7402), 207-214 (2012).
- Mitchell, J. Streptococcus mitis: walking the line between commensalism and pathogenesis. Molecular Oral Microbiology. 26 (2), 89-98 (2011).
- Dyson, C., Barnes, R. A., Harrison, G. A. Infective endocarditis: an epidemiological review of 128 episodes. Journal of Infection. 38 (2), 87-93 (1999).
- Sahasrabhojane, P., et al. Species-level assessment of the molecular basis of fluoroquinolone resistance among viridans group streptococci causing bacteraemia in cancer patients. International Journal of Antimicrobial Agents. 43 (6), 558-562 (2014).
- Shelburne, S. A., et al. Streptococcus mitis strains causing severe clinical disease in cancer patients. Emerging Infectious Diseases. 20 (5), 762-771 (2014).
- van der Meer, J. T., et al. Distribution, antibiotic susceptibility and tolerance of bacterial isolates in culture-positive cases of endocarditis in The Netherlands. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (9), 728-734 (1991).
- Han, X. Y., Kamana, M., Rolston, K. V. Viridans streptococci isolated by culture from blood of cancer patients: clinical and microbiologic analysis of 50 cases. Journal of Clinical Microbiology. 44 (1), 160-165 (2006).
- Hoshino, T., Fujiwara, T., Kilian, M. Use of phylogenetic and phenotypic analyses to identify nonhemolytic streptococci isolated from bacteremic patients. Journal of Clinical Microbiology. 43 (12), 6073-6085 (2005).
- Kohno, K., et al. Infectious complications in patients receiving autologous CD34-selected hematopoietic stem cell transplantation for severe autoimmune diseases. Transplant Infectious Disease. 11 (4), 318-323 (2009).
- Zhu, L., Kreth, J. The role of hydrogen peroxide in environmental adaptation of oral microbial communities. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. , 717843 (2012).
- Okahashi, N., et al. Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One. 9 (1), 88136 (2014).
- Stinson, M. W., Alder, S., Kumar, S. Invasion and killing of human endothelial cells by viridans group streptococci. Infection and Immunity. 71 (5), 2365-2372 (2003).
- Rai, P., et al. Streptococcus pneumoniae secretes hydrogen peroxide leading to DNA damage and apoptosis in lung cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (26), 3421-3430 (2015).
- Braun, J. S., et al. Pneumococcal pneumolysin and H(2)O(2) mediate brain cell apoptosis during meningitis. Journal of Clinical Investigation. 109 (2), 19-27 (2002).
- Naji, A., et al. The activation of the oxidative stress response transcription factor SKN-1 in Caenorhabditis elegans by mitis group streptococci. PLoS One. 13 (8), 0202233 (2018).
- Bolm, M., Jansen, W. T., Schnabel, R., Chhatwal, G. S. Hydrogen peroxide-mediated killing of Caenorhabditis elegans: a common feature of different streptococcal species. Infection and Immunity. 72 (2), 1192-1194 (2004).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M. The worm has turned--microbial virulence modeled in Caenorhabditis elegans. Trends in Microbiology. 13 (3), 119-127 (2005).
- Irazoqui, J. E., Ausubel, F. M. 99th Dahlem conference on infection, inflammation and chronic inflammatory disorders: Caenorhabditis elegans as a model to study tissues involved in host immunity and microbial pathogenesis. Clinical & Experimental Immunology. 160 (1), 48-57 (2010).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Reactive Oxygen Species and Aging in Caenorhabditis elegans: Causal or Casual Relationship. Antioxidants & Redox Signaling. 13 (12), 1911-1953 (2010).
- Tissenbaum, H. A. Using C. elegans for aging research. Invertebrate Reproduction & Development. 59, Sup 1 59-63 (2015).
- Blackwell, T. K., Steinbaugh, M. J., Hourihan, J. M., Ewald, C. Y., Isik, M. SKN-1/Nrf, stress responses, and aging in Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology & Medicine. 88, Pt B 290-301 (2015).
- Irazoqui, J. E., Urbach, J. M., Ausubel, F. M. Evolution of host innate defence: insights from Caenorhabditis elegans and primitive invertebrates. Nature Reviews Immunology. 10 (1), 47-58 (2010).
- Park, S. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8 (3), 258-269 (2009).
- An, J. H., et al. Regulation of the Caenorhabditis elegans oxidative stress defense protein SKN-1 by glycogen synthase kinase-3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (45), 16275-16280 (2005).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes & Development. 17 (15), 1882-1893 (2003).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infection and Immunity. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Pincus, Z., Mazer, T. C., Slack, F. J. Autofluorescence as a measure of senescence in C. elegans: look to red, not blue or green. Aging (Albany NY). 8 (5), 889-898 (2016).
- Teuscher, A. C., Ewald, C. Y. Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8 (14), (2018).
