Daglige lysbehandling med rødt lys til Regulate Candida albicans Biofilm vækst
Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere resultaterne af rødt lys ansøgning på væksten af Candida albicans biofilm. En ikke-kohærent rødt lys enhed med bølgelængde på 635 nm og energi tæthed af 87.6 J·cm-2 blev anvendt i hele vækst af Candida albicans biofilm for 48 h.
Abstract
Vi præsenterer her, en protokol for at vurdere resultaterne af dagpenge røde lys behandling på væksten af Candida albicans biofilm. For at øge de planktoniske vækst af C. albicans SN425, voksede inoculums på Yeast Nitrogen Base medier. Til Biofilmdannelse af blev RPMI 1640 medier, som har høje koncentrationer af aminosyrer, anvendt til at hjælpe biofilm vækst. Biofilm på 48 h blev behandlet to gange om dagen for en periode på 1 min. med en ikke-kohærent lys enhed (rødt lys, bølgelængde = 635 nm; energitæthed = 87.6 J·cm-2). Som positiv kontrol (PC), 0,12% klorhexidin (CHX) blev anvendt, og som en negativ kontrol (NC), 0,89% NaCl blev anvendt til biofilm. Kolonidannende enheder (CFU), tør-vægt, opløselige og uopløselige exopolysaccharides var kvantificeret efter behandlinger. Kort, protokol præsenteres her er enkel, reproducerbare og giver svar vedrørende levedygtighed, tør-vægt og ekstracellulære polysaccharid beløb efter rødt lys behandling.
Introduction
Den øgede forekomst af diabetes, immunsupprimerende behandling programmer, HIV-smitte, AIDS-epidemien, invasive kliniske procedurer og bredspektret antibiotika forbruget i de seneste år har øget forekomst af Candida albicans relaterede sygdomme1,2. C. albicans infektioner er almindeligvis relateret til biofilm udvikling og kan forårsage kliniske manifestationer, som candidiasis eller systemiske manifestationer, som candidemia1,2. En af de mest bemærkelsesværdige virulens faktorer af biofilm vækst er ekstracellulære polysaccharid matrix etablering. Biofilmdannelse samarbejder for at øge modstanden mod eksisterende svampemidler, miljømæssige stress og vært immun mekanismer3.
Biofilm vækst af C. albicans begynder med den tidlige overholdelse af planktoniske celler til et substrat, efterfulgt af udbredelsen af gærceller gennem substrat overflade og hyphal vækst. Den sidste fase af biofilm vækst er den modning fase, hvori gær-lignende udvikling er undertrykt, den hyphal udvikling udvider, og den ekstracellulære matrix omslutter biofilm4. C. albicans exopolysaccharides (EPS) i matrixen interagere for at danne mannan-glucan komplekse5,6. Samspillet mellem exopolysaccharides er afgørende for forsvaret af biofilm mod narkotika7. Dermed, begrænsning af EPS fra C. albicans ekstracellulære matrix kunne støtte udviklingen af nye antibiofilm protokoller for oral candidiasis kontrol.
Light regulerer vækst, udvikling og opførsel af flere organismer8 og det er blevet anvendt som et antimikrobielt i Fotodynamisk antimikrobiel kemoterapi (PACT). STABILITETSPAGTEN gælder en synligt lys af en bestemt bølgelængde og en lys-absorberende photosensitizer9. Photosensitizers har dog problemer med gennemtrængende biofilm, forårsager lavere effekt10. Terapeutiske agenter manglende fuldt infiltrere biofilm er en grund til, at biofilm lejlighedsvis modstå traditionelle antimikrobiel behandling3,5. Hvis du vil deaktivere de vedlagte mikrobielle celler, skal antimikrobielle stoffer gennemsyre gennem den ekstracellulære matrix; ikke desto mindre, EPS kendetegner en diffusional hindring for sådanne molekyler ved at spørge deres niveau af transport i biofilm eller ved at påvirke svaret af antimikrobielle med matrixen, selv11.
I betragtning af ulemperne af PAGTEN, brugen af lys i sig selv fremstår som en værdifuld forbedring. Foreløbige data viste, at behandling med blåt lys to gange om dagen betydeligt hæmmede produktionen af EPS-uopløseligt i Streptococcus mutans biofilm. Af reduktionen af EPS-uopløseligt formindsket blåt lys biofilm vækst. Ikke desto mindre, resultaterne af lysbehandling ved hjælp af rødt lys i C. albicans biofilm er knappe. Dermed, formålet med denne undersøgelse var at vurdere i hvilken måde lysbehandling ved hjælp af rødt lys påvirker vækst og arrangement af C. albicans biofilm. Til to gange daglig behandling, vi tilpasset vores laboratorium tidligere protokoller9,12 for at give en let og reproducerbare biofilm model, der leverer svar vedrørende levedygtighed, tør-vægt og ekstracellulære polysaccharider beløb efter rødt lys behandling. Samme protokol kan bruges til at teste andre behandlingsformer.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mest kritiske trin til vellykket dyrkning af C. albicans biofilm er: 1) at gøre før inokulat og inokulum i YNB medium suppleret med 100 mM glucose; 2) at vente 90 min for vedhæftning fase og omhyggeligt vaskes to gange brønde med 0,89% NaCl til at fjerne ikke-overholdt celler; og 3) at føje RPMI medium til overholdt cellerne til at starte Biofilmdannelse, da RPMI vil stimulere hyfer vækst. Aneuploidies kan opstå, når dyrkning af C. albicans. Det er derfor vigtigt ikke at bruge kolonier, der …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecilia Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. Hanne N. Janal og Dr. Iriana Zanin for udviklingen af denne undersøgelse. Vi anerkender også Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) for at donere den stamme, der er analyseret i denne undersøgelse.
Materials
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
References
- Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).
- Harriott, M. M., Noverr, M. C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).
- Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. Overcoming antifungal resistance. Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).
- Zarnowski, R., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 5, e013333 (2014).
- Mitchell, K. F., et al. Community participation in biofilm matrix assembly and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).
- Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions. PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).
- Dai, T., et al. Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).
- de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development. PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).
- Fontana, C. R., et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms. Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology. Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).
- Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).
- Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).
- Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).
- Kadosh, D., Johnson, A. D. Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis. Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).
- Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device. Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).
