मापने एंजाइमी स्थिरता समतापी टाइट्रेट कैलोरीमिति द्वारा
Summary
एंजाइम गतिविधि के थर्मल स्थिरता आसानी से समतापी अनुमापन कैलोरीमिति (आईटीसी) द्वारा मापा जाता है । अधिकांश प्रोटीन स्थिरता assays वर्तमान में इस्तेमाल किया माप प्रोटीन का खुलासा है, लेकिन एंजाइमी गतिविधि के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते । आईटीसी एंजाइम गतिविधि की स्थिरता पर एंजाइम संशोधनों के प्रभाव के प्रत्यक्ष निर्धारण में सक्षम बनाता है ।
Abstract
यह काम समतापी अनुमापन कैलोरीमिति (आईटीसी) द्वारा एंजाइम गतिविधि की स्थिरता को मापने के लिए एक नई विधि को दर्शाता है । एक एंजाइम समाधान में सब्सट्रेट समाधान के एक इंजेक्शन के बाद देखा पीक हीट दर एंजाइम गतिविधि के साथ सहसंबद्ध है । समय के साथ एक ही एंजाइम समाधान में सब्सट्रेट के एकाधिक इंजेक्शन एंजाइम गतिविधि के नुकसान को दर्शाते हैं । परख स्वायत्त है, बहुत कम कर्मियों समय की आवश्यकता होती है, और सबसे मीडिया और एंजाइमों के लिए लागू है ।
Introduction
एंजाइमों कार्बनिक प्रतिक्रियाओं की एक विस्तृत सरणी उत्प्रेरक के लिए सक्षम प्रोटीन हैं । अधिकांश एंजाइमों के पास तटस्थ पीएच पर जलीय समाधान में समारोह इस प्रकार कठोर सॉल्वैंट्स के उपयोग से परहेज । क्योंकि उनके उच्च चयनशीलता, एंजाइम उत्प्रेरक प्रतिक्रियाओं कम उत्पादन (कुछ मामलों में कोई byproducts) गैर से byproducts-ऐसे एसिड और कुर्सियां1के रूप में चयनात्मक उत्प्रेरक । यह खाद्य निर्माण में विशेष रूप से प्रासंगिक है जहां सभी रासायनिक प्रतिक्रियाओं किया जाना चाहिए ताकि अंतिम उत्पाद मानव उपभोग के लिए सुरक्षित है । वर्तमान में, एंजाइमों उच्च फ्रुक्टोज कॉर्न सिरप2, पनीर3, बियर4, लैक्टोज मुक्त दूध5, और अन्य महत्वपूर्ण खाद्य उत्पादों का उत्पादन करने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि इस पत्र में खाद्य उद्योग में एंजाइम के उपयोग पर ध्यान केंद्रित है, वहां कई अंय एंजाइम के लिए उपयोग करता है सहित हरी रसायन विज्ञान और दवा संश्लेषण में ।
एंजाइमों की उपयोगिता एंजाइम गतिविधि की स्थिरता द्वारा सीमित है, जो एंजाइम की त्रि-आयामी संरचना को बनाए रखने पर निर्भर करता है । एंजाइम संरचना ऐसे PEGylation6के रूप में संशोधनों से स्थिर किया जा सकता है, एक ठोस समर्थन7पर स्थिरीकरण, आनुवंशिक संशोधनों8, और योगों । वर्तमान में, एंजाइम स्थिरता आम तौर पर अंतर स्कैनिंग कैलोरीमिति (DSC) और समापन बिंदु एंजाइम गतिविधि9assays द्वारा मापा जाता है । DSC तापमान जिस पर एक एंजाइम करेंगी उपाय; उच्च तापमान, और अधिक स्थिर संरचना । हालांकि, गतिविधि की हानि अक्सर एंजाइम के भीतर एंजाइम या डोमेन को प्रकट करने के लिए आवश्यकता से कम तापमान पर होता है10. इसलिए, DSC एक एंजाइम संशोधन एंजाइम गतिविधि की स्थिरता बढ़ जाती है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए पर्याप्त नहीं है । समापन बिंदु एंजाइम assays आमतौर पर समय गहन हैं, कई नमूनों की आवश्यकता होती है, और अक्सर एक युग्मित वर्णमिति प्रतिक्रिया है कि उच्च रंग या अपारदर्शी समाधान या निलंबन के लिए लागू नहीं है शामिल हैं ।
यह काम समतापी अनुमापन कैलोरीमिति (आईटीसी) द्वारा एंजाइम गतिविधि की स्थिरता के प्रत्यक्ष माप के लिए एक विधि को दर्शाता है । आईटीसी अभिक्रिया के दौरान जारी या अवशोषित ऊष्मा की दर का मापन करती है । चूंकि लगभग सभी प्रतिक्रियाओं का उत्पादन या गर्मी को अवशोषित, आईटीसी सबसे एंजाइम उत्प्रेरक प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रतिक्रियाओं है कि एक युग्मित प्रतिक्रिया नहीं है या ऐसे दूध के रूप में अपारदर्शी मीडिया में होते हैं, सहित । आईटीसी कई दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है प्रतिक्रियाओं के कई प्रकार के लिए रासायनिक गतिज मापदंडों को मापने के लिए, लेकिन यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल आईटीसी का उपयोग करने के लिए एंजाइम उत्प्रेरक प्रतिक्रियाओं की पीक गर्मी की दर को मापने पर केंद्रित है और यह दर्शाता है कि एंजाइम गतिविधि linearly है शिखर गर्मी की दर के साथ सहसंबद्ध । पीक हीट दरों की आईटीसी माप ज्यादातर स्वायत्त है और सेटअप और विश्लेषण करने के लिए बहुत कम कर्मियों समय की आवश्यकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
आईटीसी एंजाइम स्थिरता परख का एक प्रमुख लाभ यहां वर्णित स्वचालन है । एक बार सभी उपयुक्त बफ़र्स और समाधान बना रहे हैं, प्रत्येक परख के लिए सेट अप समय परख कर व्यक्ति के लिए लगभग 15 मिनट है । इसके विपरीत, invertase औ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
कोई नहीं
Materials
| a-Lactose | Fisher Scientific | unknown (too old) | 500g |
| Sodium Acetate, Anhydrous 99% min | Alfa Aesar | A13184-30 | 250g |
| Lactase | MP Bio | 100780 | 5g |
| Hydrocholric Acid Solution, 1N | Fisher Scientific | SA48-500 | 500mL |
| Benchtop Meter- pH | VWR | 89231-622 | |
| Ethanol 70% | Fisher Scientific | BP8231GAL | 1gallon |
| Micro-90 | Fisher Scientific | NC024628 | 1L (cleaning solution) |
References
- Anastas, P., Eghbali, N. Green chemistry: principles and practice. Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).
- Jin, L. Q., et al. Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup. Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).
- Budak, &. #. 3. 5. 0. ;. &. #. 2. 1. 4. ;., Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. . Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology. , 182-203 (2018).
- van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use. Energy. 115, 519-527 (2016).
- Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk. Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).
- Lawrence, P. B., Price, J. L. How PEGylation influences protein conformational stability. Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).
- Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts. Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).
- Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications. Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501 (2018).
- Johnson, C. M. Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability. Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).
- Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. Transient model of thermal deactivation of enzymes. Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).
- Mason, M., et al. Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes. Jounal of Food Science. , (2017).
- Leksmono, C. S., et al. Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab. Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377 (2018).
