Summary
وتستخدم أجنة سمك الحمار الوحشي لتقييم سمية المركبات الكيميائية. وهي تتطور خارجيا وحساسة للمواد الكيميائية، مما يسمح بالكشف عن التغيرات الفينوتية خفية. تتطلب التجربة فقط كمية صغيرة من المركب، والتي تضاف مباشرة إلى لوحة تحتوي على الأجنة، مما يجعل نظام الاختبار فعالة وفعالة من حيث التكلفة.
Abstract
وسمك الحمار الوحشي هو كائن نموذجي للفقاريات يستخدم على نطاق واسع للمرض واكتشاف المخدرات القائمة على النمط الظاهري. سمك الحمار الوحشي يولد العديد من الذرية، لديه أجنة شفافة والتنمية الخارجية السريعة. وبالتالي، يمكن أيضا استخدام أجنة سمك الحمار الوحشي للتقييم السريع لسمية الأدوية الثمينة والمتاحة بكميات صغيرة. ويرد في هذه المادة وصف لطريقة الفحص الفعال لسمية المركبات الكيميائية باستخدام أجنة ما بعد الإخصاب لمدة تفي بمدة تبعد 1-5 أيام. يتم رصد الأجنة بواسطة مجهر مجسم للتحقيق في العيوب الفينوتية الناجمة عن التعرض لتركيزات مختلفة من المركبات. كما يتم تحديد تركيزات نصف قصوى قاتلة (LC50)من المركبات. تطلبت هذه الدراسة 3-6 ملغ من مركب مثبط، والتجربة بأكملها تستغرق حوالي 8-10 ساعة لإكمالها من قبل فرد في مختبر يحتوي على مرافق أساسية. البروتوكول الحالي مناسب لاختبار أي مركب لتحديد الآثار السمية أو غير المستهدفة التي لا تطاق للمركب في المرحلة المبكرة من اكتشاف المخدرات والكشف عن الآثار السامة الخفية التي قد تفوت في ثقافة الخلية أو غيرها من النماذج الحيوانية. وتقلل هذه الطريقة من التأخيرات الإجرائية وتكاليف تطوير المخدرات.
Introduction
إن تطوير المخدرات عملية مكلفة. قبل أن يتم الموافقة على مجمع كيميائي واحد من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) والوكالة الأوروبية للأدوية (EMA) يتم فحص عدة آلاف من المركبات بتكلفة أكثر من مليار دولار1. خلال التنمية ما قبل السريرية، ومطلوب الجزء الأكبرمن هذه التكلفة لاختبار الحيوان 2. للحد من التكاليف، يحتاج الباحثون في مجال تطوير المخدرات نماذج بديلة لفحص سلامة المركبات الكيميائية3. ولذلك ، في المرحلة المبكرة من تطوير المخدرات ، سيكون من المفيد جدا استخدام طريقة يمكن أن تقيم بسرعة سلامة وسمية المركبات في نموذج مناسب. هناك العديد من البروتوكولات التي تم استخدامها لفحص سمية المركبات الكيميائية التي تنطوي على نماذج زراعة الحيوانات والخلايا ولكنلا يوجد بروتوكول واحد يتم التحقق من صحته وهو في الاستخدام المشترك 4،5. البروتوكولات القائمة باستخدام حمار وحشي تختلف في الطول، وقد استخدمت من قبل الباحثين الفردية الذين قاموا بتقييم السمية وفقا لمتطلبات الراحةالخاصةبهم 6،7،8،9، 10 سنوات , 11 , 12.
في الماضي القريب، ظهرت سمك الحمار الوحشي كنموذج مناسب لتقييم سمية المركبات الكيميائية أثناءالتطور الجنيني 6،7. حمار وحشي لديه العديد من المزايا المضمنة لتقييم المركبات الكيميائية13. حتى التجارب على نطاق واسع قابلة، كما يمكن للأنثى حمار وحشي وضع دفعات من 200-300 البيض، والتي تتطور بسرعة خارج الجسم الحي، لا تحتاج إلى تغذية خارجية لمدة تصل إلى أسبوع وشفافة. يمكن إضافة المركبات مباشرة إلى الماء، حيث يمكن (اعتمادا على طبيعة المجمع) تنتشر من خلال الشيوريون، وبعد الفقس، من خلال الجلد والخياشيم والفم من اليرقات. التجارب لا تتطلب كميات وفيرة من المركبات الكيميائية14 بسبب صغر حجم الجنين. تطوير أجنة حمار وحشي تعبر عن معظم البروتينات اللازمة لتحقيق نتيجة النمو الطبيعي. ولذلك، فإن جنين سمك الحمار الوحشي هو نموذج حساس لتقييم ما إذا كان دواء محتمل يمكن أن يزعج وظيفة البروتين أو جزيء إشارة ذات أهمية التنمية. تصبح أجهزة سمك الحمار الوحشي وظيفية بين 2-5 dpf15، والمركبات التي هي سامة خلال هذه الفترة الحساسة من التطور الجنيني تحفز العيوب الفينوتية في يرقات حمار وحشي. هذه التغييرات phenotypic يمكن الكشف عنها بسهولة باستخدام المجهر بسيطة دون تقنيات الغازية11. وتستخدم على نطاق واسع أجنة حمار وحشي في البحوث السمية بسبب تعقيدها البيولوجي أكبر بكثير بالمقارنة مع فحص المخدرات في المختبر باستخدام نماذج ثقافة الخلايا16،17. كما الفقاريات، والتركيب الوراثي والفيزيولوجي من حمار وحشي قابلة للمقارنة مع البشر، وبالتالي سمية المركبات الكيميائية متشابهة بين حمار وحشي والبشر8،18،19، 20 , 21 , ٢٢- وبالتالي، فإن سمك الحمار الوحشي أداة قيمة في المرحلة الأولى من اكتشاف المخدرات لتقييم سمية وسلامة المركبات الكيميائية.
في هذه المقالة، نقدم وصفا مفصلا للطريقة المستخدمة لتقييم سلامة وسمية مركبات مثبطات الأنهيدراز الكربونية (CA) باستخدام 1-5 أيام بعد الإخصاب (dpf) أجنة حمار وحشي من قبل باحث واحد. ويشمل البروتوكول تعريض أجنة سمك الحمار الوحشي لتركيزات مختلفة من مركبات المثبطات الكيميائية ودراسة الوفيات والتغيرات الفينوتية أثناء التطور الجنيني. في نهاية التعرض للمركبات الكيميائية، يتم تحديد جرعة LC50 من المادة الكيميائية. الطريقة تسمح للفرد لإجراء فحص فعال من 1-5 مركبات الاختبار ويستغرق حوالي 8-10 ساعة اعتماداعلى تجربة الشخص مع الطريقة (الشكل 1). ويرد في الشكل 2بيان لكل خطوة من الخطوات المطلوبة لتقييم سمية المركبات. يتطلب تقييم سمية مثبطات CA 8 أيام، ويشمل إعداد أزواج التزاوج (اليوم 1)؛ جمع الأجنة من خزانات تربية وتنظيفونقلها إلى حاضنة 28.5 درجة مئوية (اليوم 2)؛ توزيع الأجنة في آبار لوحة 24 بئر وإضافة مركبات مثبطات CA المخففة (اليوم 3)؛ تحليل الفينوتيبيك والتصوير من اليرقات (اليوم 4-8)، وتحديد جرعة LC50 (day8). هذه الطريقة سريعة وفعالة، ويتطلب كمية صغيرة من المركب الكيميائي والمرافق الأساسية فقط من المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وللمنشأة الأساسية لسمك الحمار الوحشي في جامعة تامبيري إذن بإنشاء من المجلس الوطني للتجارب الحيوانية (ESAVI/7975/04.10.05/2016). وقد أجريت جميع التجارب باستخدام أجنة سمك الحمار الوحشي وفقا لبروتوكول وحدة الخدمات الإقليمية التابعة لحكومة مقاطعة شرق فنلندا، والإدارة الاجتماعية والصحية لوحدة الخدمات الإقليمية في تامبيري ، رقم LSLH-2007-7254/Ym-23.
1. إعداد من بين عشية وضحاها حمار وحشي التزاوج الدبابات
- مكان 2-5 سمكة حمار وحشي ذكر الكبار و 3-5 حمار وحشي الإناث الكبار في خزانات التزاوج بين عشية وضحاها. (يتم تحريض تربية في الصباح عن طريق دورة الظلام والضوء التلقائي بين عشية وضحاها).
- إعداد العديد من الصلبان للحصول على ما يكفي من الأجنة لتقييم سمية أكثر من اثنين من المركبات الكيميائية. لتقييم السمية، يحتاج كل تركيز إلى ما لا يقل عن 20جنيناً 23.
- لتجنب التعامل مع الإجهاد للالحيوانات، والسماح للالحيوانات للراحة لمدة 2 أسابيع قبل استخدام نفس الأفراد للتربية.
2- جمع الأجنة وإعداد اللوحات للتعرض للمركبات الكيميائية
- جمع الأجنة، في اليوم التالي قبل الظهر، وذلك باستخدام مصفاة شبكة غرامة ونقلها على طبق بيتري يحتوي على E3 الجنين المتوسطة [5.0 ملكلوريد كلوريد كلوريد كلوريد مأكولات، 0.17 مل ككل، 0.33 مليون متر CaCl 2، 0.33 mM MgSO4،و 0.1٪ ث / ف الميثيلين الأزرق].
- إزالة الحطام باستخدام ماصة باستور البلاستيكية (على سبيل المثال، الغذاء والنفايات الصلبة). فحص كل دفعة من الأجنة تحت المجهر المجسم لإزالة الأجنة غير المخصبة / الميتة (التي تم تحديدها من قبل مظهرها غير شفاف).
- الحفاظ على الأجنة عند 28.5 درجة مئوية في حاضنة. فحص الأجنة، في صباح اليوم التالي، تحت مجهر مجسم وإزالة أي أجنة غير صحية أو ميتة. أيضا، استبدال المتوسطة E3 القديمة مع الطازجة E3 المتوسطة.
ملاحظة:يتم دائماً الحفاظ على أجنة سمك الحمار الوحشي عند 28.5 درجة مئوية في الظروف المختبرية. - نقل بعناية 1 جنين في كل بئر من لوحة 24 جيدا تحتوي على ما يكفي من E3 المتوسطة لتغطية الأجنة.
3. الاستعدادات لحل مخزون المركبات الكيميائية وتوزيع المركب المخفف في الآبار
- إخراج القنينات التي تحتوي على مركبات مثبطة المخزنة في 4 درجة مئوية.
ملاحظة:اعتماداً على خصائص المجمع، يتم تخزين هذه في درجات حرارة مختلفة. - وزن المركب (ق) باستخدام التوازن التحليلي الذي يمكن أن تزن بضعة ملليغرام (ملغ) من المجمع بدقة.
- إعداد ما لا يقل عن 250 ميكرولتر (100 مل) من محلول المخزون لكل مركب في مذيب مناسب (مثل الماء E3 أو كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO)، استناداً إلى خصائص القابلية للذوبان في المركبات.
ملاحظة:يمكن القيام بالخطوات المذكورة أعلاه قبل يوم واحد من بدء التجربة في وقت مناسب وتخزينها في 4 درجة مئوية). - جعل التخفيفات التسلسلية لحلول المخزون (على سبيل المثال، 10 ميكرومتر، 20 ميكرومتر، 50 ميكرومتر، 100 ميكرو متر، 150 ميكرو متر، 300 ميكرو متر و 500 ميكرومتر) باستخدام مياه E3 في أنابيب الطرد المركزي 15 مل.
ملاحظة:تختلف تركيزات وعدد التخفيفات التسلسلية من مركب إلى مركب آخر تبعاً لمستويات سميتها. - من 24 لوحة بئر تحتوي على الأجنة، إزالة المياه E3 من الآبار باستخدام ماصة باستور و1 مل ماصة (تحتوي على 1 ديسيبل الأجنة) صف واحد في وقت واحد.
- توزيع 1 مل من كل مخفف في كل بئر (بدءا من أقل والانتقال إلى تركيز أعلى) في الآبار من لوحة 24 جيدا.
- إعداد مجموعة تحكم من نفس المجموعة من الأجنة وإضافة الكمية المقابلة من مخفف.
- تسمية لوحات 24 جيدا مع اسم وتركيز المجمع والحفاظ على لوحات في 28.5 درجة مئوية في حاضنة.
4. التحليل الفينوتي تصوير الأجنة باستخدام مجهر مجسم
- فحص الأجنة تحت مجهر مجسم للمعلمات 24 ساعة بعد التعرض للمركبات الكيميائية.
- لاحظ المعلمات مثل الوفيات، الفقس، ضربات القلب، واستخدام كيس صفار البيض، وتطوير المثانة السباحة، وحركة الأسماك، وذمة التامور، وشكل الجسم23.
- خذ اليرقات المعرضة لكل تركيز من المجمع ووضعها جانبية في طبق بيتري صغير يحتوي على 3٪ عالية الوزن الجزيئي ميثيل السليلوز باستخدام مسبار معدني.
ملاحظة:السليلوز الميثيل 3٪ (الجزيئية العالية مع) هو سائل لزج اللازمة لتضمين الأسماك مع التوجه المطلوب للفحص المجهري. لتوجيه الأسماك في هذا السائل، هناك حاجة إلى مسبار معدني. - التقاط الصور باستخدام مجهر مجسم متصل بكاميرا. حفظ الصور في مجلد منفصل كل يوم حتى نهاية التجربة.
- أدخل كافة الملاحظات في جدول كل يوم إما في جدول عبر إنترنت أو على ورقة مطبوعة.
- إذا كانت المركبات سامة للأعصاب، فإن يرقات 4 إلى 5 ديسيبل قد تظهر نمط السباحة المتغير، وجعل سجل من هذه التغييرات إما عن طريق التقاط قصيرة (30 ق إلى 1 دقيقة) فيديو من اليرقات تظهر نمط حركة غير طبيعية.
- بعد 5 أيام من التعرض للمركبات الكيميائية، لاحظ التركيز الذي يموت فيه نصف الأجنة لحساب التركيز المميت الأقصى نصف 50 (LC50)من كل مادة كيميائية.
ملاحظة:التركيز LC50 هو التركيز الذي يموت فيه 50٪ من الأجنة في نهاية 5 أيام من التعرض لمجمع كيميائي. استخدام ما لا يقل عن 20 جنينا لاختبار سمية كل تركيز مركب23. - بناء منحنى لوفيات الأجنة لجميع التركيزات باستخدام برنامج مناسب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
والجزء الحاسم من تقييم السمية هو اختبار تركيزات مختلفة من مركب كيميائي واحد أو مركب كيميائي متعدد في تجربة واحدة. في البداية، حدد المركبات لتقييم السمية، وعدد التركيزات لاختبار لكل مركب، وبناء على ذلك، قم بإجراء مخطط (الشكل3). استخدمنا لون فريد لكل مركب لتنظيم العينات(الشكل 3). استخدام علامة مقاومة المذيبات ووضع العلامات في الجزء السفلي أو الجانبين من لوحات من المهم لتجنب خلط في وقت لاحق. إذا كانت المركبات تحفز أي عيوب فيفينوتيبيك في اليرقات المعرضة لتركيزات مختلفة من مثبطات، يتم تسجيل العيوب كل 24 ساعة على مدى فترة 1-5 ديسيبل (الشكل4A،B، C،D). ولم تظهر الأجنة المعالجة بمثبط CA IX المعروف بتركيز قدره 500 ميكرومتر أي تغييرات ظاهرة في الفينوتيبيك في الأيام الواحدة إلى الخمسة من التعرض للمركب الكيميائي (الشكل4B). الشكل 4C والشكل 4D يظهر الأجنة المعالجة مع مثبطات β-CA التي تسببت في مختلف العيوب الفينوتية غير المفقسة حتى في اليوم 3 (رأس السهم)، وهيكل الجسم المنحني (السهم)، كيس صفار غير المستخدمة وذمة التامور (رأس السهم) وعدم وجود أكياس الأوتليث في اليرقات في 5 أيام بعد العلاج مع مركب كيميائي (السهم). في دراسة أخرى، تظهر الأجنة المعالجة بمثبطات CA (الشكل4E)عدم وجود أكياس الأوثليث والمثانة السباحة (رؤوس الأسهم). في دراستنا ، (الشكل4C، D)، قمنا بتوثيق العيوب الفينوتيبيك (الأجنة الهشة وعدم وجود تصبغ) حتى بعد اليوم 1 من التعرض لمثبطات CA. وأظهرت التحليلات الفينوتية أن بعض المركبات المثبطة قاتلة ولا يمكن تطويرها كأدوية للاستخدام البشري (الشكل4CوD والجدول 1).
حددت التجارب مركب تمثيلي تسبب في حدوث تغييرات طفيفة أو معدومة أثناء النمو الجنينيوأظهرت جرعة عالية من LC50 (الشكل 5)، مما يشير إلى أن المركب آمن لمزيد من التوصيف و يمكن تطويرها إلى مرشح المخدرات للاستخدام البشري16. النظر في الصور الثابتة لليرقات المعرضة للمجمع أظهرت أي عيوب فينوتيبيك (الشكل4ب). ومع ذلك، تم العثور على نفس المركب لتكون سامة للأعصاب والترنح المستحث في اليرقات بعد 5 أيام من التعرض لمثبط CA (الشكل6). ولا يمكن الكشف عن هذا النمط الظاهري إلا من خلال المراقبة المباشرة لسلوك السباحة في يرقات سمك الحمار الوحشي تحت المجهر. وأشارت هذه الدراسات إلى أن التطور العصبي ليرقات سمك الحمار الوحشي حساس للمركب16،17.
الشكل 1: الوقت اللازم للفحص السريع للمركبات الكيميائية باستخدام أجنة سمك الحمار الوحشي: في مجموعة واحدة من التجارب، يمكن للشخص الذي لديه خبرة عملية فحص حوالي 5 مركبات كيميائية (كل مركب يتطلب ما لا يقل عن 6 تخفيفات) باستخدام أجنة سمك الحمار الوحشي في لوحات 24 بئر. في المجموع، فإنه يأخذ حوالي 8-10 ساعة من إعداد الصلبان لأداء LC50 تحديد على مدى فترة 8 أيام.
الشكل 2: رسم بياني يبين توزيع تقييم سمية المركبات الكيميائية. ويتطلب فحص سمية المركبات الكيميائية 8 أيام ويمكن تقسيمه إلى خمس خطوات. (اليومالأول) يتكون من إعداد أزواج التزاوج حمار وحشي في الدبابات. (اليومالثاني) ينطوي على جمع الأجنة من خزانات التزاوج في أطباق بيتري تليها الاحتفاظ بها في حاضنة 28.5 درجة مئوية لليلة واحدة. (اليومالثالث) فحص الأجنة باستخدام مجهر مجسم وتنظيف الأجنة. توزيع الأجنة في لوحات 24 بئر وإضافة تخفيف مركبات الاختبار. (اليوم4-8) التحليلات الفينوتية لليرقات لعيوب النمو. وقد أجريت دراسة نمط السباحة وتحديد LC50 في اليوم الأخير من التعرض للمركبات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: عرض تخطيطي للتجارب التي ينطوي عليها تقييم السمية. ويتألف تقييم السمية من إعداد مخطط مجدول يحتوي على معلومات عن المركبات الكيميائية، والتخفيفات في المركبات والبارامترات التي يتعين تقييمها. جعل تخفيف حلول المخزون إلى التركيزات المطلوبة في أنابيب الطرد المركزي 15 مل (التخفيف من أنبوب واحد لتضاف إلى كل صف من لوحة 24 جيدا). لوحة من 24 بئرًا تحمل علامة إثبات المياه مع اسم مركب الاختبار، والتركيز في كل صف، وتاريخ التعرض. فحص وتصوير الأجنة عن طريق نقل اليرقات إلى طبق بيتري صغير يحتوي على 3٪ عالية الوزن الجزيئي ميثيل السليلوز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال على التحليل الظاهري لليرقات في المجموعات المعالجة المركبة للتحكم والاختبار. (أ) أظهرت التحليلات الفينوتية لليرقات مجموعة التحكم التي لم تعالج مع أي مركب أي عيب فينوتيبيك تحت المجهر. (B) اليرقات المعالجة مع 500 μM CA المانع (لم يظهر المانع المعروف من أنهيدراز الكربونية التاسع أي عيوب فينوتيبيك يمكن ملاحظتها. (C, D) اليرقات النامية المعالجة بمثبط بيتا-CA بتركيزات 250 μμ و 125 μM على التوالي. المركبات الناجمة عن عيوب فينوتيبيك مثل الجسم المنحني، وذمة التامور، وكيس صفار غير المستخدمة (الأسهم ورؤوس الأسهم). تم تعديل الفريقين A و B من Aspatwar وآخرون16. تظهر اللوحات CوD وE صورًا غير منشورة مسبقًا، والتي تم الحصول عليها باستخدام مجهر مختلف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحديد التركيز المميت 50 (LC50)باستخدام يرقات سمك الحمار الوحشي 1-5 ديسيبل. يسمح تقييم السمية باستخدام أجنة سمك الحمار الوحشي للباحثين بتحديد الحد الأدنى من التركيز المميت للمركب الكيميائي في نهاية التجربة. وكان تركيز LC50 من المركب (مثبط CA IX المعروف) 3.5 mM. ارتفاع التركيز LC50 يسمح مزيد من توصيف المجمع. تم تعديل هذا الرقم من Aspatwar وآخرون16. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: مثال على تحليل نمط السباحة في كل من مجموعات اليرقات غير المعالجة (ألف) والمثبطات المعالجة (باء). وأظهرت يرقات سمك الحمار الوحشي المعالجة في اللوحة باء مع مركب مثبط اختبار 300 ميكرومتر (وهو مثبط معروف من أنهيدراز الكربوني البشري التاسع) نمط حركة غير طبيعي (ترنح) (رؤوس الأسهم)، مما يشير إلى أن المركب يحفز السمية العصبية في الأجنة النامية . تشير رؤوس الأسهم إلى انحناء ذيله الطبيعي أثناء السباحة. في لوحة A تشير الأسهم إلى انحناء عادي من الذيل أثناء السباحة. تم تعديل هذا الرقم من Aspatwar وآخرون16. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مثبطات كاليفورنيا | فحص السمية | LC50 | في الجسم الحي | CAIs السامة | مرجع |
| كاربامتس | 24 | جميع | 1(أ) | 3(ب) | 24, غير منشورة |
| الكومارين | 10 | جميع | - | 2 | غير منشوره |
| النيتروميدازول | 2 | جميع | 2 | 2(ج) | 16 |
| سلفوناميد | 5 | جميع | - | 3 | 25 |
| مجموع | 41 | جميع | 3 | 10 | - |
| (أ) واستنادا ً إلى فحص السمية، استخدم المثبط لتثبيط مفطرة ميوممارينوم في نموذج سمك الحمار الوحشي. (ب) مثبطات قاتلة، جسامة للأعصاب فوق تركيز 300 درجة مئوية | |||||
الجدول 1: موجز لسلامة وسمية المركبات التي تم فحصها. تساعد تجربة تقييم السمية الباحث على التوصل إلى استنتاج حول سلامة المركبات الكيميائية المختبرة. ويسمح تركيز التركيز المميتالنصفي بتحديد التركيز الآمن لمزيد من التوصيف. يمكن للباحث أن يقرر ما إذا كان المجمع مميتاً حتى بعد 24 ساعة من تعرض الأجنة للمجمع قيد التحقيق. في مثالنا، تأثير خفية على السباحة بسبب السمية العصبية هو المعلومات الهامة، والتي هي مفيدة لإعداد المزيد من التجارب. وبناء على ذلك، واستنادا إلى فحص السمية، تمكنا من استخدام تركيزات آمنة من مثبطات كاليفورنيا لمزيد من التوصيف في الجسم الحي24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في اختبار السمية في المختبر باستخدام الخلايا المستزرعة يمكن الكشف عن البقاء على قيد الحياة والدراسات المورفولوجية للخلايا التي توفر معلومات محدودة عن السمية الناجمة عن مركب الاختبار. وميزة فحص سمية المركبات الكيميائية التي تستخدم أجنة سمك الحمار الوحشي هي الكشف السريع عن التغيرات الفينوتية المستحثة كيميائياً في الحيوان كله أثناء التطور الجنيني في كائن نموذجي ذي صلة. ما يقرب من 70٪ من الجينات البشرية البروتين الترميز لديها نظائرها orthologs في جينوم حمار وحشي25. يتم حفظ المسارات الوراثية التي تتحكم في نقل الإشارة والتنمية بشكل كبير بين الإنسان وسمك الحمار الوحشي26، وبالتالي، من المرجح أن يكون للمركبات الكيميائية آثار سمية مماثلة في البشر25.
حمار وحشي هي في طليعة البحوث السمية وقد استخدمت بالفعل على نطاق واسع للكشف عن السموم في عينات المياه ودراسة آلية عمل السموم البيئية وآثارها على الحيوان27. في هذه المقالة، نبين استخدام تطوير أجنة سمك الحمار الوحشي لتقييم سمية المركبات المحتملة في المرحلة المبكرة من اكتشاف المخدرات. ويستند تقييمنا للسمية السريعة والمتعددة الأوجه على 1) التغيرات في النمط الظاهري للكائن الحي (الفقس، أكياس الأوتوليث، وذمة التامور، واستخدام كيس صفار البيض، وتطوير الوتر، وضربات القلب، وتنمية المثانة السباحة، والحركة) أثناء الجنين التنمية على مدى فترة 5 أيام، و 2) تحديد التركيز القاتل (LC50). ساعات معقولة من العمل العملي (8-10 ساعة مقسمة على 8 أيام) كافية لتحديد ملف السمية للمركب باستخدام هذا الإجراء. بالنسبة للمركبات المركبة حديثاالتي تتوفر بكميات محدودة، يمكن تقييم السمية باستخدام ما لا يقل عن 3 ملغ من المركب. ولا توجد حاجة إلى معدات خاصة. وبالتالي، فإن الإجراء هو وسيلة سريعة ومنخفضة التكلفة لتقييم الآثار السامة لأي مركب يمكن أن تتطور إلى المخدرات للاستخدام البشري.
نوعية دفعة من الأجنة له تأثير كبير على نتيجة التجربة. نوعية البيض (بما في ذلك معدل الإخصاب) ليست واضحة مباشرة بعد جمع من خزانات تربية (0-4 hpf). للحصول على الأجنة النامية عادة فقط للتجارب، قبل إضافة المركبات، ونحن نسمح للأجنة أن تبقى عند 28.5 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بعد جمع من خزانات تربية. بعد 24 حصان، يتم التخلص من أي أجنة ميتة أو غير صحية المظهر. وبالإضافة إلى ذلك، من المستحسن أن يكون هناك مجموعة من الأجنة المعالجة وهمية في كل تجربة لمزيد من الرقابة على نوعية دفعة البيض المستخدمة في التجربة، فضلا عن رؤية معدل الوفيات الأساسي لتحديد LC50 بدقة.
وهناك حاجة أيضا إلى مجموعة معالجة وهمية للسيطرة على سمية السيارة المفضلة. العديد من المواد الكيميائية غير قابلة للذوبان في الماء وغالبا ما يستخدم DMSO كوسيلة لتسليم مركبات الاختبار. يتم التسامح مع DMSO بشكل جيد بشكل عام من قبل الأجنة في أقل (0.1٪) تركيزات28. في بعض الأحيان، المركبات ليست قابلة للذوبان تماما حتى في DMSO ويبدو الحل غائممما يجعل من الصعب تقييم السمية. في مثل هذه الحالات، للحصول على حل الأسهم من المجمع قابل للذوبان تماما وواضحة، مضيفا انخفاض بنسبة 0.1٪ هيدروكسيد الصوديوم سوف يحل المشكلة. ويلزم إنشاء مجموعات مراقبة مناسبة لتقييم سمية المركب بدقة. وإذا استخدمت مركبات أخرى، فإن سميتها المتأصلة قد تؤثر على التجربة.
كل بئر من لوحة 24 جيدا يحتوي على 1-10 الأجنة المغمورة في حجم إجمالي قدره 1 مل. إذا كان مركب الاختبار متوفرًا بكميات صغيرة فقط، فقد يكون من الضروري استخدام ما يصل إلى 10 أجنة لكل بئر لتقييم سميته. ينصح بشدة أن يتم استخدام جنين واحد فقط لكل بئر لكل تحليل16،24،29. يتم تخزين لوحة في حاضنة 28.5 درجة مئوية لمدة 5 أيام. في بعض الأحيان لوحظ تبخر كبير مما تسبب في تغيير ملحوظ في تركيز المركب في بئر معين16. من خلال ختم لوحات 24 جيدا مع أفلام البارافين من جميع الجوانب، ووضع الأجنة فقط في الآبار الوسطى وملء الآبار الأخرى على طول الحافات مع الماء، يمكن تجنب المشاكل الناجمة عن التبخر. في دراساتنا السابقة، لم نلاحظ أي تبخر للمواد الكيميائية من 24-جيدا لوحات24،29. أيضا, إذا كان من المعروف أن المجمع في السؤال غير مستقر تحت درجات الحرارة المحيطة, وسوف تكون هناك حاجة إلى تغييرات يومية في المياه مع مركب جديد لنتائج موثوق بها.
يتم تحليل نمط السباحة من يرقات سمك الحمار الوحشي بعد 5 أيام من التعرض للمجمع. الآبار من لوحة 24 جيدا تحتوي على يرقات 5 dpf ليست مثالية لهذا الغرض بسبب حجم محدود من البئر. لذلك، لتحليل دقيق لنمط السباحة، تحتاج اليرقات إلى نقلها إلى طبق بيتري يحتوي على 50 مل من الماء E3 ويمكن أن تستقر لمدة 2 دقيقة قبل التحليل. في دراستنا، أظهر اثنين فقط من مثبطات التأثير على نمط السباحة16 بين مثبطات 52 α-CA وβ-CA التي تم فحصها للسلامة والسمية، استناداً إلى تجربتنا هذا الاختبار يمكن الكشف عن تغييرات خفية بما في ذلك حركة الارتجاج خفيفة من اليرقات.
أظهرت هذه الدراسة أن القيد الوحيد على الطريقة الحالية هو البراعة البدنية. ويمكن التغلب على هذا القلق من خلال التكرار، مع تحسن مهارة الشخص مع الممارسة. وبمجرد أن يتم تحقيق الخبرة تقييم المركبات التي تستخدم أجنة حمار وحشي هو أخلاقي وسهل وفعال ومفيد. ولذلك، نتوقع أن يصبح هذا الفحص السريع باستخدام أجنة سمك الحمار الوحشي أداة شعبية لفحص السمية في الجسم الحي في المرحلة المبكرة من تطور المخدرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولم يبلغ أصحاب البلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم العمل بمنح من مؤسسة سيغريد جوسيليوس (SP, MP), المؤسسة الثقافية الفنلندية (AA, MH), أكاديمية فنلندا (SP, MP), أوريون فارموس مؤسسة (MH), مؤسسة تامبيري للسل (SP, MH وMP) وجين وأتوس إركو مؤسسة (SP وMP ). نشكر متعاونينا الإيطالي والفرنسي، البروفيسور سوبوران، والبروفيسور وينوم، على توفير مثبطات أنهيدراز الكربونية لتقييم السلامة والسمية لأغراض تطوير الأدوية المضادة للسل والسرطان. ونشكر أوليكي ليموس وماريان كوسلاتي على المساعدة التقنية. كما نشكر لينا ماكينن وهانالينا بيبو على مساعدتهما في تربية أسماك الحمار الوحشي وجمع الأجنة. نشكر باخلاص هارلان باركر على التقييم النقدي للمخطوطة والتعليقات الثاقبة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. Gupta, R. C. , Elsevier. Boston, MA, USA. 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. Alternative models in developmental toxicology. Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), Elmsford, N.Y. 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , Suppl 31. 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
