Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את התוצאה של יישום באור אדום הצמיחה של קנדידה אלביקנס biofilm. מכשיר האור הלא קוהרנטי אדום עם אורך הגל של 635 nm, צפיפות האנרגיה של 87.6 J·cm-2 הוחל ברחבי הצמיחה של קנדידה אלביקנס biofilms במשך 48 שעות.
Abstract
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את התוצאות של אש באור אדום טיפול על צמיחת קנדידה אלביקנס biofilm. כדי להגדיל את צמיחת פלנקטוניים אלביקנס ג SN425, inoculums גדל על בסיס חנקן שמרים מדיה. עבור ביופילמים, מדיה RPMI 1640, אשר יש ריכוזים גבוהים של חומצות אמינו, הוחלו לעזור biofilm צמיחה. Biofilms של 48 שעות טופלו פעמיים ביום למשך תקופה של 1 דקה עם מכשיר האור הלא קוהרנטי (אור אדום; אורך גל = 635 ננומטר; צפיפות אנרגיה = 87.6 J·cm-2). כמו פקד חיובי (PC), 0.12% chlorhexidine (CHX) היה מוחל, וכפי פקד שלילי (NC), 0.89% NaCl היה מוחל על biofilms. המושבה יוצרי יחידות (CFU), exopolysaccharides משקל יבש, מסיסים ובחלקם לא מסיסים היו לכמת לאחר טיפולים. בקצרה, פרוטוקול המובאת כאן היא פשוטה, לשחזור ומספק תשובות לגבי הכדאיות, רב-סוכר משקל יבש, חוץ-תאית כמויות לאחר טיפול באור אדום.
Introduction
שכיחות מוגברת של סוכרת, טיפול לדיכוי המערכת החיסונית יישומים, הידבקות ב- HIV, מגפת האיידס, הליכים פולשניים קליניים צריכת אנטיביוטיקה רחבת-טווח השנים האחרונות הגדילו את השכיחות של קנדידה אלביקנס הקשורים במחלות1,2. זיהומים אלביקנס ג בדרך כלל קשורים להתפתחות biofilm, עלול לגרום הביטויים הקליניים, כגון קנדידה או ביטויים מערכתית, כגון candidemia1,2. אחד הגורמים התקפה אלימה הבולטת ביותר של צמיחה biofilm הוא הממסד מטריצה חוץ-תאית רב-סוכר. ביופילמים משתף פעולה כדי להגדיל את ההתנגדות הקיימת תרופות נגד פטריות, עקה של מנגנונים חיסוניים מארח3.
צמיחת biofilm אלביקנס ג מתחיל עם הדבקות מוקדם של תאים פלנקטוניים מצע, ואחריו התפשטות של תאי שמרים דרך משטח המצע, צמיחה hyphal. השלב האחרון של צמיחה biofilm הוא שלב ההבשלה, שבה, כמו שמרים פיתוח מדוכא מרחיבה את ההתפתחות hyphal, מטריצות יקיף את biofilm4. Exopolysaccharides אלביקנס ג (EPS) המטריצה אינטראקציה כדי ליצור את מנן-גלוקן מורכב5,6. האינטראקציה של exopolysaccharides חיוני להגנה על biofilms נגד סמים7. לפיכך, ההפחתה של EPS של מטריצות אלביקנס ג יכול לתמוך בפיתוח של פרוטוקולים antibiofilm חדשים לבקרת בפה.
אור מווסת צמיחה, התפתחות, התנהגות של אורגניזמים מספר8 , שהוחלה כמו מיקרוביאלית כימותרפיה פוטודינמי מיקרוביאלית (ברית). ההסכם חל על אש גלויה של גל מסוים ו פוטוסנסיטייזר אור קליטת9. אולם, photosensitizers יש קשיים בחדירה של biofilm, גורם היעילות נמוכה10. הכישלון של סוכני טיפולית לחדור biofilms מלא הוא סיבה biofilms להתנגד לעתים טיפול מיקרוביאלית מסורתי3,5. כדי לבטל את תאי חיידקים סגורה, antimicrobials צריך לחדור דרך מטריצה חוץ-תאית; יחד עם זאת, קובצי EPS מאפיינת מכשול diffusional עבור מולקולות כאלה על-ידי המבקשת רמתם של הכרכרה לתוך biofilm או המשפיעים על התגובה של מיקרוביאלית עם המטריצה עצמה11.
בהתחשב החסרונות של ההסכם, מתגלה השימוש באור בפני עצמו שיפור רב ערך. המידע הראשוני חשף כי הטיפול באור כחול פעמיים ביום באופן משמעותי עכבות הייצור של EPS-לא מסיס ב biofilm mutans סטרפטוקוקוס . על ידי הירידה של EPS-לא מסיס, אור כחול פחתה biofilm צמיחה. עם זאת, התוצאות של פוטותרפיה באמצעות אור אדום ב ג אלביקנס biofilms נדירים. לפיכך, מטרת החקירה היה שיש לחשב מה פוטותרפיה באופן באמצעות אור אדום השפעות את הצמיחה ואת סידור biofilm אלביקנס ג . על הטיפול פעמיים ביום, שינינו של המעבדה שלנו הקודם פרוטוקולים9,12 לספק מודל biofilm לשחזור וקלה המספק תשובות לגבי הכדאיות, פוליסכרידים משקל יבש, חוץ-תאית כמויות לאחר טיפול באור אדום. ניתן להשתמש באותו הפרוטוקול לבדיקות טיפולים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת תרבות המדיה
- להכין sabouraud דקסטרוז אגר (SDA). להשעות 65 גר' SDA בתוספת כלורמפניקול (50 מ"ג/ליטר) ב- 1,000 מ ל מים מזוקקים. מרתיחים להתמוסס המדיום לחלוטין. לחטא על ידי autoclaving ב 15 PSI (121 מעלות צלזיוס) במשך 30 דקות מגניב ל 45-50 מעלות צלזיוס. מערבבים היטב ויוצקים 20 מיליליטר SDA לתוך צלחות פטרי סטריליות (גודל: 100 מ"מ x 15 מ"מ).
- הכנת שמרים חנקן הבסיס (YNB) בינוני בתוספת 100 מ מ גלוקוז על ידי ערבוב 6.7 גרם של YNB ו- 18 גרם דקסטרוז 1,000 מ של מים הנדסה גנטית. לערבב שימוש קדירות, לעקר את המדיום באמצעות מערכת מסנן ואקום 0.22 מיקרומטר.
- הכן RPMI על ידי ערבוב 10.4 גרם של RPMI 1640, 34.32 גר' 3-(N-מורפולינו) propanesulfonic חומצה (MOPS) 1,000 מיליליטר מים הנדסה גנטית. לערבב תוך בחישה ללא חום, להתאים את רמת ה-pH 7 על-ידי הוספת 1 N NaOH (להוסיף 2 גרם של NaOH עד 50 מ"ל של מים הנדסה גנטית). לעקר את המדיום באמצעות מערכת מסנן ואקום 0.22 מיקרומטר.
2. קדם inoculum ו- inoculum
- הסר בקטריה SN425 אלביקנס ג מהמקפיא ° C −80 ולתת לו להפשיר בטמפרטורת החדר. זרע µL 10 של התרבות מניות בפטרי המכילות SDA בתוספת כלורמפניקול (50 מ"ג/ליטר). דגירה של צלחות פטרי aerobically ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
- לאחר 48 שעות של דגירה, להוסיף 10 מושבות אלביקנס ג 10 מ"ל של חנקן שמרים בינוני (YNB) בסיס בתוספת 100 מ מ גלוקוז, דגירה aerobically ב 37 ° C עבור ה 16 עבור inoculum מראש.
- לאחר המקננת עבור 16 h, להכין את inoculums על ידי דילול התרבויות starter לתוך בינוני YNB טרי בתוספת 100 מ מ גלוקוז ב- 1:10 פרופורציה (1 מ"ל של התרבות starter מעורבבת עם 9 מ של YNB). למדוד את הצפיפות האופטית הראשונית (OD)-540 nm.
- דגירה של inoculums aerobically ב 37 מעלות צלזיוס במשך 8 שעות עד הזנים להגיע שלב הצמיחה יומן אמצע ולמדוד OD הסופי-540 nm. להחסיר OD הסופי מ OD הראשונית כדי לבדוק אם OD של inoculums הן על שלב הצמיחה יומן אמצע (8 שעות, בהתבסס על העקומות צמיחה באיור1).
- כדי להגיע inoculum עם 107 תאים מ ל-1, centrifuge את inoculum במשך 5 דקות ב 5,500 x g, למחוק את תגובת שיקוע ולרכז את inoculum חצי נפח של הצינורות.
3. ביופילמים, פוטותרפיה
- להוסיף 1 מ"ל של inoculum הבארות של צלחת 24-ובכן פוליסטירן. דגירה aerobically ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות לאפשר תא אדהזיה לתחתית הבארות.
- השתמש אדום הלא קוהרנטי אור (ראה טבלה של חומרים) כמקור אור באורך גל של nm ± 10 635, כוח פלט קבוע של mW 1,460 ס מ−2.
- השתמש מד כוח למדידת צפיפות הכוח של האור. החשיפה קורן חלה הוא 87.6 J ס מ-2, שקול לבערך 1 דקות של חשיפה. להשתמש בנוסחה צפיפות אנרגיה (J/cm2) = כוח צפיפות (W/cm2) x זמן הקרנה (s). להחיל על מרחק של 5 מ מ בין מקור האור של biofilm כדי למנוע התחממות המדגם.
- לטיפול biofilms בקרה חיובית עם chlorhexidine 0.12% עבור 1 דקות, שליטה שלילי biofilms עם 0.89% NaCl עבור 1 דקות.
- לאחר טיפולים, לשטוף כל biofilms פעמיים עם 0.89% NaCl פתרון.
- להוסיף 1 מ"ל של RPMI 1640 באגירה מלאה עם 3-(N-מורפולינו) propanesulfonic חומצה (MOPS) ב- pH 7 כדי biofilms דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- בבוקר, להחיל את הטיפולים אותו כמו צעדים 3.2-3.6, לשטוף biofilms פעמיים עם 0.89% NaCl, להוסיף RPMI חדשים באגירה מלאה עם מגבים (1 מ"ל, pH 7) לבארות, דגירה aerobically ב 37 º C.
- באותו יום, לאחר 6 שעות, לחשוף biofilms לאור אדום. לטיפול biofilms בקרה חיובית עם chlorhexidine 0.12% עבור 1 דקות, שליטה שלילי biofilms עם 0.89% NaCl עבור 1 דקות. לאחר טיפולים, לשטוף biofilms פעמיים עם 0.89% NaCl פתרון.
- חזור על השלבים 3.2-3.8 עד להשגת h 48 biofilm הפיתוח.
הערה: בעיקרון, טיפול אחד יקרה בבוקר, והשני יקרה בשעות אחר הצהריים באותו יום (6 h בנפרד).
4. עיבוד
- להוסיף 1 מ"ל של סטרילי 0.89% NaCl אל הבאר כדי להסיר את biofilm מאת לשרוט אותה היטב באמצעות טיפ פיפטה. הוסף את biofilm שהוסר צינור סטרילי.
- להוסיף עוד 1 מ"ל של סטרילי 0.89% NaCl אל הבאר. לגרד את זה שוב ומוסיפים את המתלים הצינור זהה עבור הנפח הכולל של 2 מ.
- המושבה יוצרי יחידות (CFU)
- נמרצות מערבולת ההשעיה biofilm עבור 1 דקות. מהשעיה biofilm, להשתמש aliquot של 0.1 מ"ל דילול טורי.
- לדלל את המתלים biofilm מ 10-1 ל 10-4 פתרון 0.89% NaCl.
- זרע μL 50 של כל דילול ללוחות SDA, דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות.
- לספור את המושבות ולהחיל את הנוסחה CFU/מ"ל = מספר מושבות x 10n / q (n = דילול; q = נפח הזריעה).
- משקל יבש
- שוקלים ותווית microcentrifuge צינורות.
- המתלה biofilm, השתמש 0.1 מ"ל לקביעת משקל יבש (ביומסה).
- להוסיף 1 מ"ל אתנול מוחלטת aliquot של 0.1 מ"ל של biofilms ואחסן אותו ב-20 ° C עבור 18 h. לאחר 18 h, צנטריפוגה ב 10,000 x g למשך 10 דקות.
- למחוק את תגובת שיקוע, מקום הצינורות על desiccator כדי לייבש את הדגימות לשבוע אחד. ולשקול את הצינורות microcentrifuge שוב.
-
סוכרים מסיסים במים (WSPs), סוכרים מסיסים אלקלי (האישיות)
- מ biofilm ההשעיה, נמרצות מערבולת השארית של אמצעי האחסון (1.8 מ ל) 1 דקות, צנטריפוגה ב 5,500 × g 10 דקות ב 4 º C. לאחסן את תגובת שיקוע צינור ולשטוף את התמיסה פעמיים עם התאים, אשר מכיל את המרכיבים קשי תמס של מטריצות במים הנדסה גנטית סטרילי (5,500 × g, 10 דקות ב 4 ° C).
- מחדש להשעות את התוכן לא מסיסים-1.8 מ ל מים הנדסה גנטית סטרילי.
- סוכרים מסיסים במים (WSPs)
הערה: בצע את הניסוי הזה-ברדס fume.- מ תגובת שיקוע מאוחסנות, שומרים 1 מ"ל על כימות של סוכרים מסיסים במים (WSPs).
- Homogenize את תגובת שיקוע מאוחסנות עבור 1 דקות. לאחר מכן, להעביר צינורות סטרילי, להוסיף 2.5 כרכים של 95% אתנול. אחסן את הצינורות עבור 18 h ב-20 ° C עבור WSPs משקעים.
- לאחר 18 h, centrifuge הצינורות ב x 9,500 g למשך 20 דקות ב 4 º C. לאחר צנטריפוגה, למחוק את supernatants.
- לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם 75% אתנול, מילה נהדרת כדורי. מחדש להשעות את גלולה עם 1 מ ל מים הנדסה גנטית סטרילי, לכמת את WSP בשיטת חומצה גופרתית-פנול.
- השתמש 0.1% גלוקוז (0.01 גרם של גלוקוז 10 מ של מים הנדסה גנטית) על העקומה סטנדרטי (0 2.5, 5, 10, 15, 20, 25 µL של גלוקוז למחזור).
- להוסיף 200 µL של 5% פנול (2.7 מ"ל של 90% פנול נמצא 47.3 מ של מים הנדסה גנטית) שפופרת זכוכית המונות 200 µL של המדגם, או עיקול רגיל הצבע (בטריפליכאט עבור דגימה) ומערבבים בזהירות.
- להוסיף 1 מ"ל של חומצה גופרתית הצינור ומערבבים. לחכות 20 דקות בשביל התגובה ולמדוד את הדגימות באמצעות ספקטרופוטומטרים (490 nm).
- סוכרים מסיסים אלקלי (האישיות)
הערה: בצע את הניסוי הזה בשכונה fume.- כמות מחדש על תנאי לא מסיסים, הפרד בין 1 מ"ל מצפני ASPs. Centrifuge את aliquots של כל השעיה biofilm (13,000 x g, 10 דקות ב 4 ° C).
- הסר בזהירות את תגובת שיקוע של כל שפופרת. ואז מניחים את הדגימות על רכז ואקום כדי לייבש את כדורי.
- שוקל כדורי ולהוסיף 300 µL של 1 N NaOH (2 גרם של NaOH עד 50 מ"ל של מים הנדסה גנטית) לכל 1 מ ג של משקל יבש. תקופת דגירה אותם של 2 h ב 37 מעלות צלזיוס, ואז צנטריפוגה ב × 13,000 g למשך 10 דקות.
- בזהירות לאסוף את supernatants עם פיפטה, העברת צינורות microcentrifuge, שמירה על בגדר.
- שוב, להוסיף אמצעי שווה של 1 N NaOH הצינורות הכוללת כדורי, וכן לחזור על אותם צעדים לעיל על החילוץ של ASP.
- לאחר דגירה כבר שעתיים, centrifuge את הדגימות (13,000 x g 10 דקות), בזהירות לאסוף את supernatants ומוסיפים supernatants שנאספו בעבר.
- על החילוץ השלישית, חזור על הפעולות כמו לעיל, אבל הפעם, לא דגירה בדגימות כבר שעתיים לפני צנטריפוגה.
- לאחר מכן, להוסיף שלושה כרכים של אתנול 95% כל דגימה. לאחר מכן, מלאי את הדגימות-−20 ° C עבור 18 h עבור משקעים של ASP.
- Centrifuge הצינורות (9,500 × g למשך 20 דקות ב 4 ° C) וזורקים את supernatants.
- תשטוף בכל גלולה שלוש פעמים עם 75% אתנול, מילה נהדרת (אותם הליכים עשה WSP). מחדש להשעות את כדורי בשווה הנפח הכולל של החילוץ הראשונה עם 1 N NaOH.
- לקרוא את הדוגמאות על כימות של ASP באמצעות פנול-גופרתית (אותו לגבי ניתוח WSP).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2 מציג התוצאות של יומן10 CFU/mL של אלביקנס ג לאחר טיפולים אש"ל עם אור אדום עבור אור אדום דק 1 הקטינה באופן משמעותי את יומן10 בהשוואה של NC CFU/mL (p = 0.004). תרשים 3 מציג את התוצאות של ביומסה (מ ג) של biofilms אלביקנס ג לאחר טיפולים. כל מטופל קבוצות הראה הפחתה של ביומסה בהשוואה של NC (p = 0.000) ומטופל האור האדום הקבוצות הציגו ירידה דומה של ביומסה כדי שנצפה ב- PC. איור 4 ו- 5 איור להציג נחות כמויות אלביקנס ג EPS מסיסים ו- EPS-לא מסיס ב PC לעומת NC (p = 0.000). למרות מבחינה סטטיסטית לא משמעותי, אש"ל ליישום של אור אדום עבור 1 דקות אלביקנס ג biofilms מספרית פחתה כמויות מסיסים EPS ו- EPS-לא מסיס.
איור 1 . עקומת הגדילה של אלביקנס ג זן SN 425. תרבות פלנקטוניים היה עשוי מדיום YNB בתוספת 100 מ מ של גלוקוז, מודגרות ב 37 º C. הצפיפות האופטית (OD-540 nm), Log10 CFU/mL נקבעו לאורך זמן. סטיית תקן מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . סטיות תקן ומרושע של יומן10 CFU/mL של אלביקנס ג. הערכות נעשו בין הטיפול עם אור אדום פעמיים ביום ואת controls-0.12% CHX (PC) 0.89% NaCl (NC). אותיות שווה מייצגים סטטיסטית הדמיון בין קבוצות (0.05 > p). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . סטיות תקן ומרושע של משקל יבש (מ ג) של אלביקנס ג. הערכות נעשו בין הטיפול עם אור אדום פעמיים ביום ואת controls-0.12% CHX (PC) 0.89% NaCl (NC). אותיות שווה מייצגים סטטיסטית הדמיון בין קבוצות (0.05 > p). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . סטיות תקן ומרושע של EPS-מסיסים כמות ב אלביקנס ג biofilm (µg/מ ג של משקל יבש). נערכו השוואות בין הטיפול עם אור אדום פעמיים ביום ואת controls-0.12% CHX (PC) 0.89% NaCl (NC). אותיות שווה מייצגים סטטיסטית הדמיון בין קבוצות (p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . סטיות תקן ומרושע של EPS-לא מסיס תוכן ב אלביקנס ג biofilm (µg/מ ג של משקל יבש). הערכות נעשו בין הטיפול עם אור אדום פעמיים ביום ואת controls-0.12% CHX (PC) 0.89% NaCl (NC). אותיות שווה מייצגים סטטיסטית הדמיון בין קבוצות (p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר עבור culturing מוצלחת של biofilm אלביקנס ג הם: 1) לעשות את inoculum מראש ולא את inoculum בינוני YNB השלים עם גלוקוז 100 מ מ; 2) כדי לחכות 90 דקות השלב אדהזיה ולשטוף היטב פעמיים הבארות עם 0.89% NaCl כדי להסיר תאים שאינם דבקה; ו 3) כדי להוסיף RPMI בינוני התאים מודבקת להתחיל ביופילמים, מאז RPMI מגרה צמיחה hyphae. Aneuploidies עשויה להתרחש כאשר culturing אלביקנס ג. כתוצאה מכך, חשוב שלא לעשות שימוש המושבות כי הם ישנים, לא לאחסון צלחות ב 4° C, ולא על פסים מחדש תאים קיימים לוחות למעלה משבעה ימים. באופן דומה, זנים אמור לשמש לפני 18 שעות של צמיחה לילה13.
מגבלה המחקר היא כי זה בוצע במבחנה. בעוד מחקרים במבחנה הגבירה את ההבנה של הביולוגיה של biofilm, הם דווקא אינם מייצגים מצבים ויוו14. עם זאת, בדיקות במבחנה לספק תפוקה גבוהה ההקרנה בנוסף להיותו מתודולוגיה זול ופשוט14 לענות על שאלות לגבי טיפולים antibiofilm חדשים. בחירת המדיה תרבות הנכון עבור כל שלב ההתפתחות biofilm היא צעד חשוב להצלחת השיטה. RPMI 1640 הוא מדיום עשירות יש חומצות אמינו, מדמה את ההרכב של נוזלים האנושי15. RPMI 1640 מכיל L-גלוטמין, L-ארגנין, L-אספרגין בנוסף ויטמינים ומלחים אורגניים. למרות זאת, YNB מדיה יש כמות גבוה של גלוקוז (18 גרם/ליטר) בהשוואה RPMI 1640 בינונית (2 g/L גלוקוז). התוכן גלוקוז גבוהות תואר כדי להגדיל את צמיחת קנדידה מינים16פלנקטוניים. לעומת זאת, קיומה של ריכוז גבוה של חומצות אמינו יעזור biofilm צמיחה בינוני RPMI בהשוואה YNB בינוני16. נתונים איכותי החלת SEM micrographs הראה כי העיצוב מבנית של biofilms אלביקנס ג ב- RPMI מציג ארגון מורכב עם גידול מוצק של שמרים עם ramifying hyphae, ניצני אלמנטים וצלקות ניצן עם שפע מטריצה חוץ-תאית16. תוצאות כאלה הן על פי מחקר קודמות דיווחו כי RPMI 1640 augmented היווצרות hyphal אלביקנס ג biofilms15. תוצאות אלה מדגימים את ההבדלים המצע ניצול על ידי קנדידה לאורך כל שלבי גידול שונים biofilm ולהראות את החשיבות של שינוי המדיה במהלך צמיחה פלנקטוניים היווצרות biofilm.
הבחירה של טמפרטורה נכונה, pH לטפח biofilms אלביקנס ג חשוב גם לבצע את השיטה עם היווצרות נאותה של hyphae. ג אלביקנס מתחייב ההמרה מ- blastospores לחוטים בתגובה בתנאים המחקים את חצרו של המארח בתרבית של רקמות17. תנאים אלה כרוכים גדל בטמפרטורת הגוף (37 ° C) ו- pH ניטראלי17, זו הסיבה למה ה-pH של המדיום RPMI מותאם ל- 7.
לשיטות להחיל על במחקר זה הם משמעותיים מאז biofilms של SN אלביקנס ג 425 מאופיינים לפני12, מציג שיש וכמויות מסיסים EPS ומסיסים, מה שהופך אותה שיטה אמינה כדי לנתח את התוצאה של אורות על סוכרים חוץ-תאית. יתר על כן, המכשיר באותו האור הלא קוהרנטי חלה בניסויים הוחלה בהצלחה ל-18 ו biofilms חיידקי המתלים פלנקטוניים9, היתרון מירבית של המכשיר הזה הוא צמצום בזמן הטיפול, מה שהופך התקן יותר ריאלי עבור יישומים קליניים18. הניתוח של פוטותרפיה יומי שהוחל biofilms אלביקנס ג היא משמעותית מאז המתודולוגיה ליישם את המחקר הנוכחי מדמה טיפול מהיר והוא יכול להיעשות בקלות על ידי החולה בבית.
טיפול יומי אור אדום מופחת באופן משמעותי אלביקנס ג המושבה קיימא הספירה של biofilm biomasses. מחקרים נוספים יכול לנסות שילוב של טיפולים, החל פוטותרפיה והחלת מאוחר יותר אקטואלי פטריות. אסטרטגיה זו עשויה לסייע disorganizing של מטריצה חוץ-תאית מיגון biofilm אלביקנס ג , מתיר חדירה טובה יותר סמים דרך biofilm כדי להגיע, לבסוף למגר תאים אלביקנס ג . בהתחשב המגבלות של ניסויים במבחנה, השימוש באור אדום 1 דקות עשוי לסייע כמו אדג'וונט כדי נושא תבחיני על הטיפול בפה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר פאולה דה Silveira, ד ר Cecília בן מלונות שבדקתי Araújo דה קוסטה, שון מ מאולה, שיין מ מאולה, ד ר מערל (ש ע) Janal, Iriana Zanin ד ר לפיתוח של מחקר זה. אנו גם להכיר את ד ר אלכסנדר ד ג'ונסון (UCSF) עבור תרומת המתח שנותחו במחקר זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clorhexidine 20% | Sigma-Aldrich | C9394 | |
| Dextrose (D-Glucose) Anhydroous | Fisher Chemical | D16-500 | |
| Ethanol 200 proof | Decon Laboratories | DSP-MD.43 | |
| LumaCare LC-122 A | LumaCare Medical Group, Newport Beach, CA, USA | ||
| NaCl | Fisher Chemical | S641-500 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents | BP 359-500 | |
| Phenol 5% | Milipore Sigma | 843984 | |
| RPMI 1640 buffered with 3-(N-morpholino) | Sigma | R7755 | |
| Sabouraud dextrose agar supplemented with chloramphenicol | Acumedia | 7306A | |
| Sulfuric acid | Fisher Chemical | SA200-1 | |
| Yeast nitrogen base | Difco | DF0392-15-9 | |
| 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| 24-well polystyrene plate | Falcon | 353935 |
References
- Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options. Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).
- Harriott, M. M., Noverr, M. C. Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).
- Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K.
- Finkel, J. S., Mitchell, A. P. Genetic control of Candida albicans biofilm development. Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).
- Zarnowski, R., et al. Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia. MBio. 5, e013333 (2014).
- Mitchell, K. F., et al. Community participation in biofilm matrix assembly and function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).
- Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions. PLoS Pathogens. 12, e1005828 (2016).
- Dai, T., et al. Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).
- de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development. PLoS One. 10 (7), e0131941 (2015).
- Fontana, C. R., et al. The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms. Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology. Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372 (2017).
- Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms. Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60 (2018).
- Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).
- Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).
- Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development. Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).
- Kadosh, D., Johnson, A. D. Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis. Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).
- Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device. Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).
