Summary
Этот протокол позволяет быстрое и эффективное преобразование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в моторные нейроны с спинномозговой или черепной идентичности, эктопическим выражением транскрипционных факторов из индуцированных векторных переносчиков.
Abstract
Мы описываем здесь метод для получения функциональных спинномозговых и черепных двигательных нейронов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Прямое преобразование в мотонейрона получено эктопическим выражением альтернативных модулей транскрипционных факторов, а именно Ngn2, Isl1 и Lhx3 (ноль) или Ngn2, Isl1 и Phox2a (НПВ). НОЛЬ и НПВ указывают, соответственно, спинной и черепной двигательной идентичности. Наш протокол начинается с генерации измененных линий iPSC, в которых ноль или НПВ прочно интегрированы в геном через переносчик транспона. Экспрессия трансгенов затем индуцируется доксициклин и приводит, в 5 дней, к преобразованию Ипмск в MN прародителей. Последующее созревание, в течение 7 дней, приводит к однородным популяциям спинного или черепного МНБ. Наш метод имеет ряд преимуществ по сравнению с предыдущими протоколами: он чрезвычайно быстрый и упрощенный; Он не требует вирусной инфекции или дальнейшей изоляции MN; Он позволяет генерировать различные МН субпопуляции (спинной и черепной) с замечательной степенью созревания, о чем свидетельствует способность стрелять поездов потенциалов действия. Кроме того, большое количество двигательных нейронов может быть получено без очистки от смешанных популяций. iPSC-производные спинномозговых и черепных двигательных нейронов может быть использовано для экстракорпорального моделирования боковой амиотрофического склероза и других нейродегенеративных заболеваний мотонейрона. Однородные популяции мотонейронов может представлять собой важный ресурс для клеток типа конкретных обследований наркотиков.
Introduction
Двигательные нейрона (MN) дегенерация играет причинную роль в человеческих заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS) и спинальной мышечной атрофии (СМА). Создание подходящих в пробирке систем модели клеток, которые повторяют сложность человеческого MN является важным шагом на пути к разработке новых терапевтических подходов. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ипскс), наделенные замечательными дифференцированием, в настоящее время получены от ряда пациентов, страдающих заболеваниями моторных нейронов1,2. Дополнительные линии iPSC, несущие патогенные мутации, связанные с заболеваниями MN, генерируются путем редактирования генов, начиная с контроля «здоровых» плюрипотентных стволовых клеток3. Эти линии представляют собой полезные инструменты для моделирования в пробирке и скрининга лекарственных препаратов при условии, что имеются соответствующие методы дифференциации iPSC в МНБ. Обоснование развития этого метода заключается в том, чтобы обеспечить научное сообщество, заинтересованный в MN заболеваний с быстрым и эффективным протоколом дифференцировки, давая рост зрелой функциональной МНБ. Первым преимуществом этого метода является его таймфрейм исполнения. Другой соответствующий пункт прочности приходит от исключения любого шага очищения. Наконец, протокол может быть использован для создания двух различных популяций моторных нейронов.
Возможность генерации различных подтипов МНБ особенно актуальна для моделирования заболеваний MN. Не все подтипы MN одинаково уязвимы в ALS и СМА и появление симптомов в различных моторных единицах значительно влияет на прогноз. В ALS, спинного начала с симптомами, начиная с верхних и нижних конечностей приводит к смерти примерно в 3-5 лет4. И наоборот, булбарные начала, начиная с дегенерацией черепных МНБ, имеет наихудший прогноз. Более того, процент появления булбарного заболевания значительно выше у пациентов с мутациями в РНК-связывающих белках ФУС и TDP-43, чем у особей с SOD1 мутациями5. Почти совокупность альтернативных протоколов дифференциации MN опирается на активность ретиноевой кислоты (RA), которая наделяют спинного характера для дифференциации iPSCs6,7,8. Это ограничивает возможность изучения внутренних факторов, которые могут быть защитные в конкретных подтипов MN9,10.
В соответствии с предыдущей работы в мышке эмбриональных стволовых клеток11, мы недавно показали, что в человеческом iPSCs эктопического выражения Ngn2, Isl1 и LHX3 (ноль) индуцирует спинного MN идентичности, в то время как Ngn2 и Isl1 плюс PHOX2A (НПВ) определить черепной МНБ12. Поэтому мы разработали эффективный протокол, что привело к производству человека МНБ наделены функциональных свойств в 12 дней поворот. Цель этого метода заключается в получении, в короткие сроки и без необходимости очистки (например, по FACS), популяции клеток высоко обогащенный для МНБ с позвоночника или черепной идентичности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. поддержание iPSCs человека
-
Подготовка пластин с матрицей с покрытием
- Оттепель один 5 мл флакон матрицы (см. таблицу материалов) при температуре 4 °c в одночасье. Оригинальные запасы матрицы приходят на различные концентрации запасов и aliquототы производятся в соответствии с фактором разрежения указано на информационный листок, специфичный для отдельного лота. Важно держать пробирку и трубы ледяную, чтобы предотвратить преждевременное гелеобразующего матрицы. Дозировать матрицу в алкуоты в предварительно охлажденных криотрубках на льду. Замораживание неиспользованных аликуотов при температуре-20 °C.
- Поместите один Алиготе на льду около 2 ч в оттепель.
- Развести Алиготе матрицы с 20 мл холодного ДМА/F12 в 50 ml конической трубки.
- Смешайте хорошо и обойтись 1 мл разбавленной матрицы в 35 мм блюда (эквивалентные суммы на площади поверхности других блюд).
- Держите блюда, содержащие разбавленной матрицы для 1 ч при комнатной температуре, чтобы покрытие.
Примечание: Блюда, запечатанные парафильмом, можно хранить при температуре 4 ° c до 2 недель.
-
Подготовка запаса раствора (20 мл) и 1x рабочих аликуотов нежного реагента диссоциации клетки (см. таблицу материалов).
- Растворить порошок до 10 мг/мл в PBS (CA2 +/mg2 + бесплатно).
- Фильтр стерилизовать через 0,22 мкм фильтр мембраны.
- Приготовьте 20 аликуотов (по 1 мл) и храните при температуре-20 °C.
- Перед использованием, разбавить один Алиготе в PBS (CA2 +/mg2 + бесплатно) до 1 мг/мл (1x рабочих aliquототы).
Примечание: 1x рабочие aliquототы могут храниться при температуре 4 ° c до 2 недель.
-
Пассаже человеческих iPSCs.
- Перед началом: если хранится при температуре 4 ° c, предварительно теплые матрицы покрытием пластин в инкубаторе при температуре 37 ° c для 20-30 мин. предварительно теплый при комнатной температуре количество человеческих iPSC средних (см. таблицу материалов) необходимо. Предварительно прогреем ДМЕ/F12.
- Аспирин культуры среды.
- Промыть iPSCs с PBS (CA2 +/mg2 + бесплатно).
- Добавьте 1x нежное диссоциация раствор (0,5 мл для тарелки 35 мм). Инкубировать при температуре 37 ° c до краев колоний начинают отделяться от пластины, как правило, 3-5 мин.
- Аспирин нежный раствор диссоциации, будучи осторожным, чтобы не отделить iPSC колоний.
- Вымойте клетки с ДМА/F12 (2 мл для 35 мм блюдо) и аспирин быть осторожным, чтобы не отделить клетки. Повторите этот шаг еще раз.
- Добавить человека iPSC средних (1 мл для 35 мм блюдо).
- Аккуратно отделите колонии с ячейки ручка и переход на 15 мл трубки.
- Аккуратно разорвать ячейки сгустки по пипетки вверх и вниз с P1000 пиктоили 3-4 раз.
- Аспирин супернатант от матрицы покрытием пластины (ы).
- Семенной клетки в соответствующем объеме культуры человека iPSC среды. Коэффициент разделения может варьироваться от линии к линии и составляет около 1:4-1:8. Изменение среды в день.
2. поколение ноль и НПВ Индусибл линии iPSC
-
Клеточная трансфеекция.
- Промыть клетки с PBS (CA2 +/mg2 + бесплатно).
- Добавить реагента диссоциации ячейки (см. таблицу материалов) (0,35 ml для тарелки 35 mm) и инкубировать при 37 °c, пока одиночные клетки не отделяются (5-10 мин).
- Аккуратно полное разделение клеток по пипетке вверх и вниз с P1000 пикетили 3-4 раз.
- Соберите в трубку 15 мл и добавьте PBS (CA2 +/mg2 + бесплатно) до 10 мл. Считайте ячейки.
- Гранулы 106 ячеек и ресуспензируем в 100 мкл буфера R (входит в комплект электропораляции ячейки, см. таблицу материалов).
- Добавить плазмид ДНК для переливания: 4,5 мкг переносного вектора (ЭПБ-бзд-ТТ-ноль или ЭПБ-бзду-ТТ-НПВ12) и 0,5 мкг транспосэ-плазмид13.
- Transfect с клеточной электропорцией системы (см. таблицу материалов) в соответствии с инструкциями производителя и как описано ранее3 со следующими параметрами: 1 200 V напряжение, 30 MS ширина, 1 пульс. Семенные клетки в человеческом средстве iPSC дополнены 10 мкм Y-27632 (ингибитор ROCK, см. таблицу материалов) в 6-мм блюде с матрицей с покрытием.
-
Отбор с помощью антибиотиков.
- Через два дня после переливания, добавить 5 мкг/мл пресект к культуре среды.
- Большинство не трансфцифицированных клеток умрет в течение 48 h от отбора, которым будет недоволен. Держите клетки в пресблили в течение по крайней мере 7-10 дней, чтобы противостоять выбрать клетки, которые не интегрированы трансгенов в геноме.
- Поддержание стабильно трансфцированных клеток в виде смешанного населения, состоящего из ячеек с разным числом трансгенов и различных интеграционные узлы, или изолирования одиночных клонов.
- Подготовьте дополнительное блюдо для проверки на эффективное выражение трансгенов, после 1 мкг/мл индукционного доксициклин, с помощью RT-СР с трансген-специфических праймеров для Ngn2 (Форвард: TATTACACCTCCAG; Реверс: GAAGGGAGGGGCACT), как описано ранее12.
- На данном этапе замораживаем запасы романа «ноль-и щипок-iPSC» в морозильной среде для IPSC человека (см. таблицу материалов).
3. дифференцировка нейрона мотора
- Отделить клетки от клеточной диссоциации, как описано (шаги 2.1.1.-2.1.3.). Собирают диссоциированные клетки в трубке 15 мл и разбавляют 5 томами ДМЕ/F12. Гранулы клетки и ресуспензируем в человеческом средней iPSC дополнить 10 мкм ингибитор рок. Подсчет клеток и семян на матричных покрытием блюд при плотности 62 500 клеток/см2.
- На следующий день, заменить среду с ДМ/F12, дополнено 1x стабильный L-глютамина аналог, 1x не незаменимые аминокислоты (NEAA) клеток культуры дополнения и 0,5 х пенициллин/стрептомицин, и содержащие 1 мкг/мл доксициклин. Это рассмотрено как день 0 дифференцировки. В день 1, обновить среду и доксициклин.
- В день 2 Измените медиум на Нейробазальную/B27 среду (Нейробазальную среду, дополненную 1x B27, 1x стабильный L-глютамин аналог, 1x NEAA и 0,5 х пенициллин/стрептомицин), содержащий 5 мкм ДКВ, 4 мкм SU5402 и 1 мкг/мл доксициклин (см. таблицу материалов ). Обновите носитель и доксициклин каждый день до 5 дня.
-
День 5: клетки диссоциации с клеточной диссоциации реагента (см. таблицу материалов).
- Промыть клетки с PBS (CA2 +/mg2 + бесплатно).
- Добавить реагента диссоциации ячейки (0,35 mL для тарелки 35 mm) и инкубировать при 37 °C до тех пор пока весь монослой клетки не отделяется от тарелки. Обратите внимание, что одиночные ячейки не будут разделены во время инкубации.
- Добавьте 1 мл ДМЕ/F12 и соберите ячейки в трубке 15 мл.
- Аккуратно полное разделение клеток по пипетке вверх и вниз с P1000 пикетили 10-15 раз.
- Добавьте 4 мл ДМЕ/F12 и подсчитайте ячейки.
- На данном этапе, замораживание мотонейрона прародителей в камере замораживания среды (см. таблицу материалов), в соответствии с инструкциями производителя.
- Гранулы клетки и ресуспензируем в нейрональных средних (Нейробазальной/B27 средней дополнить 20 нг/мл БНФ, 10 нг/мл ГНФ и 200 нг/мл L-Аскорбиновая кислота, см. таблицу материалаs) дополнена 10 мкм рок ингибитор.
- Семенной клетки на Поли-орнитин/ламининин-или альтернативно на матричном покрытием поддерживает при плотности 100 000 клеток/cm2. Использование μ-слайд пластиковые опоры с полимерной кроя (см. таблицу материалов) для иммуноокрашивания анализа.
- На 6-ый день, измените средство с свежим нейрональная средняя лишенная ингибитора утеса. В ближайшие дни обновите половину среды каждые 3 дня. Среда культуры должна быть изменена очень тщательно для того чтобы предотвратить отрешенность от поверхности.
4. иммуноокрашивания анализ
- Фиксация клеток. Промыть клетки с PBS (с CA2 +/mg2 +) и инкубировать в течение 15 минут в 4% ПАРАФОРМАЛЬДЕГИД в PBS (с CA2 +/mg2 +) при комнатной температуре.
Осторожно: Параформальдегид токсичен и подозревается в причинении рака. Избегайте контакта с кожей и глазами и ручка под химический вытяжки дыма. - Проникая с PBS (с CA2 +/mg2 +), содержащий 0,1% тритон X-100 в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре при блокировке антител раствора (ABS: 3% БСА в PBS с CA2 +/mg2 +).
- Инкубировать для 1 ч при комнатной температуре с первичными антителами в ABS: Anti-TUJ1 (1:1000; кролик) и анти-Oct4 (1:200; мышь) или анти-чат (анти-холин ацетилтрансферазы; 1:150; коза). См. таблицу материалов.
- Инкубировать для 45 мин при комнатной температуре с соответствующим осла вторичной пары антител в ABS: анти-мышь Alexa Fluor 647 (1:250), анти-кролик Alexa Fluor 594 (1:250) и анти-коза Alexa Fluor 488 (1:250). См. таблицу материалов.
- Инкубировать в 0,4 мкг/мл DAPI для 5 мин при комнатной температуре для обозначения ядер.
- Установите клетки с монтажных средств (см. таблицу материалов) для визуализации на флуоресцентного микроскопа.
5. функциональные характеристики через патч-зажим записи
- Подготовка HEPES-equilibrated внешнее решение (РЭШ) как следующие: 140 mM Перламуговый, 2,8 mM KCl, 2 мм кактуса2, 2 мм MgCl2, 10 мм HEPES, и 10 мм глюкозы. Установите осмоллярность между 290-300 MOм. Отрегулируйте pH до 7,3 с помощью 1N NaOH и храните раствор при температуре 4 °C.
- Подготовьте внутреннее решение: 140 mM K-глюконет, 2 мм перламутр, 5 мм БАФТА, 2 мм MgCl2, 10 мм HEPES, 2 мм мг-ATP, 0,3 мм Na-GTP. Отрегулируйте рН до 7,3 с 1M Кох и убедитесь, что осмоллярность установлена на уровне около 290 м. Заморозить раствор при температуре-20 °C в небольших аликуототов.
- Перед проведением экспериментов предварительно прогреть раствор РЭШ в водяной бане примерно до 28-30 °C.
- Вытяните некоторые боросикатные микропипетки (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) подшипник сопротивления: 5-6 MОМ и заполнить с внутриклеточного раствора перед установкой в пипетки держателя.
Примечание: Не забудьте хлорид серебряные провода из записывающего электрода и опорного электрода в отбеливателя, по крайней мере 30 мин для того, чтобы сформировать единый слой AgCl на поверхности провода. - Перенесите чашку Петри в камеру записи и позвольте камере с решением NES на 1-2 mL/min. Пусть поток, проходящий через встроенный нагреватель установлен при температуре 30 ° c, чтобы сохранить раствор теплым.
- Поместите электрофизиологическую камеру записи под вертикальный Микроскоп. Запись мембранные токи с патч-зажим усилитель и получить данные с соответствующего программного обеспечения.
- Откройте программное обеспечение для управления усилителем и установите сигнал усиления в значении 1 и фильтр Бесселя на 10 кГц. Убедитесь, что фильтр Бесселя находится в 2,5 раз ниже частоты дискретизации.
- Установите экспериментальные протоколы для напряжения-зажим и ток-зажим эксперименты в записи программного обеспечения.
- В настройке протокола отметьте режим эпизодической стимуляции и установите частоту дискретизации в 25 кГц. Затем переместите на вкладку сигнала формы и наберите напряжение или текущую амплитуду шага и длину, как следует.
- Для напряжения-закрытого течения натрия, используйте 15 шагов напряжения (50 MS продолжительность каждого) от-100 мВ до + 40 мВ (10 МВ прирост). Запустите протокол после наложения на пропатчен ячейку холдинга потенциал-60 МВ через усилитель. Аналогичным образом, напряжение-закрытый калийные токи вызваны шагами напряжения (250 MS продолжительность каждого) от-30 мВ до + 50 МВ (10 МВ приращения), держащих Записанная ячейка до-40 мВ.
- Для исследования огневые свойства iPSC-производные черепных и спинальных МНБ, зажима клеток, в режиме тока-зажим, при мембранный потенциал-70 МВ и использовать 4 текущие импульсы (1 s продолжительность каждого) увеличения амплитуды (от + 20 pA до + 80 pA; 20 прирост pA).
- Приобретают для каждого клеточного напряжения-активированные токи, вызывали огневые действия и три пассивных свойства в качестве емкости цельного клетки (cm), сопротивления клеточной мембраны (RM) и потенциала мембраны покоя (RMP).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Схематическое описание метода дифференциации показано на рисунке 1. IPSCs человека (ДЦ I линия3) были трансфедифицированна с ЭПБ-бзди-ТТ-Нил или ЭПБ-БЗД-ТТ-НПВ, генерируя, после того, как недоволен отбора, стабильной и индузбл ячейки линии12, далее именуемый iPSCs-ноль и iPSCs-НПВ, соответственно. Дифференцируя клетки были охарактеризованы для выражения плюрипотентности маркер OCT4 и Пан-нейрональных маркер TUJ1. Иммуноокрашивания анализ показал равномерное выражение OCT4 во всех клетках в день 0, в отсутствие TUJ1 положительности (рис. 2A). На 3-ем день мы наблюдали сильное снижение числа OCT4-положительных клеток, зеркально отражаемое выражением TUJ1 в подмножестве дифференцирующих iPSCs (рис.2B). В день 5, никакое выражение OCT4 не было замечено в населенности, которая показала последовательное выражение TUJ1 и приобретенное нейронально морфология (Диаграмма 2C). Прародители мотонейронов затем были разъединенные и повторно покрытием для дальнейшего созревания. После 7 дней (12 дней с дня 0), клетки равномерно выражены TUJ1 и зрелый двигатель нейрона маркер чат (рис. 3). Аналогичные результаты были получены с использованием двух дополнительных коммерческих линий iPSC (см. таблицу материалов), используя те же условия культуры и дифференциации (Дополнительная диаграмма С2 и Дополнительная диаграмма S2). Аналогично Нил-индуцированных двигательных нейронов из мыши ESCs11, человека iPSCs индуцированных с нуля и НПВ выразили низкий уровень Hox транскрипционных факторов и может быть по образцу Ростро-хвостовой оси с ретиноевой кислоты (дополнительная фигура S3 ).
Эти результаты были получены, когда 62 500 клеток/см2 были посеяны в начале дифференциации и индуцированных с 1 мкм доксициклин в день 0. Это привело к оптимальной концентрации доксициклин для достижения максимальной индукции трансгенов без очевидной токсичности для клеток (дополнительная цифра S4A). При удалении доксициклин в день 5, выражение трансгенов было замолчать (дополнительная фигура S4B). Мы также провели экспериментальные эксперименты, чтобы установить оптимальную плотность клеток в этой точке протокола. Мы заметили, что варьируя этот параметр при параллельном дифференцировке экспериментов, предусмотрены различные исходы. С начальной плотностью снижена до 31 250 клеток/см2, дифференциация была по-видимому нормальным, как оценивается путем наблюдения морфологии клеток. Тем не менее, мы заметили устойчивость к диссоциации на 5-ый день (раздел 3,4) и снижение жизнеспособности в последующей фазе созревания. И наоборот, когда Начальная плотность клеток была поднята до 125 000 клеток/см2, мы наблюдали неэффективную дифференциацию, как оценивается отсутствием приобретения типичной нейроподобной морфологии. Это привело к смешанной популяции, содержащей лишь малую долю МНБ, которая нуждается в дальнейшей очистке (например, по FACS). Поэтому мы установили, что оптимальная плотность для получения чистой популяции нейрональных клеток, способных выживать в культуре более двух месяцев, составляет 62 500 клеток/см2.
Затем мы оценили функциональные созревания iPSC Нил-производные спинномозговых двигательных нейронов, характеризующие их электрофизиологические свойства (рис. 4), как сообщалось ранее для IPSC пресечь-производные черепных нейронов мотор12. Записи зажима заплаты, в любом напряжении-и режиме тока-зажима, были выполнены на 7-ое место этапа созревания МНБ протокола (см. диаграмму 1; общее время дифференциации: 12 дней) (Рисунок 4A). На данный момент, iPSC Нил-производные двигательные нейроны показали несколько ниже потенциала мембраны покоя (-30 ± 2 МВ; n = 24) и аналогичные емкости ячейки значение (+ 25 ± 2 pF; n = 25) по сравнению с ранее сообщили iPSC ПРЕСЕЧЬ-производные МНБ12. Затем, чтобы глубже охарактеризовать степень созревания дифференцированных клеток, мы исследовали их способность вызывать натриевые и калийные течения при стимуляции с помощью ряда импульсов напряжения. В этих экспериментах, IPSC Нил-производные нейроны успешно отображается напряжение-зависимых натриевых токов (рис. 4B), и напряжение-зависимых калиевых токов (рис. 4C), достигая пиковой амплитуды, когда зажатый на Мембранный потенциал вблизи − 20 МВ и + 50 МВ соответственно. Равновесного потенциала Na+ и K+, рассчитанного с использованием уравнения нернста (www.physiologyweb.com/calculators/nernst_potential_calculator.HTML) с ранее сообщенных внеклеточного и внутриклеточного решения, были + 110 МВ и-102 МВ соответственно. Кроме того, 80% от iPSC Нил-производные МНБ зажатый в текущем зажим модальности смогли вызвать всплеск поездов при введении с текущим пульсом + 60 pA или более (рис. 4D). Минимальный ток, необходимый для получения повторных стрельбы в более чем 50% записанных клеток, составлял + 40 pA (15 из 18 ячеек; Рисунок 4 E). порог всплеска был-37,6 ± 0,8 МВ и средняя частота стрельбы при + 40 PA составляла около 7,9 ± 2,2 Гц (n = 18; Рисунок 4 F).
В целом, эти данные свидетельствуют о том, что, как и ранее сообщалось iPSC НПВ-производные черепных МНБ12, IPSC-Нил-производные спинного МНБ имеют функциональные свойства типичных зрелых нейронов.
Рисунок 1 : Протокол дифференциации мотонейронов. На рисунке показано схематическое представление протокола дифференцировки, начиная с генерации стабильных линий iPSC и переносчиков с векторами, до временной точки функционального анализа, сообщенных в тексте. Показаны репрезентативные фазы контрастных изображений ячеек на разных этапах протокола. Шкала баров = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель иммуноокрашивания анализ дифференцирующих клеток. iPSC-ноль и iPSC-НПВ клетки были проанализированы иммуноокрашивания для выражения плюрипотентности маркер OCT4 (фиолетовый) и Пан-нейрональных маркер TUJ1 (красный) в день 0 (A), день 3 (B) и день 5 (C). Ядра были окрашены DAPI. Конфокальные изображения были приобретены при лазерном сканировании конфокального микроскопа (см. таблицу материалов), используя цель 20x 0,75 Na с увеличением 2x, 1024 x 1024 пикселей, оснащенное 405 нм, 473 нм, 559 нм и 635 нм лазеров. Были использованы настройки фильтра для DAPI, Alexa Fluor 594 и Alexa Fluor 647. Шкала баров = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 3 : Представитель иммуноокрашивания анализа iPSC полученных двигательных нейронов. iPSC-ноль и iPSC-НПВ клетки были проанализированы иммуноокрашивания для выражения Пан-нейрональных маркер TUJ1 (красный) и двигатель нейрона маркер чат (холин ацетилтрансферазы; зеленый) в день 12. Ядра были окрашены DAPI. Конфокальные изображения были приобретены как описано в рисунке 2 легенда. Шкала баров = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Рисунок 4 : Функциональный анализ спинномозговых и черепных двигательных нейронов. (A) Яркое поле изображение всего ячейки патч зажима на IPSC Нил-производные спинного двигателя нейрона. (B) представитель I/V кривой Na+ текущий, зарегистрированных в IPSC Нил-производных МНБ в ответ на ряд увеличения напряжения шаги (n = 26; холдинг потенциал равен-60 МВ). (C) представитель I/V кривой для K+ ЗАПИСАН в IPSC Нил-производных МНБ в ответ на ряд увеличения напряжения шаги (n = 23; холдинг потенциал равен-40 МВ). D) репрезентативные следы потенциалов действия поездов, вызванные в ответ на 1-е течение прочного текущего впрыска + 60 PA. (E) гистограмма, представляющая процентную долю МНБ, выведенные из Нила, вызывая потенциалы действий при каждом текущем импульсе (n = 18). (F) гистограмма отображения вызываемую частоту стрельбы при каждом импульсе тока (n = 18). Электрофизиологической записи был выполнен под вертикальный Микроскоп. Система записи токов мембраны указана в таблице материалов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Дополнительная фигура с: MN дифференциация с использованием Эвомальных гипс. (A) брайфилд изображения дифференциации эВ-мальных ГИПЦ-Нил (слева) и эВ-мальной ГИПЦ-НПД (справа) в указанных временных точках. Шкала баров = 50 мкм. (B) анализ экспрессии указанных маркеров в дифференцируя Эремальный ГИПЦ-Нил (вверху) и Эремальный ГИПЦ-НПВ (снизу) клетки в режиме реального времени QRT-СР. Для каждого маркера, точка времени с самым высоким выражением была использована в качестве образца калибратора. Праймеры, используемые для ISL1, специфиционны для эндогенного гена. (C) иммуноокрашивания для Пан-НЕЙРОНАЛЬНЫХ маркер TUJ1 (красный) и черепно-М.Н. маркер PHOX2B (зеленый) в дифференцированном (день 6) Эпасомный ГИПЦ-Нил (слева) и Эпамальной ГИПЦ-НПВ (справа) клетки. Ядра были окрашены DAPI. Шкала для всех панелей: 50 мкм. (D) анализ экспрессии HB9 и PHOX2B в дифференциации Эремальных ГИПЦ-Нил (вверху) и Эремальных ГИПЦ-НПД (снизу) клеток в режиме реального времени QRT-СР. День 0 использовался в качестве образца калибратора. В "де Сантис и др.", 201812, зарегистрированы и методы ЦР- Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Дополнительный рисунок S2: MN дифференцировки с использованием DS2U iPSCs. (A) брайфилд изображения ДИФФЕРЕНЦИРУЯ DS2U-ноль (слева) и DS2U-НПВ (справа) в указанных временных точках. Шкала баров = 50 мкм. B) анализ экспрессии указанных маркеров в ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩИХ DS2U-ноль (вверху) и DS2U-НПВ (снизу) ячеек в режиме реального времени QRT-СР. Для каждого маркера точка времени с наивысшим выражением использовалась в качестве образца калибратора. Праймеры, используемые для ISL1, специфиционны для эндогенного гена. (C) иммуноокрашивания для Пан-НЕЙРОНАЛЬНЫХ маркер TUJ1 (красный) и черепно-М.Н. маркер PHOX2B (зеленый) в дифференцированных (день 6) DS2U-ноль (слева) и DS2U-НПВ (справа) клетки. Ядра были окрашены DAPI. Шкала баров = 50 мкм. (D) анализ экспрессии HB9 и PHOX2B в дифференциации DS2U-ноль (вверху) и DS2U-НПД (снизу) ячеек в режиме реального времени QRT-СР. День 0 использовался в качестве образца калибратора. В "де Сантис и др.", 201812, зарегистрированы и методы ЦР- Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Дополнительный рисунок S3: выражение гена HOX. (A) анализ экспрессии четырех различных Hox генов (Hox А2, Hox B1, Hox A4, Hox В5) после пяти дней дифференциации IPSC-ноль и IPSC-Нил + RA клетки в режиме реального времени QRT-СР. IPSC-ноль в день 0 используется в качестве образца калибратора. (B) анализ экспрессии четырех различных генов Hox (Hox А2, Hox B1, Hox A4, Hox В5) после пяти дней дифференциации IPSC-НПВ и IPSC-НПВ + клетки РА в режиме реального времени QRT-СР. IPSC-НПВ в день 0 используется в качестве образца калибратора. (C) КЦР пар грунтовки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Дополнительная фигура S4: анализ индукции доксициклин. (A) анализ в реальном времени QRT-СР выражения экзогенного Ngn2 в IPSC-ноль (вверху) и IPSC-НПВ (снизу) клетки необработанных или культивировали 24 ч в присутствии доксициклин при разной концентрации (0,5 мкм, 1,0 мкм, 2,0 мкм). Ngn2 был проанализирован с праймеров специфическое для экзогенного гена мыши. Родительская линия iPSC, лишенная конструкций ноль и НПВ, включена в анализ в качестве элемента управления. Выражение трансгенов в iPSC-ноль и iPSC-НПВ был небрежным в отсутствии доксициклин. в качестве образцов калибратора используется iPSC-ноль и iPSC-НПВ в день 0. (B) анализ в режиме реального времени QRT-ЦР в выражении экзогенного Ngn2 в дифференциации IPSC-ноль (слева) и IPSC-НПВ (справа) ячейки в указанных временных точках протокола. Ngn2 был проанализирован с праймеров специфическое для экзогенного гена мыши. в качестве образцов калибратора используется iPSC-ноль и iPSC-НПВ в день 0. В "де Сантис и др.", 201812, зарегистрированы и методы ЦР- Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол позволяет эффективно преобразовывать человеческие ИППО в спинномозговую и черепную двигательные нейроны благодаря эктопическим выражению специфических факторов, связанных с линией преемственности. Эти трансгены являются Индастри по доксициклин и стабильно интегрированы в геноме благодаря переносной транспона на основе вектора. В смешанной популяции один или несколько копий вектора "Спекулябак" будут случайным образом интегрированы в геном отдельных клеток, что увеличивает риск изменений целостности генома. Кроме того, с течением времени может происходить постепенный отбор подклонов iPSC с возможными последствиями для дифференцировки и для сравнительного анализа линий заболеваний и клеток контроля. В целом, полученный iPSC МНБ, полученный с помощью этого протокола, будет непригоден для регенеративной медицины. Однако, наш метод может быть особенно полезен для моделирования болезни нейрона в пробирке. Основными точками силы являются чрезвычайно упрощенные условия культуры, быстрота МН-конверсии, высокая степень созревания полученных МНБ iPSC и возможность получить как спинной, так и черепной МНБ, что ранее продемонстрировали анализ экспрессии специфических генов маркеров12. Надежность протокола подтверждается его воспроизводимость. До сих пор мы успешно применяли этот протокол более чем в 30 раз для спинного и/или черепного поколения MN, оценивая результаты по маркером и/или функционального анализа. Мы успешно поддерживали моторные нейронами культуры на протяжении двух месяцев без очевидного снижения жизнеспособности. Кроме того, после того, как стабильно трансдукционная линия iPSC была получена, каждый эксперимент может быть начат индукцией доксициклин без необходимости новой трансфации. Вирусные векторы также не требуется. Представленные здесь репрезентативные результаты были получены электропорцией ИППО с системой электропорции клеток, указанной в таблице материалов. Однако другие методы электропорции могут представлять собой альтернативные варианты. И наоборот, по нашему опыту, системы, основанные на липофанции, не являются хорошим вариантом для плюрипотентных стволовых клеток12. Популяции клеток, полученные в конце процесса, состоят почти исключительно из МНБ, избегая необходимости дальнейшей очистки (например, по FACS). Как мы ранее показали12, протокол позволяет получать 90% TUJ1-положительных клеток, из которых 95%, где также PHOX2B положительный в НПВ производных культур.
Мы можем предусмотреть некоторые критические моменты, которые должны быть точно учтены. Во-первых, для обеспечения однородности и последовательного преобразования в МНБ решающее значение имеет качество начального населения МСКК. культуры, содержащие существенную долю дифференциации (более 5-10%) следует избегать. Мы создали протокол с использованием среды iPSC человека, описанной в таблице материалов, в качестве средства обслуживания для недифференцированных МСКС. Другие коммерчески доступные средства массовой информации могут представлять допустимые альтернативные варианты, несмотря на то, что мы не сделали экспериментально этого момента в нынешней работе. Так как состав СМИ может влиять на скорость распространения исходной клеточной популяции, адаптация протокола к другим средствам обслуживания может потребовать оптимизации исходной плотности в день 0. После переливания, важно держать клетки под выбор антибиотиков, по крайней мере 2 недели, чтобы получить стабильные клеточные линии. Возможно, для некоторых приложений было бы целесообразно извлекать клоновых линии после интеграции "Спекулябак", с тем чтобы получить более однородное население с точки зрения уровня экспрессии трансгенов и более эффективного контроля над интеграционными сайтами. Плотность клеток в день 0, время доксициклин дополнение к среде, является решающим параметром. Как упоминалось в разделе "репрезентативные результаты", мы оценили оптимальную плотность клеток для обеспечения воспроизводимости. Мы не можем исключить, что другие плюрипотентные линии стволовых клеток могут потребовать различной начальной плотности, которая должна быть эмпирически определена в экспериментальных экспериментах, так как скорость дублирования может существенно различаться между отдельными линиями. Средний переключатель для Нейробазальной/B27 должно произойти после 48 ч с момента индукции доксициклин (раздел 3,3): дифференциация может привести к замедлению и менее эффективным, если клетки не проводятся в течение 2 целых дней в ДМА/F12 среды. Диссоциация в день 5 должна выполняться без подчеркивания дифференцирующих ячеек. Время инкубации в реагенте разобщенности клетки (шаг 3,4) может отличаться от партии к партии и должны быть тщательно оценены в экспериментальных экспериментах. При высиживание с клеточной диссоциации клетки, весь монослой ячейки отделяется от пластины. Затем, он должен быть тщательно разъединение петтинг, как описано в разделе 3,4, чтобы сохранить целостность клеток и избежать механического напряжения, которые могут иметь негативное влияние на поддержание клеточной культуры за D5. Наконец, мы заметили, что после повторного покрытия МНБ придерживаться лучше на ткани культуры пластика, чем стекло. Полимерные покрылисты, обеспечивающие оптимальное соблюдение клеток и подходящие оптические свойства, являются хорошим вариантом для применения на основе микроскопии.
Наш метод представляет собой прямое "программирование" плюрипотентных клеток в судьбу MN, и не резюмировать промежуточные шаги, через которые эмбриональные клетки приобретают идентичность MN во время развития в естественных условиях, такие как начальная спецификация для нервной эктодермы и стучал по дорсо-брюшной и Ростро-хвостовой оси. Таким образом, он не будет подходить для моделирования человека MN спецификации в пробирке для изучения, например, молекулярных механизмов, лежащих в основе дифференциации. С другой стороны, наш протокол позволяет генерировать значительное количество спинного или черепного МНБ без необходимости дальнейшей очистки. Принимая также во внимание степень созревания достигнуто, это представляет собой полезный инструмент для изучения молекулярной основы нейродегенеративных заболеваний мотонейрона. В последние годы научное сообщество произвело последовательное количество линий iPSC с патогенными мутациями в генах, связанных с заболеваниями моторных нейронов. Коллекции MN "программируемые" iPSC линии могут быть поэтому легко порожденных стабильной интеграции Нил и НПВ модулей в этих мутантных линий iPSC. Мы можем предусмотреть, в качестве возможного будущего применения метода, характеристику клеток автономных детерминантов, которые придают различную восприимчивость к отдельным подтипам MN, сравнивая бок-о-бок черепного и спинного МНБ получены из iPSCs с тот же генетический фон. Кроме того, эффективное преобразование ИППО в МНБ в упрощенных условиях культуры, которые нуждаются в минимальной манипуляции (т.е. без перехода через эмбриональные тела), и что может легко масштабируемой, может значительно облегчить автоматизированную высокой пропускной способностью наркотиков Скрининговые подходы к заболеваниям моторных нейронов. В пробирке моделирование взрослых начала нейродегенеративных заболеваний может быть сложным из-за плода, как характер iPSC производные нейроны14. Предыдущие стратегии, разработанные для ускорения старения МНБ, полученные в результате обычной дифференциации МСКК, например, прогерин гиперэкспрессия15, могут сочетаться с нашим методом для получения более совершенных моделей заболеваний.
Метод, описанный здесь, основанный на индуцированного выражения транскрипционных факторов, опосредованных вектором, может быть применен к другим индуцированным типам клеток. Ранее мы показали, что клетки скелетных мышц могут быть получены от человека iPSCs по выражению BAF60c и Myod16. Аналогичным образом, мы можем представить себе возможность расширить этот метод для других типов клеток, представляющих интерес, в том числе других нейрональных подтипов и астроцитов, путем спекуляное опосредованное выражение надлежащих наборов факторов программирования17,18, 19,20,21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать
Acknowledgments
Авторы хотят поблагодарить центр визуализации в центре жизни нано науки, Isto Итальянский ди Текнологии, для поддержки и технических консультаций. Мы благодарны членам центра по жизни нано науки для полезной дискуссии. Эта работа была частично поддержана грантом Арисла (Пилотная субсидия 2016 "Стрессфус") в AR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, with Calcium, with Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco's Phosphate Buffer Saline, w/o Calcium, w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
References
- Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
- Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
- Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960 (2016).
- Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
- De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
- Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
- Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
- Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).
