Summary
このプロトコルは、誘導性 piggyBac ベクターからの転写因子を異所的に発現することによって、脊髄または頭蓋の同一性を有する運動ニューロンへの誘発多能性幹細胞の迅速かつ効率的な変換を可能にする。
Abstract
ここではヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) から機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンを得る方法について述べる。運動ニューロンへの直接変換は、転写因子、すなわち Ngn2、Isl1 および Lhx3 (NIL) または Ngn2、Isl1 および Phox2a (ニップ) の代替モジュールの異所性発現によって得られる。NIL およびニップは、それぞれ、脊髄および頭蓋運動ニューロン同一性を指定する。私たちのプロトコルは、piggyBac トランスポゾンベクターを介して、NIL またはニップがゲノム内に安定して統合される修飾 iPSC 線の生成から始まる。トランスジーンの発現は、その後、ドキシサイクリンおよびリードによって誘発され、5日で、iPSCs の MN 前駆細胞への転化に移行する。その後の成熟は、7日間、脊椎または頭蓋の MNs の均質な集団をもたらす。私たちの方法は、以前のプロトコルよりもいくつかの利点を保持します: それは非常に迅速かつ単純化されます。これは、ウイルス感染またはさらに MN 分離を必要としません;これは、アクション電位の列車を発射する能力によって示されるように、成熟の顕著な程度で異なる MN 亜集団 (脊髄および頭蓋) を生成することができます。さらに、混合集団から精製することなく多数の運動ニューロンを得ることができる。iPSC 由来の脊髄および頭蓋運動ニューロンは、筋萎縮性側索硬化症および運動ニューロンの他の神経変性疾患のインビトロモデリングに使用することができる。同種運動ニューロン集団は、細胞型特異的薬物スクリーニングのための重要な資源を表すかもしれない。
Introduction
運動ニューロン (MN) 変性は、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) や脊髄筋萎縮 (SMA) などのヒト疾患において原因となる役割を果たしている。ヒト MN の複雑性を不在するインビトロ細胞モデルシステムを確立することは、新しい治療アプローチの開発に向けた重要なステップである。顕著な plurilineage 分化特性を授けられている誘導多能性幹細胞 (iPSCs) は、現在、運動ニューロン疾患1,2によって影響を受ける多くの患者に由来している。MN 疾患に関連した病原性変異を運ぶ付加的な iPSC 線は、遺伝子編集によって生成されており、制御「健常な」多能性幹細胞3から始まる。これらの線は、インビトロ疾患モデリングおよび薬物スクリーニングのための有用なツールを表し、MNs への iPSC 分化のための適切な方法が利用可能であることを提供する。この方法の開発の背後にある理論的根拠は、成熟した機能 MNs を生み出す高速かつ効率的な分化プロトコルで MN 疾患に興味を持って科学的なコミュニティを提供することです。この方法の最初の利点は、実行の時間枠です。強度の別の関連するポイントは、任意の精製工程の排除から来ています。最後に、プロトコルは、運動ニューロンの2つの異なる集団を生成するために使用することができます。
MNs の異なるサブタイプを生成する可能性は、特に MN 疾患のモデル化に関連している。すべての MN 亜型は、ALS および SMA において同様に脆弱であり、異なる運動単位での症状の発症は、予後に大きく影響する。ALS において、上肢および下肢において始まる症状を伴う脊髄発症は、約3-5 年で死に至る4.逆に、球性発症は、頭蓋 MNs の変性から始まり、最悪の予後を有する。さらに、球性発症の割合は、SOD1 変異5を有する個体に比べて RNA 結合タンパク質 FUS および TDP-43 の突然変異を有する患者において有意に高い。代替 MN 分化プロトコールのほぼ全体は、レチノイン酸 (RA) の活性に依存しており、iPSCs6、7、8の鑑別に脊髄特性を付与する。これは、特定の MN 亜型9,10で保護することができる内因性因子を研究する可能性を制限します。
マウス胚性幹細胞11における以前の作業と一致して、我々は最近、ヒトの iPSCs 異所の Ngn2、Isl1 および LHX3 (NIL) が脊髄 MN 同一性を誘導するのに、Ngn2 および Isl1 プラス PHOX2A(ニップ) を頭蓋 MNs を指定することを示した。従って私達はそれ故に12日の転換の機能特性と恵まれた人間の MNs の生産に導く有効な議定書を開発した。この方法の目的は、短時間で、精製を必要とせずに (例えば、FACS によって) 得ることであり、細胞集団は脊髄または頭蓋の同一性を有する MNs に対して高度に濃縮された。
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Protocol
1. 人間の iPSCs の維持
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マトリックスコーティングプレートの調製
- 4° c のマトリクス (材料の表を参照) の1つの 5 mL バイアルを一晩解凍します。元のマトリックス株は異なるストック濃度で来て、アリコートは個々のロットに特異的なデータシートに示された希釈倍率に従って作られる。マトリックスの早期ゲル化を防ぐためにバイアルとチューブの氷を冷たく保つことが重要です。氷の前に冷やされた cryotubes のアリコートにマトリックスを分配しなさい。-20 ° c で未使用のアリコートを凍らせます。
- 1つのアリコートを氷上で約2時間、解凍します。
- 50 mL の円錐形の管の冷たい DMEM/F12 の20の mL が付いているマトリックスのアリコートを希釈しなさい。
- よく混ぜて 35 mm の皿 (他の料理の表面積ごとの同等の量) に希釈されたマトリックスの 1 mL を分配してください。
- 1時間室温で希釈したマトリックスを含む食器を使用して、コーティングを可能にします。
注:パラフィルムで密封された皿は、2週間まで4° c で貯えることができる。
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原液の調製 (20 mL) と、穏やかな細胞解離試薬の1x 作業アリコート(資料表参照)。
- 粉末を PBS 中で 10mg/mL に溶解させます (Ca2+/Mg+ free)。
- 0.22 μ m フィルター膜を通してフィルター消毒。
- 20個のアリコート (それぞれ 1ml) を用意し、-20 ° c で保管してください。
- 使用前に、PBS (Ca2+/Mg2 + free) の1アリコートを 1 Mg/mL (1x 作業アリコート) に希釈してください。
注: 1x 作業アリコートは、2週間まで4° c で保存することができます。
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継代人間の iPSCs。
- 開始前: 4 ° c で保存する場合、37° c のインキュベーター内で20-30 分間の前温マトリックスコーティングされたプレートを室温で予熱する必要がありましたヒト iPSC 培地 (材料の表を参照) の量。DMEM/F12 を予温する。
- 培養液を吸引する。
- PBS (Ca2 +/Mg2 + free) で iPSCs をすすぎます。
- 1x ジェントル解離溶液 (35 mm ディッシュに 0.5 mL) を加えます。コロニーの端がプレートから剥離し始めるまで37° c でインキュベート, 通常3-5 分.
- 穏やかな解離溶液を吸引し、iPSC コロニーを分離しないように注意する。
- 細胞を DMEM/F12 (35 mm ディッシュで 2ml) で洗浄し、細胞を切断しないように注意して吸引します。この手順をもう一度繰り返します。
- ヒト iPSC 培地 (35 mm ディッシュに 1ml) を加えます。
- 細胞リフターでコロニーを静かに切り離し、15 mL のチューブに移します。
- P1000 pipettor 3-4 回で、セルの束をゆっくりとピペットで押して、静かに切断します。
- マトリックスコーティングされたプレートから上清を吸引する (s)。
- ヒト iPSC 培地の適切な培養容積中に細胞を播種する。スプリット比は、行ごとに異なることができ、約1:4-1:8 です。メディアを毎日変更します。
2. NIL およびニップ誘導性 iPSC 線の生成
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細胞トランスフェクション。
- PBS (Ca2+/Mg+ free) で細胞をすすいでください。
- 細胞解離試薬 (材料の表を参照) を加え (35 mm ディッシュは 0.35 mL)、単一の細胞が分離されるまで37° c でインキュベートします (5-10 min)。
- P1000 pipettor 3-4 回で、上下にピペッティングして細胞の分離を静かに完了します。
- 15 mL チューブで収集し、PBS (Ca2+/Mg2 + free) を10ml に添加します。セルをカウントします。
- ペレット 106細胞および再懸濁は、100μ l のバッファ R (エレクトロポレーションキットの細胞に含まれる、材料の表を参照)。
- トランスフェクションのためのプラスミド DNA を追加します: 転移因子ベクターの4.5 μ g (epB-Bsd-TT-NIL または epB-Bsd-TT-NIP12) および piggyBac トランスポゼースプラスミド13の0.5 μ g。
- トランスフェクトは、製造元の指示に従ってセルのエレクトロポレーションシステム (資料の表を参照) を使用し、前述の3 つのパラメータを使用して、1200 V 電圧、30 ms 幅、1パルスを示します。ヒト iPSC 培地中に細胞を播種し、6 mm マトリックスコーティングされた皿に10μ m Y-27632 (岩石阻害剤、材料表を参照) を添加した。
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抗生物質による選択。
- トランスフェクションの2日後に、培養培地に5μ g/mL ブラスチシジンを加えます。
- 非トランスフェクトされた細胞のほとんどは、ブラスチシジン選択の 48 h 以内に死亡する。ゲノム中のトランスジーンを統合していない細胞をブラスチシジンに、少なくとも7-10 日間細胞を再選択するようにしてください。
- 混合集団として安定的にトランスフェクトされた細胞を維持し、異なる数のトランスジーンおよび異なる集積部位を有する細胞から構成される、または単一クローンを単離する。
- Ngn2 (フォワード: TATGCACCTCACCTCCCCATAG のためのトランスジーン特異的プライマーを用いた RT-PCR により、1μ g/mL のドキシサイクリン誘導時にトランスジーンの効果的な発現をチェックする追加の皿を準備します。逆: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT)、前述したように12.
- この段階では、ヒト iPSCs のための凍結培地において新規の NIL-およびニップ− iPSC 線のストックを凍結する (材料の表を参照)。
3. 運動ニューロン分化
- 細胞を解離試薬の細胞と分離して説明する (手順 2.1.1.-2.1.3.)。15 mL チューブで細胞を解離させると、5倍量の DMEM/F12 で希釈します。ペレット細胞および再懸濁をヒト iPSC 培地中で、10μ m の ROCK 阻害剤を添加した。62500細胞/cm2 の密度でマトリックスコーティングされた皿の細胞そして種を数える。
- その翌日、培地を DMEM/F12 と交換し、1個の安定した L-グルタミンアナログ、1x の非必須アミノ酸 (NEAA) 細胞培養サプリメントおよび 0.5 x ペニシリン/ストレプトマイシンを添加して、3μ g/mL のドキシサイクリンを含む。これは、分化の0日目とみなされます。1日目に、培地とドキシサイクリンをリフレッシュします。
- 2日目に、培地を Neurobasal/B27 培地に変更し (Neurobasal 培地に 1x B27、1x 安定 L-グルタミンアナログ、1x NEAA、0.5 x ペニシリン/ストレプトマイシン) を添加し、5μ m DAPT、4μ m SU5402 および1μ g/mL のドキシサイクリンを含む (資料表参照).5日目まで毎日の培地とドキシサイクリンをリフレッシュ。
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5 日目: 細胞解離試薬による解離(資料表参照)。
- PBS (Ca2+/Mg+ free) で細胞をすすいでください。
- 細胞解離試薬 (35 mm ディッシュは 0.35 mL) を加え、細胞単層全体がディッシュから分離するまで37° c でインキュベートします。単一の細胞はインキュベーションの間に分離されないことに注意してください。
- 1ml/F12 の 1 mL を追加し、15 mL のチューブで細胞を収集します。.
- P1000 pipettor 10-15 回で、上下にピペッティングして細胞の分離を静かに完了します。
- 4 mL の DMEM/F12 を加え、細胞を数える。
- この段階では、凍結運動ニューロンは、製造業者の指示に従って、細胞凍結培地で前駆細胞 (材料の表を参照)。
- ペレットを神経媒体中の細胞および再懸濁 (Neurobasal/B27 培地に添加した 20 ng/mL の BDNF、10 ng/mL の GDNF および 200 ng/ml の L-アスコルビン酸、10μ m ROCK 阻害剤を添加した材料の表を参照のこと)。
- ポリオルニチン/ラミニン上の細胞をシード-または10万細胞/cm2 の密度でマトリックスコーティング支持体。免疫染色の分析のためにポリマーカバースリップ (材料の表を参照) とのμ-スライドのプラスチックサポートを使用しなさい。
- 6日目に、ROCK 阻害剤を欠く新鮮な神経媒体で培地を変更する。次の日には、メディアの半分を3日ごとに更新します。培養媒体は、表面からの剥離を防ぐために、非常に慎重に変更する必要があります。
4. 免疫染色分析
- 細胞固定。PBS で細胞をすすぎ (Ca2+/Mg +)、室温で pbs 中の 4% パラホルムアルデヒド (ca2+/Mg2 +) で15分間インキュベートします。
注意:パラホルムアルデヒドは有毒であり、癌を引き起こす可能性が疑われる。皮膚や目との接触を避け、化学ヒュームフードの下で取り扱います。 - 室温で5分 0.1% のトリトン X-100 を含んでいる PBS (Ca2+/Mg2 +と) の透過処理。
- 抗体ブロッキング溶液 (ABS: PBS 中の 3% BSA で Ca2 +/Mg2 +) で30分間インキュベートします。
- ABS の一次抗体を用いて室温で1時間インキュベートする: 抗 TUJ1 (1:1000; ウサギ) および抗 Oct4 (1:200; マウス) またはアンチ・チャット (抗コリンアセチルトランスフェラーゼ; 1:150; ヤギ)。資料の表を参照してください。
- 適切なロバを使用して室温で45分インキュベートしてください。 ABS では、抗マウス alexa fluor 647 (1:250)、抗ウサギ594アレクサ fluor (1:250)、抗ヤギアレクサ fluor 488 (1:250)。資料の表を参照してください。
- 室温で5分間0.4 μ g/mL DAPI でインキュベートし、核にラベルを付けます。
- 蛍光顕微鏡で撮像するための埋込媒体 (材料表参照) で細胞をマウントします。
5. パッチクランプによる機能評価
- HEPES 平衡型外部溶液 (NE) を次のように準備します: 140 mM NaCl、2.8 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mm MgCl2、10 mm HEPES、および 10 mm グルコース。290-300 m ωの間のオスモル濃度を設定します。1N NaOH を使用して pH を7.3 に調整し、溶液を4° c で保存します。
- 内部溶液を準備する: 140 mM K-グルコン酸塩、2mm NaCl、5mm BAPTA、2mm MgCl2、10ミリメートル HEPES、2ミリメートル MG-ATP、0.3 mm NA-GTP。PH を1M の KOH で7.3 に調整し、オスモル濃度が約 290 m ωに設定されていることを確認します。溶液を-20 ° c で小さなアリコートで凍らせる。
- 実験を実行する前に、約28-30 ° c の水浴中で NES 溶液を予温する。
- ホウケイ酸 micropipettes (ID 0.86 mm を引っ張ってください。先端の抵抗を支える OD 1.5 mm): 5-6 m ωおよびピペットのホールダーに取付ける前に細胞内の解決を満たしなさい。
注:配線表面に AgCl の均一な層を形成するためには少なくとも30分間漂白剤中の記録電極と参照電極の塩化銀ワイヤーに注意してください。 - 記録室にペトリ皿を移し、1-2 mL/min の NES の解決の部屋をしなさい。溶液を暖かく保つために、30° c の温度に設定されたインラインヒーターを通過する流れをしてみましょう。
- 電気生理学的記録室を直立顕微鏡で配置する。パッチクランプアンプで膜電流を記録し、適切なソフトウェアでデータを集録します。
- アンプ制御ソフトウェアを開き、値1の信号ゲインと 10 kHz のベッセルフィルタを設定します。ベッセルフィルタがサンプリング周波数よりも2.5 倍低いことを確認します。
- 記録ソフトウェアの電圧クランプおよび電流クランプ実験のための実験プロトコルを設定します。
- プロトコル設定では、エピソード刺激モードをチェックし、25 kHz でサンプリング周波数を設定します。次に、[波形] タブに移動し、次のように電圧または現在のステップの振幅と長さを入力します。
- 電位依存性ナトリウム電流の場合、15個の電圧ステップ (それぞれ 50 ms 持続時間) を-100 mV から + 40 mV (10 mV インクリメント) で使用します。パッチを適用したセルに、アンプを通して-60 mV の保持電位を課すと、プロトコルを実行します。同様に、電圧依存性カリウム電流は、記録されたセルを-40 mV に保持する-30 mV から + 50 mV (10 mV インクリメント) までの電圧ステップ (それぞれ 250 ms 持続時間) によって誘発します。
- IPSC 派生頭蓋および脊髄 MNs の発火特性を調べるために、クランプ細胞を、電流クランプモードで、膜電位で-70 mV と (+ 20 pA から + 80 pA; 20 pA インクリメント) の増加振幅の4現在のパルス (1 秒の持続時間) を使用します。
- 各セル電圧活性化電流、誘発焼成活性、および全細胞容量 (Cm) としての3つの受動特性、細胞膜抵抗 (Rm) および静止膜電位 (RMP) を取得します。
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Representative Results
この分化方法の概略説明を図 1に示す。ヒト iPSCs (WT I ライン3) は、EpB-BSD-TT-NIL または EpB-BSD-TT-ニップを用いてトランスフェクトし、ブラスチシジン選択に際して、安定かつ誘導的な細胞株12を、それぞれ iPSC-NIL および iPSC-ニップと称する。分化細胞は、多能性マーカー OCT4 と汎神経マーカー TUJ1 の発現について特徴付けられた。免疫染色分析は、0日目に全ての細胞における OCT4 の均一な発現を示したが、TUJ1 陽性の非存在下である (図 2A)。3日目に、iPSCs 分化のサブセットにおいて TUJ1 の発現によってミラーリングされた OCT4 陽性細胞数の強い減少を観察した (図 2B)。5日目において、母集団において OCT4 の発現が認められず、TUJ1 の一貫した発現を示し、神経の形態を獲得した (図 2C)。その後、運動ニューロン前駆細胞を解離し、さらに成熟させるために再めっきした。7日後 (0 日から12日目) に、細胞を均一に発現し、TUJ1 および成熟した運動ニューロンマーカーをチャットした (図 3)。同じ培養および分化条件 (補足図 S1および補足図 S2) を使用して、2つの追加の商業 iPSC ライン (材料の表を参照) で同様の結果が得られています。マウスの Esc11からの nil 誘発運動ニューロンと同様に、NIL およびニップで誘導されるヒト iPSCs は、低レベルの HOX 転写因子を発現し、レチノイン酸で rostro 尾軸に沿ってパターン化することができる (補足図 S3).
これらの結果は、分化開始時に 62500 細胞/cm2 が播種され、0日目に1μ m のドキシサイクリンを用いて誘導した場合に得られた。これは、細胞の明らかな毒性なしにトランスジーンの最大誘導を達成するためにドキシサイクリンの最適な濃度をもたらしました (補足図 S4A).5日目にドキシサイクリンを摘出した後、トランスジーンの発現を沈黙させた (補足図 S4B)。また、プロトコルのこの時点で細胞の最適な密度を確立するために、パイロット実験を行っています。我々は、並列分化実験においてこのパラメータを変えることが異なる結果を提供したことに気づいた。初期密度を31250細胞/cm2 に低下させると、分化は明らかに正常であり、細胞形態を観察することによって評価された。しかし、我々は、5日目 (セクション 3.4) における解離への耐性と、その後の成熟期における生存率の低下に気づいた。逆に、細胞の初期密度が125000細胞/cm2 に上昇したとき、我々は、典型的なニューロン様形態の獲得の欠如によって評価されるような、非効率の分化を観察した。これは、さらなる精製が必要になる MNs のわずかな分画のみを含む混合集団をもたらした (例えば、FACS によって)。したがって、神経細胞の純粋な集団を得るための最適密度は、2ヶ月以上にわたって培養で生き残ることができ、62500細胞/cm2 であることを確立した。
次に、iPSC ニップ由来頭蓋運動神経細胞12について以前に報告されたように、それらの電気生理学的特性を特徴付けることによって iPSC NIL 由来の脊髄運動ニューロンの機能的成熟を評価した (図 4)。パッチクランプ記録は、電圧および電流クランプモダリティのいずれにおいても、プロトコルの MNs 成熟ステップの7日目に実施された (図 1、分化の合計時間:12 日) (図 4A)。この時点で、iPSC NIL 由来の運動ニューロンは、以前に報告された iPSC に比べて、わずかに低い休止膜電位 (-30 ± 2 mV; n = 24) および類似のセルキャパシタンス値 (+ 25 ± 2 pF; n = 25)を示した。次いで、分化した細胞の成熟度をより深く特徴付けるために、一連の電圧パルスで刺激されたときにナトリウムおよびカリウム電流を呼び起こす能力を調べた。これらの実験では、iPSC NIL 由来のニューロンは、電圧依存性のナトリウム電流 (図 4B)、および電圧依存性のカリウム電流 (図 4C) を正常に表示し、クランプ時にピーク振幅に達します。膜電位は− 20 mV と + 50 mV に近い。Na+および K+の平衡電位は、以前に報告された細胞外および細胞内溶液とネルンストの式 (www.physiologyweb.com/calculators/nernst_potential_calculator.html) を用いて計算され、それぞれ + 110 mV および-102 mV であった。さらに、電流クランプモダリティでクランプされた iPSC NIL 派生 MNs の 80% は、電流パルス + 60 pA 以上を注入したときにスパイクトレインをトリガすることができた (図 4D)。記録された細胞の 50% 以上で反復的な発砲を誘発するのに必要である最小電流は + 40 pA (18 個の細胞のうち15個であった;図 4). スパイク閾値は、-37.6 ± 0.8 mV および + 40 pA における平均発火頻度が約7.9 ± 2.2 Hz (n = 18;図 4F)。
全体として、これらのデータは、以前に報告された iPSC ニップ由来頭蓋 MNs12と同様に、iPSC 由来の脊髄 mns は、成熟ニューロンの典型的な機能的特性を有することを示唆している。
図 1: 運動ニューロン分化プロトコル.図は、piggyBac ベクトルを持つ安定した iPSC ラインの生成から、テキストで報告された機能解析の時点までの、差別化プロトコルの概略図を示しています。プロトコルの異なるステップでの細胞の代表的な位相コントラスト画像が示されている。スケールバー = 50 μ m。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 分化細胞の代表的な免疫染色分析。iPSC 及び iPSC 細胞を、0日目 (A)、3日目 (B) および5日目 (C) において多能性マーカー OCT4 (紫色) 及び汎神経マーカー TUJ1 (赤色) の発現について免疫染色により分析した。核は DAPI を用いて対比染色した。焦点画像は、レーザー走査共焦点顕微鏡 (材料表参照) で、ズーム2x、1024 x 1024 ピクセル、405 nm、473 nm、559 nm および 635 nm レーザーを装備した0.75 の目的を使用して取得されました。DAPI のフィルタ設定、Alexa Fluor 594 および Alexa Fluor 647 が使用されました。スケールバー = 50 μ m。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: IPSC 由来運動ニューロンの代表的な免疫染色分析iPSC および iPSC の細胞は、パン神経マーカー TUJ1 (赤色) および運動ニューロンマーカーチャット (コリンアセチルトランスフェラーゼ; グリーン) を12日目に発現するための免疫染色によって分析した。核は DAPI を用いて対比染色した。図 2の凡例で説明したように、共焦点画像を取得しました。スケールバー = 50 μ m。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 脊髄および脳運動ニューロンの機能解析(A) iPSC NIL に由来する脊髄運動ニューロン上の全細胞パッチクランプの明るいフィールドイメージ。(B) 一連の増加する電圧ステップに応答して iPSC NIL 派生 MNs に記録された Na+電流の代表的な I/V 曲線 (n = 26; 60 mV に等しい電位を保持)。(C) 一連の増加する電圧ステップに応答して iPSC NIL 派生 MNs で記録された K+の代表的な I/V 曲線 (n = 23、40 mV に等しい電位を保持)。(D) + 60 pA の1秒の持続電流注入に応答して誘発される行動電位の列車の代表的な痕跡。(E) 各電流パルスでの作用電位を惹起する iPSC NIL 由来 MNs の割合を表すヒストグラム (n = 18)。(F) 各電流パルスでの喚起発火頻度を表示するヒストグラム (n = 18)。電気生理学的記録は、直立顕微鏡下で行った。膜電流記録システムは、材料の表に示されている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 S1: エピソーム hiPSCs を用いた MN 分化(A) 示された時点におけるエピソーム hiPSC (左) とエピソーム HIPSC-ニップ (右) の明視野画像スケールバー = 50 μ m。(B) リアルタイム qRT によるエピソーム hiPSC (上) およびエピソーム HIPSC-ニップ (ボトム) 細胞の分化における示されたマーカーの発現の分析。各マーカーに対して、最も高い式を持つタイムポイントが校正器サンプルとして使用されています。ISL1 に使用されるプライマーは、内因性遺伝子に特異的である。(C) TUJ1 に対する免疫染色 (赤色) および頭蓋 MN マーカー PHOX2B (緑色) 分化 (6 日目) エピソーム hiPSC (左) およびエピソーム HIPSC-NIP (右) 細胞。核は DAPI を用いて対比染色する。すべてのパネルのためのスケール棒:50 μ m。(D) リアルタイム qRT PCR によってエピソーム hiPSC (上) およびエピソーム HIPSC-ニップ (下) 細胞を分化させる際の HB9 および PHOX2B の発現の分析。0日目が校正器サンプルとして使用されています。PCR プライマーおよび方法は、De サンティス et al., 201812に報告されている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 S2: DS2U iPSCs を用いた MN 分化(A) 指示された時点で DS2U-NIL (左) と DS2U (右) を区別する明視野画像。スケールバー = 50 μ m。(B) リアルタイム qRT による DS2U (上) および DS2U (下) 細胞の分化における示されたマーカーの発現の分析。各マーカーに対して、最も高い式を持つ時点が校正器サンプルとして使用されています。ISL1 に使用されるプライマーは、内因性遺伝子に特異的である。(C) TUJ1 に対する免疫染色 (赤色) および頭蓋 MN マーカー PHOX2B (6 日目) DS2U (左) と DS2U-ニップ (右) 細胞である。核は DAPI を用いて対比染色する。スケールバー = 50 μ m。(D) DS2U (上) および DS2U (下) 細胞をリアルタイム qRT PCR によって分化させる際の HB9 および PHOX2B の発現の分析。0日目が校正器サンプルとして使用されています。PCR プライマーおよび方法は、De サンティス et al., 201812に報告されている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 S3: HOX 遺伝子発現(A) 4 つの異なる HOX 遺伝子の発現の分析 (HOX A2、HOX B1、HOX A4、HOX B5) の5日後に IPSC-Nil および IPSC-NIL + RA 細胞の分化をリアルタイムで qRT PCR により行った。0日目の IPSC は、校正器サンプルとして使用されています。(B) 4 つの異なる HOX 遺伝子の発現の分析 (HOX A2、HOX B1、HOX A4、HOX B5) の5日後に IPSC-ニップおよび IPSC-ニップ + RA 細胞をリアルタイム qRT PCR により分化させる。IPSC は、校正器サンプルとして0日目のニップを使用しています。(C) PCR プライマーペア。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図 S4: ドキシサイクリン誘導分析.(A) iPSC における外因性 Ngn2 の発現のリアルタイム qRT による分析 (top) および iPSC (下) 細胞の未治療または24時間培養の異なる濃度のドキシサイクリンの存在下 (0.5 μ m, 1.0 μ m, 2.0 μ m)。Ngn2 は、外因性マウス遺伝子に特異的なプライマーを用いて分析した。NIL とニップ構造を欠いている親 iPSC ラインは、コントロールとして分析に含まれています。IPSC および iPSC におけるトランスジーンの発現は、ドキシサイクリンの非存在下で無視できした。0日目の iPSC と iPSC は、校正器サンプルとして使用されています。(B) プロトコルの指示された時点で IPSC-NIL (左) および iPSC (右) 細胞を鑑別する際の外因性 Ngn2 の発現のリアルタイム qRT による分析。Ngn2 は、外因性マウス遺伝子に特異的なプライマーを用いて分析した。0日目の iPSC と iPSC は、校正器サンプルとして使用されています。PCR プライマーおよび方法は、De サンティス et al., 201812に報告されている。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、系統特異的転写因子の異所性発現のおかげで、ヒト iPSCs を脊髄および頭蓋運動ニューロンに効率的に変換することを可能にする。これらのトランスジーンはドキシサイクリンによって誘導され、piggyBac のトランスポゾンベースのベクターのおかげでゲノムに安定的に組み込まれる。混合集団では、piggyBac ベクターの1つまたは複数のコピーが個々の細胞のゲノムにランダムに統合され、ゲノム完全性の変化のリスクが増大する。さらに、iPSC subclones の進行性の選択は、経時的に起こり、疾患および対照細胞株の分化および比較分析のための起こり得る結果を伴う。全体として、このプロトコルで得られた iPSC 由来の MNs は再生医療には不向きであろう。しかしながら、我々の方法は、インビトロ運動ニューロン疾患モデリングに特に有用であり得る。強度の主なポイントは、非常に単純化された培養条件、MN 変換の迅速性、iPSC 由来の MNs の成熟度および脊椎および頭蓋の MNs の両方を得る可能性によって表される、前述のように発現12の特異的マーカー遺伝子の解析。プロトコルの堅牢性は、その再現性によって実証されています。これまでに、このプロトコルを脊髄および/または頭蓋 MN 生成のために30回以上適用し、マーカーおよび/または機能分析によって結果を評価することに成功している。私たちは、運動ニューロン培養を最大2ヶ月間維持し、生存率を明らかに減少させました。また、一旦安定的に形質導入された iPSC 線が得られれば、新規トランスフェクションを必要とせずに、各実験をドキシサイクリン誘導によって開始することができます。ウイルスベクターも必要とされない。ここで示された代表的な結果は、electroporating iPSCs によって、材料の表に示される細胞エレクトロポレーションシステムと共に得られる。しかし、他のエレクトロポレーション方法は、代替の選択肢を表すかもしれません。逆に、我々の経験では、リポフェクション法に基づくトランスフェクションシステムは、多能性幹細胞12にとって良い選択肢ではない。プロセスの終わりに得られた細胞集団は、ほぼ独占的に MNs を構成しており、さらなる精製の必要性を回避する (例えば、FACS による)。以前に12を示したように、このプロトコルは 90% の TUJ1 陽性細胞を得ることを可能にし、そのうち 95% はニップ由来培養においても PHOX2B 陽性である。
正確に考慮に入れなければならない重要なポイントをいくつか想像することができます。まず、iPSCs の初期の個体群の質は、均質で一貫した MNs の変換を確保するために重要である。実質的な分化の割合を含む培養 (5-10% 以上)避ける必要があります。我々は、未分化 iPSCs のための維持媒体として材料の表に記載されたヒト iPSC 培地を使用してプロトコルを設定している。他の商業的に利用可能な定義された媒体は、我々が実験的に現在の仕事でこの点に対処しなかったにもかかわらず、有効で代替オプションを表すかもしれない。培地組成は、開始細胞集団の増殖速度に影響を与える可能性があるので、他の維持媒体へのプロトコルの適合は、0日目における初期密度の最適化を必要とする場合がある。トランスフェクション後、細胞を安定した細胞株にするためには、少なくとも2週間は抗生物質を選択しておくことが重要です。いくつかのアプリケーションは、piggyBac 統合の後にクローンラインを導出し、トランスジーン発現のレベルと統合部位のより良い制御の観点からより均質な集団を得るために適切であるかもしれない。0日目の細胞の密度は、培地へのドキシサイクリン添加の時間、重要なパラメータである。代表的な結果セクションで述べたように、再現性を確保するために最適の細胞密度を推定しました。他の多能性幹細胞株には異なる初期密度を必要とする場合があることを除外することはできず、重複率は個々のライン間で大幅に異なる可能性があるため、パイロット実験で経験的に決定する必要があります。Neurobasal/B27 への中型スイッチはドキシサイクリン誘導 (セクション 3.3) からの 48 h の後で起こる必要があります: 細胞が DMEM/F12 培地で2日間保持されない場合、分化はより遅く、効率が低下する可能性があります。5日目の解離は、分化細胞を強調せずに行われなければならない。細胞解離試薬 (ステップ 3.4) とのインキュベーションの時間は、バッチごとに異なる場合があり、パイロット実験では慎重に見積もる必要があります。細胞解離試薬と共にインキュベーションすると、細胞単層全体がプレートから切り離される。次に、セクション3.4 で説明されているように、ピペットで細胞の完全性を維持し、細胞培養の維持に悪影響を及ぼす可能性のある機械的ストレスを避けるために、ピペッティングによって慎重に解離する必要があります。最後に、再めっきの MNs がガラスよりも組織培養プラスチックによく付着することに気づいた。最適な細胞密着性と光学的特性を確保するポリマーカバースリップは、顕微鏡検査に基づくアプリケーションに適したオプションです。
我々の方法は、不在の運命への多能性細胞の直接の「プログラミング」を表しており、胚細胞を介して生体内開発中に MN 同一性を獲得する中間段階を示すものではないが、初期仕様のニューラル外胚葉およびdorso 腹部と rostro 尾軸に沿ったパターニング。したがって、例えば分化の根底にある分子機構を研究するためにインビトロでヒト MN 仕様をモデル化することは適さないであろう。一方、私たちのプロトコルは、さらに精製を必要とせずに、脊髄または頭蓋の MNs のかなりの量を生成することができます。達成された成熟度を考慮しても、これは運動ニューロンの神経変性疾患の分子基盤を研究するための有用なツールを表す。運動ニューロン疾患関連遺伝子における病原性変異を有する iPSC 線の一貫した数は、最後の年に科学界によって生成されてきた。MN "プログラマブル" iPSC ラインのコレクションは、そのような変異型 iPSC ラインで NIL とニップモジュールの安定した統合によって容易に生成することができます。IPSCs から得られたサイドバイサイドの頭蓋と脊髄の MNs を比較することによって、個々の MN 亜型に異なる感受性を与える細胞自律的決定基の特徴付けを、この方法の将来の応用可能性として、想像することができる。同じ遺伝的背景.さらに、最小限の操作を必要とする単純化された培養条件 (すなわち、胚様体を介して遷移することなく) で iPSCs の MNs への効果的な変換が容易に拡張可能であり、自動化されたハイスループット薬剤を大いに促進する可能性がある運動ニューロン疾患に対するスクリーニングアプローチ成人発症神経変性疾患のインビトロモデリングは、iPSC 由来ニューロン14の胎児の性質のために挑戦することができる。Progerin 過剰発現15のような iPSCs の従来の分化によって誘導される MNs の老化を加速するために考案された以前の戦略は、より良い疾患モデルを得るために我々の方法と組み合わせてもよい。
ここで記載される方法は、piggyBac ベクターによって媒介される転写因子の誘導性発現に基づいて、他の誘導細胞型に適用することができる。我々は、以前に、骨格筋細胞が BAF60c および Myod16の発現によってヒト iPSCs から得ることができることを示した。同様に、適切なプログラミング因子の集合を piggyBac 媒介的に表現することによって、他の神経亜型およびアストロサイトを含む他の細胞タイプの関心にこの方法を拡張する可能性を想像することができます。17、18、 19、20、21。
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Disclosures
著者は何も開示することはありません
Acknowledgments
著者は、サポートと技術的なアドバイスのための生命ナノサイエンス、Istituto イタリアディ Tecnologia のためのセンターでイメージング施設に感謝したいと思います。私たちは、有益な議論のための生命ナノ科学センターのメンバーに感謝しています。この作業は、AriSLA (パイロットグラント 2016 "StressFUS") から AR への助成金によって部分的にサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, with Calcium, with Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
References
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