Summary

Tägliche Phototherapie mit rotem Licht zu regulieren Candida Albicans Biofilm Wachstum

Published: April 23, 2019
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Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Bewertung der Ergebnisse der Rotlicht-Anwendung auf das Wachstum von Candida Albicans Biofilm. Eine nicht-kohärente Rotlicht-Gerät mit der Wellenlänge von 635 nm und Energiedichte von 87,6 J·cm-2 wurde in das Wachstum von Candida Albicans Biofilmen für 48 h angewandt.

Abstract

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Ergebnisse der Verpflegungspauschale Rotlicht Behandlung auf das Wachstum von Candida Albicans Biofilm zu beurteilen. Zur Steigerung der planktonischen Wachstums von C. Albicans SN425 wuchs der Befallsdruck auf Hefe Stickstoff Base Medien. Für Biofilmbildung waren RPMI 1640 Medien, die hohe Konzentrationen von Aminosäuren haben, angewandt, um Biofilm Wachstum zu helfen. Biofilmen von 48 h wurden zweimal täglich über einen Zeitraum von 1 min mit einem nicht-kohärente Licht Gerät behandelt (Rotlicht; Wellenlänge = 635 nm; Energiedichte = 87,6 J·cm-2). Als Positivkontrolle (PC), 0,12 % Chlorhexidin (CHX) angewendet wurde, und als Negativkontrolle (NC), 0,89 % NaCl auf die Biofilme angewendet wurde. Koloniebildenden Einheiten (KBE), trocken-Gewicht, löslichen und unlöslichen Exopolysaccharide wurden nach Behandlungen quantifiziert. Kurz, das Protokoll hier vorgestellte einfache, reproduzierbare und bietet Antworten zur Lebensfähigkeit, trocken-Gewicht und extrazelluläre Polysaccharid Beträge nach der Rotlicht-Behandlung.

Introduction

Die erhöhte Inzidenz von Diabetes, immunsuppressive Therapieanwendungen, HIV-Infektion, AIDS-Epidemie, invasive klinische Verfahren und Ausgedehntspektrum Antibiotika-Verbrauch in den letzten Jahren haben die Inzidenz von Candida Albicans erhöht im Zusammenhang mit Krankheiten1,2. C. Albicans -Infektionen sind häufig im Zusammenhang mit Biofilm Entwicklung und klinische Manifestationen, z. B. Candidose oder systemischen Manifestationen, z. B. geschwächtes1,2verursachen. Eines der bemerkenswertesten Virulenzfaktoren von Biofilm Wachstum ist die extrazelluläre Polysaccharid-Matrix-Einrichtung. Biofilmbildung arbeitet, um den Widerstand gegen bestehende Antimykotika, Umweltbelastungen und Wirt Abwehrmechanismen3zu erhöhen.

Der Biofilm-Wachstum von C. Albicans beginnt mit der frühen Einhaltung von planktonischen Zellen auf einem Substrat, gefolgt von der Vermehrung der Hefezellen durch die Substratoberfläche und Bodenaggregaten Wachstum. Die letzte Phase der Biofilm Wachstum ist die Reifungsphase, wobei hefeartigen Entwicklung wird unterdrückt, die Bodenaggregaten Entwicklung erweitert und die extrazelluläre Matrix umschließt den Biofilm-4. C. Albicans Exopolysaccharide (EPS) in der Matrix interagieren, um die Mannan-Glucan Komplex5,6bilden. Das Zusammenspiel von Exopolysaccharide ist von entscheidender Bedeutung für die Verteidigung von Biofilmen gegen Drogen-7. Daher konnte die Verringerung der EPS von C. Albicans extrazellulären Matrix die Entwicklung neuer Antibiofilm Protokolle für orale Candidiasis Steuerung unterstützen.

Licht reguliert das Wachstum, die Entwicklung und das Verhalten der verschiedenen Organismen8 und es wurde als eine antimikrobielle photodynamische antimikrobielle Chemotherapie (“Pakt”) angewandt. Pakt gilt ein sichtbares Licht einer bestimmten Wellenlänge und eine Licht-absorbierenden Photosensitizer9. Die Photosensibilisatoren haben jedoch Schwierigkeiten bei der Durchdringung des Biofilms verursacht geringere Wirksamkeit10. Das Scheitern von Therapeutika, Biofilme vollständig zu infiltrieren ist ein Grund, dass Biofilme gelegentlich traditionelle antimikrobielle Therapie3,5widerstehen. Um den geschlossenen mikrobiellen Zellen zu deaktivieren, müssen Antibiotika durch die extrazelluläre Matrix zu durchdringen; Dennoch charakterisiert die EPS ein Diffusionsprozess Hindernis für solche Moleküle durch Eingebung dem Grad ihrer Beförderung in den Biofilm oder durch Einflussnahme auf die Reaktion der antimikrobiellen mit der Matrix selbst11.

In Anbetracht der Nachteile des PAKTES erweist sich der Einsatz von Licht selbst als eine wertvolle Verbesserung. Vorläufige Daten ergab, dass die Behandlung mit Blaulicht zweimal täglich deutlich die Produktion von EPS-unlöslich in Streptococcus Mutans Biofilm gehemmt. Durch den Rückgang des EPS-unlösliche reduziertes Blaulicht Biofilm Wachstum. Die Ergebnisse der Phototherapie mit Rotlicht in C. Albicans Biofilme sind jedoch rar. Daher war das Ziel dieser Untersuchung, in welcher Weise Phototherapie mit rotem Licht das Wachstum und die Anordnung von C. Albicans Biofilm beeinflusst zu bewerten. Für die Behandlung zweimal täglich angepasst wir unser Labor vorherigen Protokolle9,12 um eine einfache und reproduzierbare Biofilm-Modell zur Verfügung zu stellen, die Antworten zur Lebensfähigkeit, liefert trocken-Gewicht und extrazelluläre Polysaccharide Beträge nach der Rotlicht-Behandlung. Das gleiche Protokoll kann andere Therapien zu Testzwecken verwendet werden.

Protocol

1. Vorbereitung von Nährmedien Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA) vorzubereiten. Aussetzen Sie, 65 g SDA mit Chloramphenicol (50 mg/L) in 1.000 mL destilliertem Wasser ergänzt. Kochen das Medium vollständig auflösen. Sterilisieren Sie durch Autoklavieren bei 15 PSI (121° C) für 30 min. kühlen, 45-50 ° C. Gut mischen und gießen Sie 20 mL der SDA in sterilen Petri Platten (Größe: 100 x 15 mm). Bereiten Sie Hefe Stickstoff Basis (YNB) Medium mit 100 mM Glukose durch das Mischen von 6,7 g YNB und 18…

Representative Results

Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse der Log10 KBE/mL von C. Albicans nach Tagessatz Behandlungen mit rotem Licht für 1 min. Rotlicht Log10 KBE/mL im Vergleich zu den NC signifikant reduziert (p = 0,004). Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse der Biomasse (mg) von C. Albicans Biofilmen nach täglichen Behandlungen. Alle Gruppen zeigten Reduktion der Biomasse im Vergleich zu den NC behandelt (p = 0….

Discussion

Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Kultivierung von C. Albicans Biofilm sind: 1) zu tun, das Pre-Inokulum und das Inokulum YNB Medium ergänzt mit 100 mM Glucose; (2) auf die Adhäsion Phase 90 min warten und sorgfältig waschen zweimal die Brunnen mit 0,89 % NaCl, entfernen von Zellen nicht eingehalten; und 3) eingehalten Zellen Biofilmbildung, starten, da RPMI Hyphen Wachstum anregen wird RPMI Medium hinzufügen. Aneuploidien können auftreten, wenn C. AlbicansKultivierung. Infolgedessen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Paula da Silveira, Dr. Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr. Malvin N. Janal und Dr. Iriana Zanin für die Entwicklung dieser Studie. Wir anerkennen auch Dr. Alexander D. Johnson (UCSF) für die Spende von der Sorte, die in dieser Studie analysiert.

Materials

Clorhexidine 20%  Sigma-Aldrich C9394
Dextrose (D-Glucose) Anhydroous Fisher Chemical D16-500
Ethanol 200 proof Decon Laboratories DSP-MD.43
LumaCare LC-122 A  LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA 
NaCl  Fisher Chemical S641-500
NaOH  Fisher Bioreagents  BP 359-500
Phenol 5% Milipore Sigma 843984
RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) Sigma R7755
Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol Acumedia 7306A
Sulfuric acid  Fisher Chemical SA200-1
Yeast nitrogen base  Difco DF0392-15-9
3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS Sigma-Aldrich M1254
 24-well polystyrene plate  Falcon 353935

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Cite This Article
Panariello, B. H. D., Garcia, B. A., Duarte, S. Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth. J. Vis. Exp. (146), e59326, doi:10.3791/59326 (2019).

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