Summary
이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포를 유도성 piggyBac 벡터에서 전사 인자의 발현에 의해 척추 또는 두개골 정체성을 가진 모터 뉴런으로 신속 하 고 효율적으로 전환 할 수 있습니다.
Abstract
우리는 여기에서 인간 유도 만능 줄기 세포 로부터 기능적 척추 및 두개골 운동 뉴런을 얻는 방법을 설명 한다 (iPSCs). 운동 뉴런으로의 직접 전환은 전사 인자의 대체 모듈, 즉 Ngn2, Isl1 및 Lhx3 (NIL) 또는 Ngn2, Isl1 및 Phox2a (닙)의 자 궁 외 발현에 의해 얻어진 다. NIL과 닙은 각각 척추와 두개골 운동 신경 정체성을 지정 합니다. 우리의 프로토콜은 NIL 또는 닙이 piggyBac 전치 벡터를 통해 게놈에 안정적으로 통합 되는 수정 된 iPSC 라인의 생성으로 시작 합니다. 트랜스 유전자의 발현은 이어서 독 시 사이 클린에 의해 유도 되 고, 5 일 후에, iPSCs를 MN 조상로 전환 한다. 이후 성숙, 7 일 동안, 척추 또는 두개골 MNs의 동종 인구에 이르게. 우리의 방법은 이전 프로토콜에 비해 몇 가지 장점을 보유: 그것은 매우 신속 하 고 단순화; 그것은 바이러스 감염이 나 추가 MN 격리를 필요로 하지 않습니다; 그것은 활동 전위의 기차를 발사 하는 능력에 의해 입증 된 대로, 성숙의 놀라운 학위와 다른 MN 하위 인구 (척추와 두개골)를 생성 할 수 있습니다. 더욱이, 다 수의 모터 뉴런은 혼합 된 집단 으로부터 정제 없이 얻어질 수 있다. iPSC 유래 척추 및 두개골 모터 뉴런은 운동 신경의 근 위축 성 측 삭 경화 증 및 기타 신경 변성 질환의 시험관 내 모델링에 사용 될 수 있다. 균질 한 운동 뉴런 집단은 세포 형 특정 약물 스크리닝을 위한 중요 한 자원을 나타낼 수 있다.
Introduction
운동 뉴런 (MN) 변성은 근 위축 성 측 삭 경화 증 (ALS)과 척추 근육 위축 (SMA)과 같은 인간의 질병에서 원인 역할을 한다. 인간 MN의 복잡성을 탈환 하는 적절 한 시험관 내 셀 모델 시스템을 확립 하는 것은 새로운 치료 접근법의 개발을 향한 중요 한 단계 이다. 유도 만능 줄기 세포 (ipscs)는 주목할 만한 복수형 다이 신 분화 특성을 부여 받고 있으며, 이제는 운동 신경 질환1,2에 의해 영향을 받는 많은 환자 로부터 유래 되었다. MN 질환에 관련 된 병원 성 돌연변이를 운반 하는 추가 iPSC 라인은 제어 "건강 한" 만능 줄기 세포 로부터 시작 하 여 유전자 편집에 의해 생성 되었다3. 이들 라인은 MNs로의 iPSC 분화를 위한 적절 한 방법이 제공 되는 경우 시험관 내 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 유용한 도구를 나타낸다. 이 방법의 개발 뒤에 이론적 근거는 성숙한 기능적인 MNs를 초래 하는 빠르고 능률적인 분화 프로토콜을 가진 MN 질병에 관심 있는 과학적인 공동체를 제공 하기 위한 것입니다. 이 방법의 첫 번째 이점은 실행 시간입니다. 또 다른 강도의 포인트는 정제 단계의 제거에서 온다. 마지막으로, 프로토콜은 모터 뉴런의 두 개의 별개의 인구를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다.
MNs의 다른 특수형을 생성 하는 가능성은 MN 질병의 모형 화를 위해 특히 관련 됩니다. 모든 MN 특수형은 ALS와 SMA에서 동등 하 게 취약 하 그리고 다른 모터 단위에 있는 현상의 개시는 크게 예 후에 영향을 미칩니다. ALS에서, 상부 및 하 부 사지에서 시작 하는 현상에 척추 발병은 약 3-5 년에서 죽음으로 이끌어 냅니다4. 반대로, 두개골 MNs의 변성으로 시작 하는 불 바 발병은 최악의 예 후를가지고 있습니다. 더욱이, 불 바 발병의 비율은 RNA 결합 단백질 인 스와 TDP-43의 돌연변이 환자에서 SOD1 돌연변이를 가진 개인 보다 현저히 높다5. 대체 MN 분화 프로토콜의 총합은 레 틴 산 (RA)의 활동에 의존 하 여 ipscs6,7,8을 차별화 하는 척추 문자를 부여 합니다. 이것은 특정 MN 특수형9,10에서 방어적 일 수 있던 본질적인 요인 연구의 가능성을 제한 합니다.
마우스 배아 줄기 세포 (11)의 이전 작업과 일치 하 여, 우리는 최근에 인간 Ipscs에서 Ngn2, Isl1 및 LHX3 (전무)의 발현이 척추 MN 동일성을 유도 하는 반면 Ngn2 및 Isl1 플러스 PHOX2A (닙)는 두개골 MNs (12)를 지정 하는 것으로 나타났다. 우리는 따라서 효율적인 프로토콜을 개발 하 여 12 일의 턴 어 라운드에서 기능적 특성을 부여 하는 인간 MNs의 생산으로 이끌어 냅니다. 이 방법의 목적은 정제 (예를 들어, FACS)에 대 한 필요 없이 짧은 시간 프레임에서, 척추 또는 두개골 동일성을 가진 MNs에 대해 고도로 농축 된 세포 집단을 구하는 것 이다.
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Protocol
1. 인간 iPSCs의 유지 보수
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매트릭스 코팅 플레이트의 제조
- 4 ° c에서 하룻밤 동안 매트릭스의 5 mL 유리병 1 개를 해 동 ( 재료 표참조) 합니다. 원래 매트릭스 주식은 다른 주식 농도에서와 서, 개별 로트에 대 한 특정 데이터 시트에 표시 된 희석 계수에 따라 만들어집니다. 이 매트릭스의 조기 겔 화를 방지 하기 위해 바이 알 및 튜브 얼음 추위를 유지 하는 것이 중요 하다. 얼음에 미리 냉장 된 저온 튜브에 매트릭스를 추출 합니다. 미사용 분 취 액을-20°c에서 고정 합니다.
- 약 2 시간 동안 얼음에 1 개를 넣고 해 동 합니다.
- 50 mL 원뿔형 튜브에서 20 mL의 콜드 DMEM/F12를 사용 하 여 매트릭스의 취 액을 희석 하십시오.
- 잘 섞어서 희석 된 매트릭스 1 mL을 35 mm의 접시에 덜어 냅니다 (다른 요리의 표면적 당 균등 한 양).
- 코팅을 허용 하기 위해 실 온에서 1 시간 동안 희석 된 매트릭스를 포함 하는 접시를 보관 하십시오.
참고: 파라 필름으로 밀봉 된 요리는 최대 2 주 동안 4°c에서 보관할 수 있습니다.
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부드러운 세포 해리 시 약의 원 액 (20ml) 및 1x 작동의 제조 ( 재질 표참조).
- 분말을 PBS에서 10 밀리 그램/mL에 녹여드 십시오.
- 필터는 0.22 μ m 필터 멤브레인을 통해 멸 균 합니다.
- 20 분의 1을 준비 하 고 20 ° c에서 보관 하십시오.
- 사용 하기 전에 PBS에 1 개를 희석 하십시오 (Ca2 +/밀리 그램+ 무료).
참고: 1 배 작업을 할 경우 최대 2 주 동안 4°c에서 보관할 수 있습니다.
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인간 iPSCs를 통행.
- 시작 하기 전에: 4°c에서 저장 하는 경우, 37 ° c에서 20-30 분 동안 인큐베이터에서 사전 따뜻한 매트릭스 코팅 플레이트 인간 iPSC 배지 ( 재료 표참조)의 양이 필요 합니다. DMEM/F12를 미리 따뜻하게 합니다.
- 흡 기 배지.
- PBS로 iPSCs를 헹 구 십시오 (2 +2 + 무료).
- 1x 부드러운 해리 용액 (0.5 35 mm 접시)을 추가 합니다. 콜로 니의 가장자리가 플레이트에서 분리 되기 시작할 때까지 37 ° c에서 배양, 일반적으로 3-5 분.
- IPSC 콜로 니를 분리 하지 않도록 조심 하면서 부드러운 해리 용액을 흡입 합니다.
- 세포를 DMEM/F12 (35 mm의 접시)로 씻고 세포를 분리 하지 않도록 주의 하십시오. 이 단계를 한 번 더 반복 합니다.
- 인간의 iPSC 배지를 추가 (35 mm 접시에 대 한 1 mL).
- 셀 리프 터로 콜로 니를 부드럽게 분리 하 고 15 mL 튜브로 이동 합니다.
- P1000 pior 3-4 시간으로 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포 덩어리를 부드럽게 분해 하십시오.
- 매트릭스 코팅 플레이트 (들) 로부터 상층 액을 흡입 한다.
- 인간 iPSC 배지의 적절 한 배양 부피에서 세포를 종자. 분할 비율은 라인 마다 다를 수 있으며 약 1:4-1:8입니다. 매일 배지를 변경 합니다.
2. NIL 및 닙 유도성 iPSC 라인의 생성
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세포 형질 감염.
- PBS로 세포를 헹 구 십시오 (2+ 2 + 무료).
- 세포 해리 시 약 ( 재료 표참조) (35 mm 접시 0.35)을 추가 하 고 단일 세포가 분리 될 때까지 37 ° c에서 배양 합니다 (5-10 분).
- P1000 pior 3-4 번을 사용 하 여 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포 분리를 부드럽게 완료 합니다.
- 15ml 튜브에 넣고 10ml에 PBS (2 +/밀리 그램2 + 무료)를 추가 합니다. 셀 수를 계산 합니다.
- 펠 렛 (전기 천공 셀 키트에 포함 된 버퍼 R의 100 μ l에서6 개의 세포와 소생 된 10p(1 개 물질 표참조).
- 형질 감염에 대 한 플라스 미드 DNA 추가: transposable 벡터의 4.5 μ g (epB-Bsd-닐 또는 epB-Bsd-TT-닙) 및 0.5 μ g의 피 gybac transposable 플라스 미드13.
- 형질 주입는 다음 매개 변수를 사용 하 여 제조업체의 지침에 따라 앞에서 설명한3 과 같이 셀 전기 천공 시스템 ( 재료 표참조)을 사용 합니다. 1200 V 전압, 30ms 폭, 1 펄스 6mm 매트릭스 코팅 접시에 10 μ m Y-27632 (락 저 해제, 물질 표참조)로 보충 된 인간 ipsc 배지에서 세포를 종자.
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항생제로 선택.
- 형질 감염 후 이틀 후, 배양 배지에 5 μ g/m l blasticidin을 첨가 한다.
- 비 형질 세포의 대부분은 blasticidin 선택의 48 시간 이내에 죽을 것 이다. 게놈에서 트랜스 유전자를 통합 하지 않은 세포를 반대 선택 하기 위해 적어도 7-10 일 동안 blasticidin의 세포를 유지 한다.
- 서로 다른 수의 트랜스 유전자와 상이한 통합 부위를 가진 세포로 구성 된 혼합 집단으로 서 안정적으로 형질 감염 된 세포를 유지 하거나 단일 클론을 격리 한다.
- 트랜스 유전자의 효과적인 발현을 확인 하기 위해 추가의 요리를 준비 하 고, 1 μ g/m l의도 자일로 핀 유도 시, Ngn2에 대 한 유전자 이식 특이 적 프라이 머를 RT-PCR에 의해 (앞으로) 역: 앞에서 설명한 바와 같이,12.
- 이 단계에서, 인간 Ipsc를 위한 냉동 매 질에서 신규 한 전무 및 닙-iPSC 라인의 주식을 동결 한다 ( 물질 표참조).
3. 모터 신경 분화
- 설명 된 대로 세포 해리 시 약으로 셀을 해리 합니다 (단계 2.1.1. 15 mL 튜브에서 해리 된 세포를 수집 하 고 DMEM의 5 볼륨/F12로 희석 하십시오. 10 μ m 록 억제제로 보충 된 인간 iPSC 배지에서 세포 및 소생을 펠 렛. 62500 셀/cm2의 밀도로 매트릭스 코팅 요리의 세포와 종자를 계산 하십시오.
- 다음날, 배지를 DMEM/F12로 교체 하 고 안정한 L-글루타민 아날로그 1x 비 필수 아미노산 (NEAA) 세포 배양 보조 제와 0.5 x 페니실린/streptomycin을 보충 하 고 1 μ g/m l doxyine을 함유 한다. 이것은 분화의 첫날 0으로 간주 됩니다. 1 일째에는 배지와 독 시 사이 클린을 새로 고칩니다.
- 2 일째에 배지를 신경 기저/B27 배지로 변경 (1x B27으로 보충 된 신경 기저 배지, 1 배 안정한 L-글루타민 아날로그, 1x NEAA 및 0.5x 페니실린/streptomycin), 5 μ m DAPT, 4 μ m SU5402 및 2 μ g/mL의도 시 사이 클린을 함유 합니다 (재료 표 참조). ). 5 일째까지 매일 배지와 독 시 사이 클린을 새로 고칩니다.
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5 일: 세포 해리 시 약으로 세포 해리 ( 재질 표참조).
- PBS로 세포를 헹 구 십시오 (2+ 2 + 무료).
- 세포 해리 시 약 (0.35 35 mm 접시)을 추가 하 고 전체 세포 단층이 접시에서 분리 될 때까지 37 ° c에서 배양 합니다. 단 하나 세포는 인큐베이션 도중 분리 되지 않을 것 이라는 점을 유의 하십시오.
- DMEM/F12 1 mL를 넣고 15 mL 튜브에 세포를 수집 합니다.
- P1000 pior 10-15 번을 사용 하 여 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포 분리를 부드럽게 완료 합니다.
- DMEM/F12의 4 mL를 추가 하 고 셀을 카운트.
- 이 단계에서, 냉동 모터 뉴런은 제조 지침에 따라 세포 동결 매체 ( 재료 표참조)에서 조상.
- 10 μ m 록 억제제로 보충 된 세포와 소생 된 뉴런 배지 (20 ng/mL BDNF, 10ng/ml GDNF 및 200 ng/ml 의L-아 스 코르 브 산을 보충 하는 것과 함께 보완 된 신경 기저/B27 배지를 펠 렛.
- 폴 리 오 르 니 틴/라미 닌 또는 대안적으로 10만 세포의 밀도에서 매트릭스 코팅 지원에 세포를 종자/cm2. 면역 염색 분석을 위한 고분자 커버 슬립 ( 재료 표참조)과 함께 µ 플라스틱 지지대를 사용 하십시오.
- 6 일째에, 록 억제제가 없는 신선한 신경 매체를 사용 하 여 배지를 변경 하십시오. 다음 날, 매 3 일 마다 미디어의 절반을 새로 고칩니다. 배양 액은 표면 으로부터의 박 리를 방지 하기 위하여 매우 신중 하 게 변경 되어야 한다.
4. 면역 염색 분석
- 세포 고정. 세포를 PBS로 헹 구 고 (Ca2+/mg2 +) 실 온에서 4% 파라 포름알데히드 (ca 2+/mg/2 +)로 15 분간배양 합니다.
주의: 파라 포 름 알 데히드는 독성이 며 암을 유발 하는 것으로 의심 됩니다. 피부와 눈에 닿지 않도록 하 고 화학 증기 두건에서 다루십시오. - 상 온에서 5 분 동안 0.1% 트리톤 X-100을 함유 하는 PBS (Ca2 이상/2 +)와의 투과.
- 항 체 차단 용액에서 상 온에서 30 분 동안 배양 하 여 Ca2 +/Mg2 +와 함께 PBS에서 3% BSA를 사용 합니다.
- 아 BS에 있는 1 차적인 항 체를 가진 상 온에서 1h를 위해 배양 하십시오: 반대로 TUJ1 (1:1000; 1:200 Oct4) 및 안티-채팅 (안티-콜린 1:150 Acetyltransferase; 재료 표를 참조 하십시오.
- 적절 한 당나귀 2 차 항 체를 사용 하 여 상 온에서 45 분 동안 배양 합니다. 안티 마우스 알 렉 사 Fluor 647 (1:250), 안티 토끼 알 렉 사 fluor 594 (1:250) 및 안티 염소 알 렉 사와 플 라 이나 488 (1:250). 재료 표를 참조 하십시오.
- 실 온에서 5 분 동안 0.4 μ g/mL DAPI를 배양 하 여 핵에 라벨을 지정 합니다.
- 형광 현미경으로 이미징 하기 위해 장착 매체 ( 재료 표참조)로 셀을 마운트합니다.
5. 패치 클램프 레코딩을 통한 기능적 특성화
- 다음과 같이 헤 지-평형 외부 용액 (NES)을 준비 합니다. 140 염화 나트륨, 2.8 mm의 CaCl2, 2Mm mgcl2, 10mm 헵 및 10mm 포도 당. 오 스몰 농도를 290-300 m ω 사이로 설정 합니다. 1N NaOH를 사용 하 여 pH를 7.3로 조정 하 고 4°c에서 용액을 저장 한다.
- 내부 솔루션 준비: 140 Mmk 글 루 콘 글 루 콘, 5mm 바 브, 2mm의 MgCl 210mm헵, 0.3 mm NA-gtp. 1M KOH로 pH를 7.3로 조정 하 고 오 스몰 농도 290 m ω으로 설정 되어 있는지 확인 합니다. 용액을-20°c에서 작은 알리 쿠 트에 고정 하십시오.
- 실험을 실행 하기 전에, 물 욕조에 NES 용액을 약 28-30 ° c로 예 열 한다.
- 일부 붕 규 산 마이크로 피 펫을 당겨 (ID 0.86 mm; OD 1.5 mm) 팁 저항 베어링: 5-6 m ω을 입력 하 고 피 펫 홀더에 장착 하기 전에 세포내 용액으로 채웁니다.
참고: 와이어 표면에 AgCl의 균일 한 층을 형성 하기 위해 적어도 30 분 동안 표 백제에 기록 전극 및 기준 전극의 염화 물은 와이어를 기억 한다. - 기록 챔버에서 페 트리 접시를 전송 하 고 1-2 m l/min에서 NES 솔루션 챔버를 보자. 용액을 따뜻하게 유지 하기 위해 30 ° c의 온도에서 설정 된 인라인 히터를 통과 하는 흐름을 보자.
- 전기 생리학적 기록 챔버를 직 립 현미경으로 배치 합니다. 패치 클램프 증폭기로 멤브레인 전류를 기록 하 고 적절 한 소프트웨어로 데이터를 수집 합니다.
- 앰프 제어 소프트웨어를 열고 값 1과 베셀 필터의 신호 게인을 10Khz로 설정 합니다. Bessel 필터가 샘플링 주파수 보다 2.5 배 낮은 지 확인 하십시오.
- 기록 소프트웨어에서 전압 클램프 및 전류 클램프 실험에 대 한 실험적 프로토콜을 설정 합니다.
- 프로토콜 설정에서 에피소드 자극 모드를 선택 하 고 샘플링 주파수를 25khz로 설정 합니다. 그런 다음 파형 탭으로 이동 하 여 전압 또는 현재 단계 진폭 및 길이를 다음과 같이 입력 합니다.
- 전압 게이팅 나트륨 전류의 경우-100 mV ~ + 40 mV (10mv 증가)에서 15 개의 전압 단계 (각각 50 밀리초)를 사용 합니다. 패치 된 셀에 적용 한 후 증폭기를 통해-60 mV의 보유 전위를 유지 한 후 프로토콜을 실행 합니다. 마찬가지로, 전압 게이팅 된 칼륨 전류는 기록 된 셀을-40 mV를 유지 하는-30mv ~ + 50 mV (10mv 증분)에서 전압 단계 (각각 250 ms 지속 시간)에 의해 유발 됩니다.
- IPSC 유래 두개골과 척추 MNs의 소성 특성을 조사 하는 경우, 전류 클램프 모드에서-70 mV의 멤브레인 전위를 사용 하 고 증가 하는 진폭 (+ 20pa ~ + 80 pA에서 4 개의 전류 펄스)을 사용할 수 있습니다.
- 각 셀 전압 활성화 전류를 획득 하 고 전체 셀 커패시턴스 (Cm), 세포 막 저항 (Rm) 및 휴식 막 전위 (RMP)로 서의 소성 활성 및 3 개의 패시브 특성을 유발 합니다.
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Representative Results
분화 방법에 대 한 개략적인 설명을 도 1에 나타내 었 다. 인체 iPSCs (WT I 라인3)는 epb-유도성 및 엡-닙으로 서,이 하에서 blasticidin 선택에 의해 생성 되 고, 안정적이 고, 그리고이 하 세포 주 (12) 들을 각각에 펙 스-닐 및 ipscs-닙에 의해 서 형질 감염 시켰다. 분화 세포는 다능 성 마커 OCT4 및 범 뉴런 마커 TUJ1의 발현을 특징으로 하였다. 면역 염색 분석은 TUJ1 양성의 부재 하에, 0 일째에 모든 세포에서 OCT4의 균일 한 발현을 나타내 었 다 (도 2A). 셋째 날, 우리는 OCT4 세포의 수에 있는 강한 감소를 관찰 하였으며,이는 iPSCs의 차별화의 하위 집합에서 TUJ1의 발현에 의해 미러링 되었습니다 (그림 2B). 5 일째에, OCT4의 발현은 TUJ1의 일관 된 발현을 나타내 었 고 뉴런 형태학을 획득 한 집단에서 관찰 되지 않았다 (도 2c). 그 후에 모터 뉴런 조상 해리 되 고 다시 도금 되어 더 성숙 됩니다. 7 일 이후 (0 일 이후 12 일), 세포를 균일 하 게 발현 TUJ1 및 성숙한 운동 뉴런 마커 (도 3). 유사한 결과는 동일한 배양 및 분화 조건 (보조도 S1 및 보조도 S2)을 사용 하 여 두 개의 추가 상용 Ipsc 라인 ( 재료 표참조)으로 얻어진 다. 마우스 ESCs (11) 로부터 전무 유도 된 모터 뉴런 들과 마찬가지로, NIL 및 닙으로 유도 된 인간 IPSCS는 hox 전사 인자의 저급을 발현 하 고 레 틴 산으로로 스트로-카우 달 축을 따라 패터 닝 될 수 있다 (보조도 S3 ).
이러한 결과는 0 일에 1 μ m의 독 시 사이 클린으로 유도 하 고 분화의 시작 시에 62500 세포/cm2 를 시 딩 하였을 때 얻어진 것 이다. 이것은 세포에 대 한 명백한 독성 없이 트랜스 유전자의 최대 유도를 달성 하기 위해 독 시 사이 클린의 최적 농도를 결과 (보충 그림 S4A). 5 일째에 독 시 사이 클린을 제거 하면 트랜스 유전자의 발현이 침묵 하였다 (보조도 S4B). 우리는 또한 프로토콜의이 시점에서 최적의 세포 밀도를 확립 하기 위해 파일럿 실험을 수행 했습니다. 우리는 병렬 분화 실험에서이 매개 변수를 변화 하는 다른 결과를 제공 하는 것으로 나타났습니다. 초기 밀도를 31250 세포/cm2로 낮추고, 세포 형태학을 관찰 하 여 평가 함에 따라 분화가 명백 하 게 정상 이었다. 그러나 우리는 5 일째 (섹션 3.4)에서 해리에 대 한 내성을 발견 하 고 후속 성숙 단계에서 생존 율을 줄였습니다. 반대로, 세포의 초기 밀도가 125000 세포/cm2로 상승 하였을 때, 우리는 전형적인 뉴런 유사 형태학의 획득 부족에 의해 평가 되는 것과 같이 비효율적인 분화를 관찰 하였다. 이것은 추가 정제 (예를 들면, FACS에 의해)를 필요로 하는 MNs의 단지 작은 분 율을 포함 하는 혼합 된 인구 귀착되 었습니다. 따라서 우리는 2 개월 이상 배양에서 생존 할 수 있는 뉴런 세포의 순수한 집단을 얻기 위해 최적의 밀도가 62500 세포/cm2임을 확립 하였다.
우리는 iPSC 닙 유래 두개골 운동 뉴런 (12)에 대해 이전에 보고 된 바와 같이 그들의 전기 생리학적 특성 (도 4)을 특성화 함으로써 ipsc NIL 유래 척추 운동 뉴런의 기능적 성숙을 평가 하였다. 패치 클램프 기록은 전압-및 전류-클램프 형식으로, 프로토콜의 MNs 성숙 단계의 7 일째에 수행 하였다 ( 도 1참조). 총 분화 시간: 12 일 이 시점에서, iPSC NIL 유래 모터 뉴런은 약간 낮은 휴식 막 전위 (-30±2mv; n=24) 및 유사한 세포 정전 용량 값 (+25±2pf; n=25)을 보였다. 그리고, 분화 된 세포의 성숙 정도를 더 깊이 특성화 하기 위해 일련의 전압 펄스로 자극을 받으면 나트륨 및 칼륨 전류를 연상 시키는 능력을 조사 했습니다. 이러한 실험에서 ipsc NIL 유래 뉴런은 전압 의존성 나트륨 전류 (그림 4c)와 전압 의존성 칼륨 전류를 성공적으로 표시 하 고 (그림 4C), 에 가까운 멤브레인 전위-20mv 및 + 50 mV 각각. Na+ 및 K+에 대 한 평형 전위는 이전에 보고 된 세포 외 및 세포내 용액과 함께 네른스트의 방정식 (www.physiologyweb.com/calculators/nernst_potential_calculator.html)을 사용 하 여 계산, 는 각각 + 110 mV 및-102 mV 였다. 또한, 전류 클램프 형식으로 고정 된 iPSC NIL 유래 MNs의 80%는 + 60 pA 이상의 전류 펄스를 주입 했을 때 스파이크 트레인을 트리거 할 수 있었다 (도 4d). 기록 된 세포의 50% 이상에서 반복적 인 발사를 유도 하는 데 필요한 최소 전류는 + 40 pA입니다. 그림 4 E). 스파이크 임계치는-37.6 ± 0.8 mV이 고 + 40 pA에서 평균 발사 주파수는 약 7.9 ± 2.2 Hz (n=18; 그림 4 F).
전반적으로, 이들 데이타는 이전에 보고 된 iPSC 닙-유래 두개골 MNs (12)와 유사 하 게, IPSC-전무 유래 척추 mns는 성숙한 뉴런의 전형적인 기능적 성질을가지고 있음을 시사 한다.
그림 1 : 운동 뉴런 분화 프로토콜. 도면은 상기 텍스트에 보고 된 기능적 분석의 시점으로 상기 piggyBac 벡터와의 안정한 iPSC 라인의 생성 으로부터, 분화 프로토콜의 개략적인 표현을 나타낸다. 프로토콜의 상이한 단계 들에서의 셀 들의 대표 상 대조 이미지 들이 도시 된다. 스케일 바 = 50 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 세포 분화에 대 한 대표적인 면역 염색 분석. iPSC-닐 및 iPSC-닙 세포는 0(a), 셋째 날 (B) 및 일의 다능 성 마커 OCT4 (자주색) 및 범 뉴런 마커 TUJ1의 발현을 위한 면역염색에 의해 분석 되었다. 핵은 DAPI와 상쇄 되었다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경 ( 재료 표참조)에서 공초점 이미지를 획득 한 것은 405 nm, 473 nm, 559 nm 및 635 nm 레이저를 장착 한 2x, 1024 x 1024 픽셀과 함께 20x NA 0.75 목표를 사용 합니다. DAPI에 대 한 필터 설정, 알 렉 사 플 루 나 594 및 알 렉 사 Fluor 647 사용 되었다. 스케일 바 = 50 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : IPSC 유래 운동 뉴런의 대표적인 면역 염색 분석. iPSC-전무 및 iPSC-닙 세포는 12 일째에 팬 뉴런 마커 TUJ1 (red) 및 운동 뉴런 마커 (acetyltransferase)의 발현을 위한 면역 염색에 의해 분석 되었다. 핵은 DAPI와 상쇄 되었다. 공초점 이미지는 도 2 의 범례에서 설명한 바와 같이 획득 되었다. 스케일 바 = 50 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 척추 및 두개골 운동 뉴런의 기능적 분석. (A) IPSC NIL 유래 척추 운동 뉴런의 전체 셀 패치 클램프의 밝은 전계 이미지. (B) 일련의 증가 전압 단계에 응답 하 여 IPSC NIL 유래 MNs에 기록 된 Na+ 전류에 대 한 대표적인 I/V 곡선 (n=26이 고 전위는-60 mV에 해당). (C) 일련의 증가 전압 단계에 응답 하 여 Ipsc NIL 유래 MNs에 기록 된 대표적인 I/V 곡선-40 mV와 동등한 전위를 유지 하는 것 이다. (D) + 60 pA의 1 초 지속 전류 주입에 대 한 대응으로 행동 전위의 열차의 대표 흔적을 유발. (E) 각 전류 펄스에서 작용 전위를 유도 하는 IPSC NIL 유래 MNs의 백분율을 나타내는 히스토그램 (n=18). (F) 히스토그램은 각각의 전류 펄스에서 상기 유발 된 발사 주파수를 표시 한다 (n=18). 전기 생리학적 기록은 직 립 현미경 하에서 수행 하였다. 멤브레인 전류 기록 시스템은 재료의 테이블에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충도 S1:에 피 솜 힙 scs를 사용 하는 MN 분화. (A) 표시 된 시점에서에 피 솜 힙-닐 (왼쪽) 및에 피 솜 힙 닙 (우측)을 차별화 하는 명시 야 이미지. 스케일 바 = 50 μ m. (B) 상기 표시 된 마커를 실시간 qrt에의 한에 피 솜 힙 스-닐 (위) 및에 피 솜 힙 닙 (하 부) 세포에 대 한 발현의 분석. 각 마커에 대해 가장 높은 표현식을 사용 하는 시간 포인트가 교정기 샘플로 사용 되었습니다. ISL1에 사용 되는 프라이 머는 내 인 성 유전자에 특이 적 이다. (C) 분화 된 팬 뉴런 마커 TUJ1 (red) 및 두개골 MN 마커 PHOX2B에 대 한 면역 염색 (좌측) 및에 피 솜 힙-닐 (우측) 세포. 핵은 DAPI와 상쇄 된다. 모든 패널에 대 한 축척 막대: 50 μ m. (D) HB9 및 PHOX2B의 발현을 실시간 qrt에의 한에 피 솜 힙-닐 (위) 및에 피 솜 힙 닙 (저) 세포에 대 한 분석. 0 일째는 교정기 샘플로 사용 되었습니다. PCR 프라이 머 및 방법은 데 산 티 스 외., 201812에 보고 되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충도 S2: DS2U iPSCs를 사용한 MN 분화. (A) 표시 된 시간 지점에서 DS2U (왼쪽) 및 DS2U (오른쪽)를 차별화 하는 명시 야 이미지 스케일 바 = 50 μ m. (B) DS2U (상부) 및 DS2U (저) 세포를 실시간 qrt로 분화 시켜 지시 된 마커의 발현을 분석 한다. 각 마커에 대해 가장 높은 표현식이 있는 시간 포인트가 교정기 샘플로 사용 되었습니다. ISL1에 사용 되는 프라이 머는 내 인 성 유전자에 특이 적 이다. (C) 분화 된 TUJ1 (적색) 및 두개골 MN 마커 PHOX2B에 대 한 면역 염색 (왼쪽) 및 DS2U 닙 (우측) 세포. 핵은 DAPI와 상쇄 된다. 스케일 바 = 50 μ m. (D) HB9 및 PHOX2B의 발현을 실시간 qrt에 의해 DS2U-닐 (위) 및 DS2U (저) 세포를 분화 시키는 분석. 0 일째는 교정기 샘플로 사용 되었습니다. PCR 프라이 머 및 방법은 데 산 티 스 외., 201812에 보고 되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 그림 S3: HOX 유전자 발현. (A) IPSC-전무 및 IPSC-닐 + RA 세포를 실시간 qrt로 분화 시킨 후 5 일 후에 4 개의 상이한 hox 유전자 (Hox A2, Hox B1, Hox4x B5)의 발현을 분석 하였다. 0 일째에 IPSC-전무는 교정기 샘플로 사용 되었습니다. (B) ipsc-닙 및 IPSC-닙 + RA 세포를 실시간 QRT PCR로 분화 시킨 후 5 일 후에 4 개의 상이한 hox 유전자 (Hox A2 호 x B1, Hox A4, Hox B5)의 발현을 분석 하였다. 0 일째에 IPSC-닙은 교정기 샘플로 서 사용 되어 왔다. (C) PCR 프라이 머 쌍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보조도 S4: 독 시 사이 클린 유도 분석. (A) 다른 농도에서의 외 인 성 Ngn2의 발현을 실시간으로 분석 한 QRT-닐 (위) 및 IPSC-닙 (맨 위) 세포를 비 처리 또는 24 시간 동안 배양 하 여 상이한 농도로도 자일 시 사이 클린의 존재 (0.5 μ m, 1.0 μ m, 2.0 μ m). Ngn2는 외 인 성 마우스 유전자에 특이 적인 프라이 머로 분석 하였다. 부모 iPSC 라인, 전무 및 닙 구조, 컨트롤으로 분석에 포함 되었습니다. IPSC-닐 및 iPSC-닙의 트랜스 유전자의 발현은 독 시 사이 클린의 부재 하에 무시할 수 하였다. 0 일째에 iPSC-전무 및 iPSC-닙은 교정기 샘플로 서 사용 되어 왔다. (B) 상기 프로토콜의 지시 된 시점에서 IPSC-닐 (left) 및 IPSC 닙 (right) 세포를 차별화 시키는 외 인 성 Ngn2 발현의 실시간 QRT-PCR에의 한 분석. Ngn2는 외 인 성 마우스 유전자에 특이 적인 프라이 머로 분석 하였다. 0 일째에 iPSC-전무 및 iPSC-닙은 교정기 샘플로 서 사용 되어 왔다. PCR 프라이 머 및 방법은 데 산 티 스 외., 201812에 보고 되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 효율적으로 인간 ipscs를 척추 및 두개골 운동 뉴런으로 변환 하 여 계보 관련 특정 전사 인자의 자 궁 외 발현을 가능 하 게 합니다. 이들 트랜스 유전자는 독 시 사이 클린에 의해 유도성 되 고, piggyBac 전치 자 기반 벡터 덕분에 게놈에 안정적으로 통합 된다. 혼합 된 집단에서, piggyBac 벡터의 하나 또는 여러 사본은 개별 세포의 게놈에 무작위로 통합 될 것이 고, 게놈 완전성 변경의 리스크를 증가 합니다. 더욱이, iPSC 서브 클론의 진보적인 선택은 분화에 대 한 가능한 결과와 질병 및 대조 군 세포 선의 비교 분석을 위해 시간이 지남에 따라 발생할 수 있습니다. 모두, iPSC-유래 MNs이 프로토콜을 얻은 재생 의학에 적합 하지 않습니다. 그러나, 우리의 방법은 생체 외 운동 신경 질환 모델링에 특히 유용 할 수 있다. 주요 강도 지점은 매우 단순화 된 배양 조건, MN 변환의 신속성, iPSC 유래 MNs의 높은 성숙도 및 이전에 입증 된 것 처럼 척추 및 두개골 MNs를 모두 얻을 수 있는 가능성으로 표현 됩니다. 특이 적 마커 유전자 발현12의 분석. 프로토콜의 견고성은 재현성으로 입증 됩니다. 지금까지 척추 및/또는 두개골 MN 생성을 위해이 프로토콜을 30 회 이상 성공적으로 적용 하 여 마커 및/또는 기능적 분석을 통해 결과를 평가 했습니다. 우리는 성공의 명백한 감소 없이 2 달까지 운동 신경 배양을 성공적으로 유지 했습니다. 더욱이, 안정 하 게 형질 도입 iPSC 라인이 얻어진 후에, 각각의 실험은 새로운 형질 감염의 필요 없이 doxy순환적 유도에 의해 시작 될 수 있다. 바이러스 성 벡터는 또한 필요 하지 않습니다. 여기에 제시 된 대표적인 결과는 물질의 표에표시 된 세포 전기 천공 시스템으로 ipscs를 전기 방사 하 여 얻어진 것 이다. 그러나 다른 전기 천공 메서드는 대체 옵션을 나타낼 수 있습니다. 반대로, 우리의 경험에서, 지방 fection에 기초한 형질 주입 시스템은 다능 성 줄기 세포 (12)에 대 한 좋은 선택이 아니다. 과정의 끝에서 얻어진 세포 집단은 추가 정제 (예를 들어, FACS)의 필요성을 피하 여 거의 독점적으로 MNs로 구성 된다. 우리가 이전에 보여준 대로12, 프로토콜 90%의 TUJ1 세포를 얻을 수 있습니다., 어느 95% 또한 닙 유래 문화권에서 긍정적인 PHOX2B.
우리는 정확 하 게 고려해 야 하는 몇 가지 중요 한 점을 생각할 수 있습니다. 첫째, iPSCs의 초기 인구의 품질은 MNs로 균질 하 고 일관 된 변환을 보장 하는 것이 중요 합니다. 분화의 실질적인 분 획을 포함 하는 배양 물 (5-10 이상) 피해 야 합니다. 우리는 미 분화 된 Ipsc에 대 한 유지 매체로 서 물질의 표에 기재 된 인간 iPSC 매체를 사용 하 여 프로토콜을 설정 하였다. 다른 상업적으로 이용 가능한 정의 된 매체는 유효한 대체 선택권을 나타낼 수 있습니다, 비록 우리가 실험적으로 현재 일에 있는이 점을 해결 하지 않았습니다. 미디어 조성 물은 시작 세포 집단의 증식 속도에 영향을 미칠 수 있으므로, 다른 유지 매체에 대 한 프로토콜의 적응은 0 일째에 초기 밀도의 최적화가 필요할 수 있다. 형질 감염 후, 안정한 세포 주를 얻기 위해 적어도 2 주간 항생제 선택 하에 세포를 유지 하는 것이 중요 하다. 일부 응용 프로그램은 이식 유전자 발현 수준과 통합 사이트의 더 나은 제어 측면에서 보다 균질 한 집단을 얻기 위해 piggyBac 통합 후 클론 라인을 도출 하는 것이 적절할 수 있습니다. 0 일째에 세포의 밀도는, 배지를 첨가 한 독 시 사이 클린의 시간, 결정적인 매개 변수 이다. 대표 결과 섹션에서 언급 한 바와 같이, 우리는 재현성을 보장 하기 위해 최적의 세포 밀도를 추정 했다. 우리는 다른 만능 줄기 세포 라인이 다른 초기 밀도를 요구할 수 있다는 것을 배제 할 수 없으며, 중복 비율은 개별 라인 사이에서 크게 변할 수 있기 때문에 파일럿 실험에서 경험적으로 결정 되어야 합니다. 신경 기저/B27에 중간 스위치는 48 후에 발생 해야 합니다 시 사이 클린 유도 (섹션 3.3): 세포가 DMEM/F12 배지에서 이틀 동안 유지 되지 않으면 분화가 느려지고 효율성이 떨어질 수 있습니다. 5 일째에 해리는 세포를 분화 하는 것을 강조 하지 않고 수행 해야 합니다. 세포 해리 시 약과의 인큐베이션 시간 (단계 3.4)은 배치 마다 다를 수 있고 파일럿 실험에서 신중 하 게 추정 되어야 한다. 세포 해리 시 약을 배양 하면 전체 세포 단층이 플레이트에서 분리 됩니다. 그런 다음, 3.4 절에 설명 된 바와 같이 파이 펫 팅으로 조심 스럽게 해리 되어 세포의 무결성을 유지 하 고 기계적 스트레스를 피하기 위해 D5를 넘어 세포 배양 유지에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 최종적으로, 우리는 다시 도금 MNs 유리 보다 조직 문화 플라스틱에 더 잘 부착 한 후 나타났습니다. 최적의 셀 부착 및 적절 한 광학 특성을 보장 하는 폴리머 커버 슬립은 현미경 기반 응용 제품에 적합 한 옵션입니다.
우리의 방법은 다능 성 세포를 MN 운명으로 직접 "프로그래밍" 하 고, 배아 세포가 신경 외 배 엽에 초기 사양과 같은 생체 내 개발 동안 MN 동일성을 획득 하는 중간 단계를 탈환 하지 않으며 도 르 소 복 부와로 스트로-카우 달 축을 따라 패터 닝. 따라서, 인간 MN 규격을 연구 하기 위해 시험관 내에서 모델링 하는 것이 적합 하지 않을 것 이며, 예를 들면, 분화를 기본으로 하는 분자 기전 이다. 다른 한편으로는, 우리의 프로토콜은 추가 정제의 필요 없이 상당한 양의 척추 또는 두개골 MNs를 생성 할 수 있습니다. 또한 달성 된 성숙 정도를 고려 하 여, 이것은 운동 뉴런의 신경 퇴행 성 질환의 분자 기초를 연구 하기 위한 유용한 도구를 나타낸다. 운동 신경 병 관련 유전자에 있는 병원 성 돌연변이를 가진 iPSC 라인의 일관 된 수는 마지막 년에 과학적인 공동체에 의해 생성 되었습니다. MN "프로그래밍 가능"의 컬렉션 iPSC 라인 따라서 쉽게 이러한 돌연변이 iPSC 라인에서 NIL 및 닙 모듈의 안정적인 통합에 의해 생성 될 수 있다. 우리는 방법의 가능한 미래 신청으로, 개별 MN 특수형에 다른 감수 성을 부여 하는 세포 자치 결정 요인의 특성화로, iPSCs에서 장악 된 나란히 두개골과 척추 MNs를 비교 하 여 생각할 수 있습니다 동일한 유전 적 배경. 더욱이, 최소한의 조작 (즉, 배 아체를 통한 전이 없이)을 필요로 하는 단순화 된 배양 조건에서 MNs로의 iPSCs의 효과적인 전환은 쉽게 확장 될 수 있고, 자동화 된 고 처리량 약물을 크게 촉진 운동 신경 질환에 대 한 스크리닝 방법. 성체-발병 퇴행 성 신경 질환의 시험관 내 모델링은 iPSC 유래 뉴런 (14)의 태아 유사 성질 때문에 까다로울 수 있다. 이전에는 progerin과 발현과 같은 종래 iPSCs의 분화로 유도 된 MNs의 노화를가속화 하기 위해 고안 된 전략은 더 나은 질병 모델을 얻기 위해 우리의 방법과 결합 될 수 있다.
여기에서 설명 된 방법은, piggyBac 벡터에 의해 매개 된 전사 인자의 유도성 발현에 기초 하 여, 다른 유도 세포 유형에 적용 될 수 있다. 우리는 이전에 골격 근육 세포가 BAF60c와 Myod의 발현에 의해 인간 iPSCs 로부터 얻어질 수있다는 것을 보여주었습니다. 유사 하 게, 우리는 다른 신경 아 류 형 및 성상 세포를 포함 하 여 관심의 다른 세포 유형으로 방법을 확장 하는 가능성을 구상 할 수 있다, 적절 한 프로그래밍 인자의세트의 piggybac 매개 발현에 의해,18, 20,21.
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Disclosures
저자는 공개할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 생명의 나노 과학 센터에서 이미징 시설에 감사 하 고 싶습니다.,이 스 티토 하세가와 디 Tecnologia, 지원 및 기술 조언을. 우리는 생명 나노 과학 센터의 회원 들에 게 도움이 되는 토론에 감사 드립니다. 이 작품은 AriSLA (파일럿 그랜트 2016 "StressFUS")의 보조금에 의해 부분적으로 AR에 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, with Calcium, with Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
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