Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以评估红光应用的结果,在白色念珠菌生物膜的生长。在白色念珠菌生物膜的整个生长过程中, 采用了波长为635纳米、能量密度为 87.6 j·cm-2 的非相干红光装置。
Abstract
在这里, 我们提出了一个协议, 以评估每日二毛鸟红光治疗的结果,对白色念珠菌生物膜的生长。为了增加白色念珠菌 sn425的浮游生长, 在酵母氮基培养基上进行了接种。对于生物膜的形成, RPMI 1640 培养基, 具有高浓度的氨基酸, 被应用于帮助生物膜的生长。用非相干光装置 (红光; 波长 = 635 nm; 能量密度 = 87.6 j·cm-2) 每天治疗48小时的生物膜, 时间为 1分钟.作为一种正对照 (PC), 采用了0.12 的氯己定 (CHX), 作为负对照 (NC), 将0.12 的氯化钠应用于生物膜。经处理后对菌落形成单位 (CFU)、干重、可溶性和不溶性外多糖进行了定量。简单地说, 这里介绍的协议是简单的, 可重复的, 并提供了有关生存能力, 干重和细胞外多糖量红光治疗的答案.
Introduction
糖尿病发病率的增加、免疫抑制治疗的应用、艾滋病病毒感染、艾滋病流行、侵入性临床程序和广谱抗生素的使用, 增加了白色念珠菌的发病率相关疾病1,2。白色念珠菌感染通常与生物膜的发育有关, 可能导致临床表现, 如念珠菌病, 或全身表现, 如念珠菌1,2。生物膜生长最值得注意的毒力因素之一是细胞外多糖基质的建立。生物膜的形成配合, 以提高对现有抗真菌药物的抵抗力, 环境压力, 和宿主免疫机制3。
白色念珠菌的生物膜生长始于浮游生物细胞早期粘附到底物上, 然后是酵母细胞通过底物表面的繁殖和菌丝生长。生物膜生长的最后阶段是成熟阶段, 其中酵母样发育被抑制, 菌丝发育扩大, 细胞外基质包裹生物膜 4.白色外多糖 (eps) 在基质中相互作用, 形成曼南葡聚糖复合物5,6。外多糖的相互作用对于防御生物膜对抗药物是至关重要的。因此,减少白色念珠菌细胞外基质的 eps 可以支持新的抗生物膜协议的发展口服念珠菌病控制。
光调节几种生物体的生长、发育和行为8它已被应用于光动力抗菌化疗 (pact) 中。PACT 应用特定波长的可见光和吸光光敏剂9。然而, 光敏剂在穿透生物膜方面存在困难, 导致效果较低 10.治疗药物不能完全浸润生物膜是生物膜偶尔抵抗传统抗菌治疗 3,5的原因。要使封闭的微生物细胞失活, 抗菌素需要渗透到细胞外基质中;然而, EPS 通过促使这些分子进入生物膜的运输水平或通过影响抗菌素对基质本身的反应11来描述这些分子的扩散障碍.
考虑到 PACT 的缺点, 光的使用本身就成为一个有价值的改进。初步数据显示, 蓝光治疗每天两次明显抑制 epps 不溶于突变链球菌生物膜的产生。由于 epps 不溶性的降低, 蓝光减少了生物膜的生长。然而, 在白色念珠菌生物膜中使用红光的光疗的结果是稀缺的。因此, 本研究的目的是评估红光光疗如何影响白色念珠菌生物膜的生长和排列。对于每天两次的治疗, 我们调整了实验室以前的方案9,12 , 以提供一个简单和可重复的生物膜模型, 提供有关活力, 干重和细胞外多糖的答案红灯处理后的金额.同样的协议也可以用来测试其他疗法。
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Protocol
1. 文化媒体的准备
- 准备萨波特葡萄糖琼脂 (SDA)。悬浮65克 SDA, 加氯霉素 (50mgl), 在 1, 000 毫升的蒸馏水中。煮沸完全溶解介质。在 15 PSI (121°C) 下高压灭菌 30分钟, 冷却至40-50°c。混合好, 倒入20毫升的 SDA 到无菌 Petri 板 (大小: 100 毫米 x 15 毫米)。
- 通过将6.7 克 YNB 和18克葡萄糖混合到 1, 000 毫升的超纯水中, 制备酵母氮碱 (YNB) 培养基, 补充 100 Mm 葡萄糖。使用搅拌器混合, 并使用0.22μm 真空过滤系统对介质进行灭菌。
- 将10.4 克 RPMI 1640 和 34.32 g 的 3-(N-morpholino) 丙磺酸 (ML) 混合到1000毫升的超纯水中, 制备 RPMI。在没有热量的搅拌机中混合, 加入 1 N NaOH (加入2克 NaOH 至50毫升超纯水), 将 pH 值调整到7。使用0.22μm 真空过滤系统对介质进行灭菌。
2. 预接种和接种
- 将微生物c. 白色 sn425从-80°c 的冰柜中取出, 让它在环境温度下解冻。种子10Μl 的股票培养在含有 SDA 的培养皿中, 辅以氯霉素 (50 mgl)。在37°c 条件下, 以有氧方式将培养皿培养48小时。
- 孵育48小时后, 在10毫升酵母氮基 (YNB) 培养基中加入10个白色念珠菌菌落, 辅以 100 mm 葡萄糖, 并在37°c 下为预接种培养16小时的有氧培养。
- 孵育16小时后, 将启动器培养稀释为新鲜 YNB 培养基, 辅以 100 mm 葡萄糖, 比例为 1:10 (在9毫升 YNB 中稀释1毫升启动培养物), 制备接种剂。测量540nm 的初始光学密度 (OD)。
- 在37°c 条件下将接种疫苗在空气中孵育 8小时, 直到菌株达到中对数生长阶段, 并在540纳米处测量最终 OD。从初始 OD 中减去最终 OD, 以检查接种的 OD 是否处于日志中生长阶段 (8 小时, 根据图 1中的生长曲线)。
- 要到达具有 107细胞 ml-1的接种器, 在 5500 x克处离心5分钟接种, 丢弃上清液, 将接种物浓缩到管体积的一半。
3. 生物膜的形成和光疗
- 在24井聚苯乙烯板的井中加入1毫升的接种剂。在37°c 下生氧 90分钟, 使细胞粘附到井底。
- 使用非相干红光 (见材料表) 作为光源, 波长为 635±10 nm, 固定输出功率为460多年厘米-2。
- 使用功率计测量光的功率密度。所施加的辐射照射为 87.6 J 厘米-2, 相当于曝光约1分钟。使用公式能量密度 (J/cm2) = 功率密度 (W/cm2) x 辐照时间 (s)。在光源和生物膜之间施加5毫米的距离, 以避免使样品变暖。
- 用0.12 氯己定治疗阳性生物膜 1分钟, 用0.12 的氯化钠治疗负控制生物膜1分钟。
- 治疗后, 用0.89 的氯化钠溶液两次清洗所有生物膜。
- 在 pH 值为7的情况下, 加入 RPMI 1640 的1毫升, 并在37°C 时在37°c 孵育板, 并在37°c 时孵育。
- 在早晨, 应用相同的处理步骤3.2 至 3.6, 洗生物膜两次与0.89 的氯化钠, 添加新的 RPMI 缓冲 mL (1 毫升, pH 值 7) 的井和孵化有氧在37°c。
- 当天, 6小时后, 将生物膜暴露在红灯下。用0.12 氯己定治疗阳性生物膜 1分钟, 用0.12 的氯化钠治疗负控制生物膜1分钟。治疗后, 用0.89 的氯化钠溶液两次清洗生物膜。
- 重复步骤 3.2-3.8, 直到达到48小时的生物膜开发。
注: 基本上, 一种治疗将发生在上午, 另一种治疗将发生在当天下午 (相距 6小时)。
4. 加工
- 在井中加入1毫升的无菌0.89 的氯化钠, 通过使用移液器尖端将生物膜从井里划掉, 以去除生物膜。将取出的生物膜加入无菌管。
- 在井中再加入1毫升的无菌0.89 的氯化钠。再次划伤, 并添加悬浮液到同一管的总体积为2毫升。
- 殖民地形成单位 (CFU)
- 强烈的涡流膜悬浮液1分钟。从生物膜悬浮液中, 使用 0.1 mL 的脂肪进行串行稀释。
- 在0.89 的氯化钠溶液中稀释从10-1到10-4 的生物膜悬浮液.
- 将每个稀释的种子50Μl 添加到 SDA 板上, 并在37°c 下孵育板48小时。
- 计数菌落, 并应用公式 Ccu/ml = 菌落数 x 10 n/q (n = 稀释; q = 播种量).
- 干重
- 称重和标签微型离心管。
- 从生物膜悬浮液中, 使用 0.1 mL 测定干重 (生物量)。
- 将1毫升的绝对乙醇加入0.1 毫升的生物膜中, 并将其储存在-20°c 18小时。18小时后, 离心机在 10, 000 x克10分钟。
- 丢弃上清液, 将管道放在干燥器上, 将样品干燥一周, 然后再次称重微离心管。
-
水溶性多糖 (Wsp) 和碱溶性多糖 (Asp)
- 从生物膜悬浮液中, 在4°c 下, 以5500xg 的速度大力旋涡剩余体积 (1.8 mL), 并以 5500xg的速度进行10分钟的涡流。将上清液存放在新管中, 用细胞清洗两次沉淀物, 细胞中含有无菌超纯水 (5, 500Xg, 4°C 时 10分钟) 细胞外基质的不溶性成分。
- 在无菌超纯水1.8 毫升处重新悬浮不溶性物质。
- 水溶性多糖 (Wsp)
注: 在通风罩上执行此实验。- 从储存的上清液中, 保留1毫升用于水溶性多糖 (Wsp) 的定量。
- 将储存的上清液均质1分钟。然后, 转移到无菌管, 并添加2.5 体积的95% 乙醇。将管材存放在-20°c 的 18小时, 以便 Wsp 降水。
- 18小时后, 在4°c 下, 以 9, 500 x克的速度离心管20分钟。离心后, 丢弃上清液。
- 用75% 乙醇清洗样品三次, 并风干颗粒。用1毫升无菌超纯水重新悬浮颗粒, 并采用酚-硫酸法量化 WSP。
- 使用0.1% 葡萄糖 (0.01 g 葡萄糖到10毫升的超纯水) 的标准曲线 (0, 2.5, 5, 10, 15, 20 和25μl 的葡萄糖每管)。
- 将200μl 的5% 苯酚 (2.7 mL 的90% 苯酚至47.3 毫升的超纯水) 添加到由200Μl 的样品或标准曲线点 (每个样品三分位) 组成的玻璃管中, 并谨慎混合。
- 在试管中加入1毫升硫酸, 搅拌均匀。等待20分钟的反应, 并使用分光光度计 (490 nm) 测量样品。
- 碱溶性多糖 (Asp)
注: 在通风罩中执行此实验。- 从不溶性的重悬浮量中, 分别分离1毫升以测定 Asp。在4°C 条件下, 将每个生物膜悬浮液的等价物离心 (13, 000 x 克, 10分钟)。
- 小心地去除每个管的上清液。然后将样品放在真空集中器上, 使颗粒干燥。
- 称量颗粒, 每1毫克干重, 加入30μl 的 1 n NaOH (2 克 NaOH 至50毫升的超纯水)。在37°c 下将其培养 2小时, 然后在 13, 000 x g下离心10分钟。
- 小心地用移液器收集上清液, 转移到微离心管, 保持颗粒。
- 再次, 在包含颗粒的管中添加相同体积的 1 N NaOH, 并重复与上面相同的步骤提取 asp。
- 孵育2小时后, 将样品 (13, 000 x g)离心 10分钟, 仔细收集上清液, 并添加到以前收集的上清液中。
- 对于第三次提取, 重复上述步骤, 但这一次, 在离心前不要孵育样品2小时。
- 然后, 在每个样品中添加三卷95% 的乙醇。然后, 将样品在-20°c 下储存 18小时, 以进行 ASP 的沉淀。
- 离心管 (9, 500xg ,在4°c 下 20分钟), 并丢弃上清液。
- 用75% 乙醇和风干的方法将每个颗粒洗三次 (WSP 的程序也是如此)。用 1 N NaOH 在第一次提取的相同体积内重新悬浮颗粒。
- 阅读使用酚-硫酸对 ASP 进行定量的示例 (与 WSP 分析相同)。
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Representative Results
图 2显示了白化病的日志10 cfu/ml 的结果后, 每日每日处理每日津贴与红光 1分钟.图 3显示了每日治疗后白色念珠菌生物膜的生物量 (mg) 的结果。与 NC (p = 0.000) 相比, 所有处理组的生物量都有所减少, 红光处理组的生物量减少与 PC 中观察到的减少相似。图 4和图 5显示, 与 nc (p = 0.000) 相比, 白色念珠菌可溶性 c. ps 溶于 pc, 而 eps 不溶于 pc。尽管在统计学上并不显著, 但每天使用的红光为1分钟至白色念珠菌生物膜, 但在数值上减少了 epps 可溶性和 eps 不溶性的量。
图 1.白色念珠菌株 sn 425 的生长曲线。在 YNB 培养基中培养了植物素, 辅以 100 mM 的葡萄糖, 并在37°c 下孵育。随着时间的推移, 确定了光学密度 (540 纳米的 OD) 和 Log10 chuml。显示标准偏差。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2. 白色念珠菌记录 10 chu/ml 的平均值和标准偏差.在每天两次红光治疗与控制-0.12 CHX (PC) 和 0.12 Ncl (NC) 之间进行了评估。等号表示各组之间的统计相似性 (p > 0.05)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3.白色念珠菌干重 (mg) 的平均值和标准偏差. 在每天两次红光治疗与控制-0.12 CHX (PC) 和 0.12 Ncl (NC) 之间进行了评估。等号表示各组之间的统计相似性 (p > 0.05)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4.白色生物膜中 epps 可溶性含量的平均值和标准偏差 (干重的μgg/mg).对每天两次红光处理与控制量-0.12 CHX (PC) 和 0.12 Ncl (NC) 进行了比较。等号表示各组之间的统计相似性 (p < 0.001)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5.白色生物膜中 epps 不溶性含量的平均值和标准偏差 (干重μgmg).在每天两次红光治疗与控制-0.12 CHX (PC) 和 0.12 Ncl (NC) 之间进行了评估。等号表示各组之间的统计相似性 (p < 0.001)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
成功培养白色念珠菌生物膜最关键的步骤是: 1) 在 ynb 培养基中进行预接种和接种, 辅以 100 mm 葡萄糖;2) 在粘附阶段等待 90分钟, 用0.89 的氯化钠仔细清洗两次井, 去除不粘的细胞;3) 在粘附细胞中加入 RPMI 培养基, 开始生物膜的形成, 因为 RPMI 会刺激菌丝生长。在养殖白色念珠菌时, 可能会发生非上传物。因此, 重要的是不要使用超过7天的菌落, 不要将盘子存放在 4°C, 也不要从现有的盘子中重新排列细胞。同样, 应在隔夜生长18小时前使用菌株 13.
研究的局限性是, 它是在体外进行的。虽然体外研究大大增加了对生物膜生物学的了解, 但它们并不准确地代表体内条件14。然而, 体外测试除了提供了一种廉价而简单的方法14外, 还提供了高通量筛选, 以回答有关新的抗菌素疗法的问题。为生物膜开发的每个阶段选择正确的培养基是该方法成功的重要一步。RPMI 1640 是一种营养丰富的培养基, 具有氨基酸并模拟人体液体的组成 15.RPMI 1640 含有 l-谷氨酰胺、l-精氨酸、l-天冬氨酸以及维生素和无机盐。然而, 与 RPMI 1640 培养基 (2 gl 葡萄糖) 相比, YNB 培养基的葡萄糖含量 (18gl) 较高。高葡萄糖含量已被描述为增加念珠菌16 种的浮游生长.与 YNB 培养基16相比, 较高浓度的氨基酸的存在将有助于 RPMI 培养基中生物膜的生长.应用 SEM 显微图像的定性数据表明, RPMI 中白色念珠菌生物膜的结构设计呈现出一个复杂的组织, 具有稳定的酵母生长, 具有压化菌丝、萌发元素和疤痕芽, 具有丰富的含量细胞外基质16。这些结果与先前的一项研究一致, 该研究报告说, RPMI 1640 增强了白色念珠菌生物膜15中的菌丝形成。这些结果表明, 在不同的生物膜生长阶段,念珠菌在底物利用方面存在差异, 并表明在浮游生长和生物膜形成过程中改变介质的重要性。
选择正确的温度和 pH 值来培养白色念珠菌生物膜, 对于充分形成菌丝来完成该方法也很重要。白色念珠菌在模仿哺乳动物宿主组织环境的条件下, 进行从囊胚转变为细丝 17.这些条件涉及在体温 (37°c) 和中性 pH 值17下生长, 这就是 RPMI 介质的ph 值调整为7的原因。
本研究采用的方法意义重大,因为白色念珠菌sn 425 的生物膜在12以前就有了表征, 表明它具有大量的 eps 可溶性和-不溶性, 使其成为分析光的结果的可靠方法在细胞外多糖上此外, 实验中应用的相同非相干光装置成功地应用于细菌浮游生物悬浮液18和生物膜9, 该装置的最大优点是缩短了处理时间, 是什么原因使设备更可行的临床应用18。对白色念珠菌生物膜的日常光疗进行分析具有重要意义, 因为本研究中采用的方法模拟了一种快速且可由患者在家中轻松进行的治疗。
红光日常治疗有意义地减少了白色念珠菌的生存菌落计数和生物膜生物量。更多的研究可能会尝试的治疗组合, 从光疗开始, 后来应用局部抗真菌。这种策略可能有助于分解细胞外基质屏蔽白色念珠菌生物膜, 允许更好的药物渗透通过生物膜到达, 并最终根除白色念珠菌细胞。考虑到这种体外实验的局限性, 使用红光1分钟可能有助于对治疗口腔念珠菌病的话题抗真菌药的佐剂。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Paula da Silveira 博士、Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa 博士、Shawn m. Maule、Shane m. Maule、Malvin N. Janal 博士和 Iriana Zanin 博士开展这项研究。我们也感谢亚历山大·约翰逊博士 (UCSF) 捐赠了这项研究中分析的毒株。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
References
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