Måling af enzymatisk stabilitet af isotermisk titrering kalorimetri
Summary
Den termiske stabilitet af enzymaktiviteten måles let af isotermisk titrering kalorimetri (ITC). De fleste protein stabilitet assays i øjeblikket anvendes foranstaltning protein udspiller sig, men give ikke oplysninger om enzymatisk aktivitet. ITC muliggør direkte bestemmelse af effekten af enzymet ændringer på stabiliteten af enzymaktiviteten.
Abstract
Dette arbejde viser en ny metode til måling af enzymaktiviteten stabilitet af isotermisk titrering kalorimetri (ITC). Peak varme sats observeret efter en enkelt injektion substratopløsning i et enzym løsning er korreleret med enzymaktivitet. Flere injektioner af underlaget i det samme enzym løsning over tid viser tabet af enzymaktiviteten. Analysen er autonome, der kræver meget lidt personale tid, og er gældende for de fleste medier og enzymer.
Introduction
Enzymer er proteiner i stand til at katalysere en lang række organiske reaktioner. De fleste enzymer funktion i vandig opløsning på nær neutral pH dermed undgå brugen af skrappe opløsningsmidler. På grund af deres høje selektivitet, enzym katalyserede reaktioner producere færre (i nogle tilfælde ingen biprodukter) biprodukter end non-selektive katalysatorer såsom syrer og baser1. Dette er især relevant i food manufacturing, hvor alle kemiske reaktioner skal gøres, så det endelige produkt er sikkert til konsum. I øjeblikket, bruges enzymer til at producere høj fruktose majssirup2, ost3, øl4, Laktosefri mælk5og andre vigtige fødevarer. Mens dette papir fokuserer på enzymet brug inden for levnedsmiddelindustrien, er der mange andre anvendelser for enzymer herunder i grøn kemi og narkotika syntese.
Nytten af enzymer er begrænset af stabiliteten af enzymaktiviteten, som afhænger af opretholde den tre-dimensionelle struktur af enzymet. Enzymets struktur kan være stabiliseret med ændringer, såsom PEGylation6, immobilisering på en solid støtte7, genetiske modifikationer8og formuleringer. I øjeblikket, enzym stabiliteten måles typisk ved differential scanning kalorimetri (DSC) og slutpunktet enzymaktivitet undersøgelser vedrørende9. DSC måler temperaturen på som et enzym udfolder; jo højere temperatur, jo mere stabil struktur. Men tabet af aktivitet ofte opstår ved en lavere temperatur end skal udfolde enzym eller domæner inden for enzymet10. DSC er derfor ikke tilstrækkeligt til at bestemme, om en enzym ændring øger stabiliteten af enzymaktiviteten. Slutpunkt enzym-assays er normalt tid intensive, kræver flere prøver, og ofte indebærer en koblede colorimetrisk reaktion, der ikke gælder for stærkt farvede eller uigennemsigtig løsninger eller suspensioner.
Dette arbejde viser en metode til direkte måling af enzymaktiviteten stabilitet af isotermisk titrering kalorimetri (ITC). ITC måler hastigheden på varme frigivet eller absorberes i løbet af en reaktion. Da næsten alle reaktioner producere eller absorbere varme, kan ITC bruges til de fleste enzym-katalyserede reaktioner, herunder reaktioner, som ikke har en koblede reaktion eller forekomme i uigennemsigtig medier såsom mælk. ITC har været brugt i mange årtier for at måle kemiske kinetiske parametre til mange former for reaktioner, men protokollen præsenteres her fokuserer på brug af ITC skal måle peak varme sats på enzym-katalyserede reaktioner og demonstrerer, enzymaktivitet er lineært korreleret med peak varme rate. ITC målinger af peak varme priser er for det meste selvstændige og kræver meget lidt personale tid til opsætning og analysere.
Protocol
Representative Results
Discussion
En stor fordel af ITC enzym stabilitet analysen beskrevet her er automatisering. Når alle de relevante buffere og løsninger er lavet, er set-up tid hvert assay ca. 15 min. til den person, der udfører analysen. I modsætning, de konventionelle assays til invertase og lactase aktivitet kræver ca 2 h med løbende inddragelse af den person, der udfører analysen og mange enzymaktivitet assays tage betydeligt flere mandetimer. I en tidligere publikation, har vi vist, hvordan data fra ITC metode sammenlignes med en mere tr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ingen
Materials
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
References
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
- Budak, &. #. 3. 5. 0. ;. &. #. 2. 1. 4. ;., Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. . Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
- van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
- Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
- Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
- Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
- Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501 (2018).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
- Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
- Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
- Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).
