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Biology

Capacidad de diferenciación de las células del Progenitor humano aórtica adiposo Perivascular gratis

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59337
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Maine Medical Center Research Institute

Summary

El objetivo de este protocolo es para poner a prueba la capacidad de diferenciarse en múltiples linajes celulares de células progenitoras derivadas de tejido adiposo de humanos perivascular. Diferenciación fue comparada con las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana, que se conoce a diferenciarse en adipocitos, Osteocito y linajes de condrocitos.

Abstract

Tejido adiposo es una fuente rica de multi-potente células madre mesenquimales (MSC) capaces de diferenciarse en osteogénico, adipogenic y condrogénica. Adipogenic diferenciación de células progenitoras es un mecanismo importante de conducción disfunción y expansión del tejido adiposo en respuesta a la obesidad. Los cambios de comprensión en el tejido adiposo perivascular (PVAT) es clínicamente relevante en la enfermedad metabólica. Sin embargo, estudios previos han sido predominantemente en el ratón y otros animales modelos. Este protocolo utiliza humanos torácica PVAT las muestras recolectadas de pacientes sometidos a cirugía de bypass aortocoronario. Tejido adiposo de la aorta ascendente fue recogido y utilizado para la explantación de la fracción vascular estromal. Previamente confirmamos la presencia de células progenitoras adiposas en PVAT humano con capacidad de diferenciarse en que contiene lípidos adipocitos. En este estudio, se analizaron además el potencial de diferenciación de las células de la fracción vascular estromal, que presumiblemente contiene células progenitoras multi-potente. Comparamos las células PVAT derivadas de médula ósea humana MSC para la diferenciación en adipogenic, osteogénica y condrogénica linajes. Después de 14 días de diferenciación, las manchas específicas fueron utilizadas para detectar acumulación de lípidos en los adipocitos (O aceite rojo), depósitos calcíficos en células osteogénicos (alizarina rojo), o glicosaminoglicanos y colágeno en las células condrogénica (TRICROMICA de Masson). Mientras que la médula ósea MSC distingue eficientemente en los tres linajes, células derivadas del PVAT tenían adipogenic y condrogénica potencial, pero carecía de potencial osteogénico robusto.

Introduction

Tejido adiposo es una fuente rica de multi-potente células madre mesenquimales (MSC) capaces de diferenciarse en osteogénico, adipogenic y condrogénica linajes1. Este tejido se expande a través de la hipertrofia de los adipocitos maduros y de diferenciación de novo de MSC residente a adipocitos. El tejido adiposo perivascular (PVAT) rodea los vasos sanguíneos y regula la función vascular2,3. Expansión PVAT inducida por la obesidad exacerba la patología cardiovascular. Mientras que el potencial multipotent de MSC de depósitos adiposos subcutáneos humanos han sido bien estudiadas4,5, ningún estudio explantados y evaluó la capacidad de diferenciación de las células progenitoras PVAT derivado humano, probablemente debido a la invasividad de la contratación. Así, el objetivo de este trabajo es proporcionar una metodología de explantación y propagar células progenitoras de PVAT aórtica humana de pacientes con enfermedades cardiovasculares y para probar su propensión a diferenciar a osteogénico condrogénica y adipogenic linajes. Nuestra fuente de PVAT es desde el sitio de la anastomosis del injerto de bypass en el ascendente de la aorta de pacientes obesos sometidos a cirugía de bypass aortocoronario. PVAT recién aislado es enzimáticamente disociado y la fracción vascular estromal es aislada y propagada in vitro, lo que nos permite probar por primera vez la capacidad de diferenciación de células progenitoras derivadas de PVAT humana.

Usando primaria cultivados humanos PVAT stromal vascular fracción, probamos tres ensayos diseñados para inducir a las células madre/progenitoras para diferenciar hacia adipogenic, osteogénico, o linajes condrogénica. Nuestro estudio anterior identificó una población de CD73 +, CD105 + y células PDGFRa + (CD140a) que robusta pueden diferenciarse en adipocitos6, aunque no fue probado su multipotencia. PVAT directamente regula el tono y la inflamación vascular7. El fundamento para probar el potencial de diferenciación de esta población celular nuevo es comenzar a comprender la influencia especializada de PVAT sobre la función vascular y los mecanismos de expansión PVAT durante la obesidad. Esta metodología aumenta nuestra comprensión de las funciones de las células madre derivadas de tejido adiposo y nos permite identificar y comparar las similitudes y diferencias de las células progenitoras procedentes de diferentes tejidos. Se basan en enfoques establecidos y validados para aislar y diferenciar MSC hacia diversos linajes y optimizar procedimientos para maximizar la viabilidad de las células progenitoras derivadas PVAT humana. Estas técnicas tienen amplias aplicaciones en los campos del vástago y del progenitor investigación y tejido adiposo desarrollo de la célula.

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Protocol

El uso de tejidos humanos en el presente estudio fue evaluado y aprobado por el institucional de Junta de Maine Medical Center, y todo el personal recibió entrenamiento apropiado antes de la experimentación.

1. preparaciones

  1. Hacer buffer de disociación por reconstituir 50 mg animal-libre colagenasa/dispase mezcla solución con 1 mL de solución de trabajo de nanopure H2O. preparar 1 mg/mL mediante la adición de 49 mL de DMEM que contenía 1% w/v BSA a la colagenasa reconstituido de alta glucosa / solución dispase. Guardar alícuotas de trabajo de 5 mL a-20 ° C y caliente a 37 ° C utilizando a un previo baño de agua a utilizar.
  2. Hacer solución de antibiótico mediante la adición de 1 mL de solución antibiótico/antimicótico de 100 x (concentración final es de 200 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 200 de unidades/mL y 0,5 μg/mL fungizone) en 49 mL de HBSS y almacenar en hielo.
  3. Preparar solución de gelatina (0,2% p/v) disolviendo gelatina 200 mg de piel bovina en 100 mL de nanopure H2O. Autoclave la solución durante 20 minutos y almacenar a 4 ° C.
  4. Preparar 500 mL de medio de crecimiento PVAT: glucosa alta DMEM/F12 con suplemento de glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio, suplementado con 10% FBS y agente antimicrobiano 100 μg/mL (véase Tabla de materiales).
  5. Preparar medios de inducción de adipogenic 50 mL: glucosa alta 40,8 mL DMEM, complementada con medios de crecimiento 7,5 mL PVAT, 500 μl de 100 x antibiótico/antimicótico solución (concentración final es 100 unidades/mL de penicilina y estreptomicina 100 de unidades/mL fungizone 0.25 μg/mL), 0,5 mM IBMX (stock de 500 mM en 0,1 M NaOH), la dexametasona de 1 μm (valores de 1 mM en etanol), 5 μm rosiglitazona (bolsa de 5 mM en DMSO), 33 μm biotina (stock de 66 mM en DMSO), 100 insulina nM (200 stock μm en ácido acético al 0.1%) y 20 μm ácido pantoténico (bolsa de 100 mM de H2 O).
  6. Preparar 50 mL de medio de inducción de control para el linaje de adipogenic: glucosa alta 40,8 mL DMEM suplementado con medios de crecimiento PVAT 7,5 mL y 500 μl de pen-strep (100 acciones de x).
  7. Preparar los medios de mantenimiento de adipogenic 50 mL: glucosa alta mL 41,5 DMEM suplementado con 7,5 mL PVAT medios de crecimiento en el paso 1.3, 500 μl pen-strep (100 acciones de x), dexametasona 1 μm (valores de 1 mM en EtOH), biotina μm 33 (valores de 66 mM en DMSO), insulina nM 100 (200 μm hasta la existencia en 0.1% CA ácido etic) y el ácido pantoténico μm 20 (bolsa de 100 mM de H2O).
  8. Preparar 500 mL de medio de crecimiento para los linajes osteogénicos y condrogénica: suplemento de glucosa alta αMEM suplementado con 10% FBS, glutamina x 1 (véase Tabla de materiales) y 5 mL de pen-strep (100 acciones de x).
  9. Preparar 50 mL de medio de inducción para el linaje osteogénico: 50 mL de los medios de crecimiento de MSC de médula ósea suplementados con 10 nM dexametasona y glicerofosfato-β de 10 mM.
  10. Preparar 50 mL de medio de inducción para la estirpe condrogénica: 50 mL de los medios de crecimiento de MSC de médula ósea con 100 nM dexametasona, 50 μg/mL ascorbato-2-fosfato de sodio y 10 ng/mL TGFβ1. Para las condiciones osteogénicos y condrogénica, los medios de crecimiento MSC de médula ósea basal servirá como los medios de no inducción.

2. Protocolo n ° 1: Cultura PVAT humano las células de la fracción Vascular estromal

Nota: PVAT es resecado desde el sitio de la anastomosis del injerto en la aorta ascendente de anestesiados pacientes sometidos a procedimientos de injerto de bypass de arteria coronaria. PVAT aórtica se coloca un 15 mL cónico que contiene 10 mL hielo frío alta glucosa en DMEM F12 y trasladado desde el quirófano al laboratorio dentro de las 2 h de la resección. PVAT aórtica es tejido desechado durante el procedimiento de by-pass y ha sido considerado como investigación de sujetos no humanos por la Junta de revisión interna del centro médico de Maine.

  1. Este protocolo es para un pedazo de ~ 500 mg de PVAT humano (aproximadamente 3 x 1 x 0,5 cm3). Transferir PVAT humano fresco de DMEM a un tubo cónico de 50 mL conteniendo 25 mL de solución de antibiótico. Incubar con mecedora por 20 min a 4 ° C. Mientras que el PVAT es en solución antibiótica, descongele una alícuota del almacenador intermediario de la disociación a 37 ° C.
  2. Añadir 50 μl de solución de antibiótico/antimicótico de x 100 a 5 mL de tampón de disociación y esterilice usando un filtro de jeringa 0,22 μm. Añadir 1 mL de solución de gelatina al 1 bien de una placa de 24 pozos. En campana de flujo laminar, use pinzas estériles y tijeras para transferir PVAT de la solución de antibiótica a una placa de Petri estéril. Añadir 1 mL de tampón de disociación precalentado al tejido y Pique finamente el tejido entero en una mezcla (no trozos de más de ~ 2 x 2 mm2) utilizando pinzas estériles y tijeras de disección.
  3. Transferir la mezcla de 1 mL a 4 mL de tampón de disociación e incubar el tubo a su lado en un agitador orbital con 37 ° C a 200 rpm durante 1 hora. Después de 1 h, no pedazos de tejido visible estará presentes, y la solución aparecerá como una suspensión turbia.
  4. Filtrar la solución a través de un tamiz de célula μm 70 ubicado en lo alto de un tubo cónico de 50 mL. Enjuague el filtro con una solución antibiótica adicional 10 mL para capturar tantas células como sea posible. No apriete el filtro.
  5. Sedimenten las células por 12 min a 300 x g en una centrífuga oscilante del cubo.
    Nota: Después de la centrifugación, se separará el tubo en una capa superior grasa de los adipocitos, una interfase y un diábolo. El pellet es la fracción vascular estromal que contiene las células endoteliales, células inmunes, las células de sangre y células progenitoras.
  6. Resuspender el precipitado en 10 mL de HBSS y centrifugar durante 5 min a 300 x g. Repita este paso para un total de 2 lavados en HBSS. Después del último lavado, no lisar los glóbulos rojos. Varios intentos con varios búferes disponibles comercialmente y tiempos de incubación han conducido a reducciones marcadas en accesorio de la célula progenitora y viabilidad.
  7. Aspirar la gelatina de la placa de 24 pocillos. Lave suavemente el bien 1 x con HBSS quitar gelatina sin consolidar.
  8. Resuspender el precipitado de la fracción vascular estromal con glóbulos rojos intactos en 1 mL de medio de crecimiento y semilla en el recubrimiento de gelatina bien. Añadir humanos FGF2 (resuspendió en PBS con 0,01% BSA w/v) a una concentración final de 25 ng/mL en medio de cultivo. Incubar durante 24 h a 37 ° C con 5% CO2.
  9. Al día siguiente, quitar medios de cultivo y lavado pozos x 5 con HBSS para eliminar glóbulos rojos y las células muertas. Añadir 1 mL de medio fresco crecimiento suplementado con 25 ng/mL FGF2.
  10. Cambiar el medio cada 48 h, para complementar con 25 ng/mL FGF2 fresco cada vez.
  11. Las células típicamente alcanzan confluencia 100% 7-10 días después de explante; células del paso a continuación:
    1. Aspirar monocapa de los medios de comunicación y lavado de crecimiento 2 x 1 ml HBSS. Aspire todo HBSS de los pozos y añadir unas gotas de solución de disociación celular.
    2. Toque y agitar a la placa e incubar a 37 ° C con 5% CO2 para 5-7 min levantar las células. Añadir ~ 1 mL de medio de cultivo fresco a las células separadas y distribuir 500 μl a 2 pocillos de una placa de 24 pocillos, cada uno conteniendo 500 μl crecimiento los medios de comunicación y 25 ng FGF2.
  12. Continúan expandiendo células humanas derivadas de PVAT como se indica en el paso anterior. Cada paso debe ser no mayor que una división de 1:2. Las células son pasadas 5 a 7 veces antes de la asignación para los ensayos de diferenciación.

3. Protocolo 2: Cultura médula ósea humana MSC colonias

Nota: Médula ósea humana MSC son aislados como descrito8 y como primeros paso congelado las existencias congelar media (70% FBS 20% basal DMEM y 10% DMSO) ~ 100.000 células/ml en líquido N2.

  1. Rápidamente descongelar un vial de médula ósea MSC del líquido N2 en un baño de agua de 37 ° C y la placa de un pocillo de una placa de cultivo de 6 pozos que contienen 3 mL de medio de crecimiento de MSC e incubar durante una noche a 37 ° C y 5% CO2.
  2. Al día siguiente, medios de cultivo MSC de aspirar y lavar las células 3 x en 2 mL de HBSS. En 100% de confluencia, medios de cultivo de aspirar y lavar las células 3 x en 2 mL de HBSS. Añadir 500 μL/pocillo celular separación solución, incubar a 37 ° C y 5% de CO2 por 5 min golpee ligeramente la placa para todas las células son desalojados y distribuir contenido a 2 pocillos de una placa de 6 pozos que contienen medios de cultivo 2 mL MSC.
  3. Ampliar la médula ósea humana y MSC PVAT derivado paralelamente durante aproximadamente 5 – 7 pasos o hasta cantidades suficientes para las pruebas se ha logrado.

4. Protocolo 3: Placa e inducir Adipogenic, osteogénica y condrogénica linajes

  1. Replica los números apropiados de la placa de la médula y las células derivadas de PVAT por pozo de una placa de 12 pozos y apropiadas para cada condición experimental. Para adipogenic y osteogénicos condiciones, ~ 200, 000 – 225.000 células/pocillo se necesita, para condiciones condrogénica de células/pocillo se necesitan 150.000-175.000.
    Nota: Corrimos un mínimo de N = 3 pozos replicadas para el control e inducida por las condiciones de cada linaje experimental para los funcionamientos de un total de 2 independientes (N = total de 6 repeticiones).
  2. Disociar las células de la población de la célula humana PVAT progenitoras y la población de MSC de médula ósea humana usando solución de separación celular e incubación a 37 ° C y 5% CO2 para las poblaciones de piscina de 5 minutos en frascos cónicos separado 15 mL. Girar el frasco hacia abajo a 500 x g por 7 min para que sedimenten las células. Resuspender en 1 mL de PBS y un hemocitómetro para estimar el número de celular.
  3. Las células en pozo de 12 platos de la placa como se indica en el paso 4.1. Prever platos separados adipogenic inducida y no inducidas, osteogénico y las condiciones para que la condición no-inducida puede ser fijo en un momento anterior sin interrumpir continuar la cultura de la condición inducida.
  4. Añadir 1,5 mL de adipogenic y medios de inducción osteogénica a cada pocillo de la condición inducida. Añadir 1,5 mL de adipogenic y medios no inducción osteogénicos a cada pocillo de la condición de no inducido. Comenzar la incubación de la adipogenic osteogénica células inducidas y no inducidas por poblaciones y en 37 ° C y 5% CO2.
  5. Girar hacia abajo el volumen restante de las células progenitoras PVAT humanas y médula ósea humana MSCs por 7 min a 500 x g.
  6. Determinar el volumen necesario para resuspender restantes la médula ósea y células PVAT pellets para lograr una densidad de 100.000 células/10 μl (106 células/mL). Resuspender el pellet en el volumen calculado de medios de cultivo de MSC para la inducción de estirpe condrogénica. Mueva suavemente el volumen de las células de arriba y abajo utilizando una pipeta para asegurar una distribución homogénea.
  7. Tomar con pipeta una gota de 10 μl de la solución concentrada de células en el centro de cada pozo para formar una micromass de 100.000 células. Coloque 1 mL de estéril de H2O en el pozo adyacente para evitar la evaporación. Incubar los cultivos micromass por 2 h a 37 ° C y 5% CO2 para permitir la micromass a agregado.
  8. Después de 2 horas, agregue cuidadosamente los medios de diferenciación condrogénica tacon con 10 ng/mL TGFβ1 humana a cada uno de los pozos de condición inducida. Cuidadosamente añadir 1,5 mL de los medios de no inducción (medio de crecimiento de MSC de médula ósea) en los pocillos de condición no-inducida. Utilizar placas 12-bien separadas para las condiciones inducidas y no inducidas por lo que la condición no-inducida puede ser fijo en un momento anterior.

5. Protocolo 4: Cultura Adipogenic, osteogénico y linajes condrogénica durante 14 días

  1. La cultura las condiciones inducidas y no inducidas de los tres linajes durante 4 días a 37 ° C y 5% CO2, actualizar los medios de comunicación cada 2 días. El día 4, cambiar la condición de linaje adipogenic inducida de los medios de inducción a los medios de mantenimiento para el resto del ensayo.
  2. Todas las condiciones inducidas por no fijar en formol al 10% para 12 h. dispone de formalina y lavado todo fijada pozos x 2 en PBS para eliminar todos los rastros de formol. Almacenar las placas en PBS a 4 ° C hasta el procesamiento.
  3. La cultura las condiciones inducidas por un total de 14 días, actualizar los medios de comunicación cada 2 días. Añadir TGFβ1 fresco a 10 ng/mL concentración final con cada actualización de los medios de inducción condrogénica. Continuar a la cultura del linaje adipogenic en adipogenic mantenimiento medios de comunicación y los medios de inducción linaje osteogénico, refrescante cada 2 días. En el día 14, fijar condiciones todo inducidas por 12 h en formalina al 10% para tinción.
  4. Raspe o vierta el micromass en la condición de inducción condrogénica en un cassette para empotrar. Deshidratar el micromass en una serie de baños de alcohol cada vez más concentrado por 5 min, comenzando en 70%, entonces, dos veces de 95%, 80% y dos veces más en alcohol absoluto. Coloque el cartucho en un agente de desalcoholización y entonces finalmente insertar el cassette en parafina para el seccionamiento y la coloración.

6. Protocolo 5: Tinción Adipogenic condición con aceite O rojo

  1. Preparar solución stock aceite rojo O disolviendo 350 mg de aceite rojo O en 100 mL de isopropanol al 100%. Mezcle por 2 h con una barra de agitación y vacío a través de un filtro de 0.2 μm. Solución madre se puede almacenar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 año.
  2. Preparar aceite rojo O solución diluida mezclando 3 partes solución a 2 partes diH20 (por ejemplo, 60 mL de solución madre a 40 mL diH20). La concentración final de aceite rojo O en la solución de trabajo es de 2,1 mg/mL.
  3. Retire todo el líquido de pozos. Lavar cada pozo 2 x con isopropanol al 60%, asegurándose de eliminar completamente toda el agua de los lados de los pocillos. Aspire isopropanol al 60% y agregar rápidamente la solución de trabajo de aceite rojo O sin tocar las paredes de los pozos para cubrir el fondo. Es fundamental que este paso se hace rápidamente para que no sequen los pozos.
  4. Una vez que se agrega el aceite rojo O, incubar 10 min a temperatura ambiente con el suave balanceo.
  5. Quite todo aceite rojo O y añadir agua destilada H2O. Wash con agua destilada de H2O 10 m empezar a quitar Oil Red O. Después de 10 minutos, aspirar aceite rojo O y repita el procedimiento de lavado 3 x.
  6. Una vez finalizado el lavado, añadir PBS y las células de la imagen. Almacenar las células en PBS a 4 ° C.

7. Protocolo 6: Tinción condición osteogénica con rojo de alizarina

  1. Retire todo el líquido de cada pocillo. Añadir volumen apropiado de solución al 2% rojo de alizarina colorante a cada pozo (1,5 mL por pocillo de una placa de 12 pozos) y suavemente incline el plato de lado a lado hasta que la solución cubra totalmente el fondo del pozo.
  2. Incubar por 15 min a temperatura ambiente. Quitar el rojo de alizarina de los pozos. Enjuague suavemente cada bien cuatro veces con agua destilada de H2O, teniendo precaución para no desalojar los cristales de calcio. Deje que se seque.

8. Protocolo 7: Coloración Trichrome condrogénica condición de Masson

  1. Hornear los portaobjetos en un horno seco de 60 ° C durante 30 minutos secciones Deparaffinize e hidratan en agua destilada.
    1. Para rehidratar, coloque los portaobjetos en tres incubaciones de 5 min con agentes de desalcoholización, seguidos de incubaciones de 5 min en bajar las concentraciones de alcohol como sigue: dos al 100% (etanol absoluto), dos en el 95% de alcohol, dos en 80%, dos al 70% y finalmente dos en agua destilada H2O. las diapositivas puede permanecer en H2O mientras se prepara el fijador de Bouin.
  2. Lugar 40 mL de fijador de Bouin en un tarro de plástico coplin para microondas (descubierto). Microondas en high para llevar la temperatura a 55 ° C. Coloque los portaobjetos en solución caliente por 20 min; deje en reposo sobre la superficie de cubierta. Lavar en agua corriente durante 10 minutos o hasta que todo el color amarillo desaparezca.
  3. Mancha de secciones en hematoxilina de Weigert durante 10 minutos lavado en agua corriente durante 10 minutos.
  4. Secciones de Beibrich escarlata ácido en solución durante 10 minutos lavado 3 x 10 min en agua del grifo de la mancha. Mordiente los portaobjetos en solución de ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico durante 10 minutos. No enjuague.
  5. Coloque los portaobjetos en solución anilina azul para 10 minutos enjuague con dos breves inmersiones en agua del grifo.
  6. Coloque los portaobjetos en solución de ácido acético al 1% durante 3 a 5 min lavado en agua corriente durante 1 minuto lugar en etanol al 95% durante 1 minuto deshidratar como se indica en el paso 5.4 y montar con resina sintética.

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Representative Results

Aislamiento de la fracción vascular estromal de PVAT humana

Figura 1A se muestra un diagrama esquemático de la región anatómica donde se obtuvo la PVAT que cubre la aorta ascendente. Anteriormente Describimos los grupos de pacientes sometidos a injerto de puente de arteria coronaria que estas muestras eran derivadas6. Figura 1B muestra un ejemplo de la humana PVAT obtenido después de la cirugía. Figura 1 muestra una sección de tejido PVAT representante teñida con Tricrómico de Masson. Figura 1 es una micrografía de contrato de la fase con una población de células estromales derivadas PVAT durante la fase de expansión antes de la diferenciación. Las células pueden ser ampliadas y congeladas para uso futuro. Las células se congelan típicamente a una densidad de 2.5 x 105 células/mL en un medio compuesto por 70% FBS, 20% basal (antibiótico) F12 de DMEM y 10% DMSO en un cryochamber isopropanol a-80 ° C durante 24 h y se trasladó a la fase líquida de un congelador de2 N líquido para largo-t almacenamiento de información de ERM.

Diferenciación de Adipogenic

Estudios se realizaron en paralelo con MSC de médula ósea humana (figura 2AB) y las células progenitoras derivadas de PVAT (figura 2D). Los paneles de la izquierda de la figura 2 muestran la condición inducida por el no, donde no hay acumulación de lípidos es evidente. Los paneles de la derecha muestran las células después de la diferenciación del adipocito y tinción de lípidos neutros con Oil Red O. Mientras que el grado de diferenciación en las células humanas de origen PVAT aórticas es más robusto, ambas fuentes de células humanas exhiben la capacidad de diferenciarse hacia el linaje de adipogenic.

Diferenciación osteogénica

Se utiliza el protocolo de la diferenciación osteogénica de MSC de médula ósea humana (Figura 3A-C) y las células derivadas de PVAT (figura 3D– F). Las células no-inducida (Figura 3AD) no manchan con rojo de alizarina. Después del Protocolo de diferenciación osteogénica, el MSC humano desarrollado nódulos calcificados que teñidos con alizarina roja (figura 3B, C), mientras que células humanas derivadas de PVAT aórticas no (figura 3E-F). Estos datos indican que nuestra preparación de células de la fracción vascular estromal de humanos PVAT carecen de gran número de progenitores con la posibilidad de experimentar la osteogénesis. Dependiendo del curso de estudio y tiempo de la diferenciación, es aconsejable seguir las manchas estándar con la detección de marcadores moleculares que definen el compromiso de linaje osteogénico (RUNX2, osterix, fosfatasa alcalina) o los osteoblastos (osteopontina, osteocalcina, fosfatasa alcalina, BAP1).

Diferenciación condrogénica

Células derivadas de ambos médula ósea humana MSC (Figura 4A) y PVAT humano (Figura 4B) Mostrar la característica características de diferenciación condrogénica, con acumulación de colágeno abundante en el micromass. Micromasses formado a partir de médula ósea humana MSC y aórticas PVAT derivado las células también exhibieron abundante acumulación de glucosaminoglicanos (azul) como se indica por la coloración azul Alcian (figura 4-D, respectivamente). Morfológicamente, se detectaron estructuras similares a las lagunas con las células en las cavidades que rodean por la deposición de colágeno (figura 4, las flechas). Dependiendo del curso de estudio y tiempo de la diferenciación, la detección de marcadores específicos condrogénica (aggrecan, colágeno tipo II, osteonectin, Sox9) es útil.

Figure 1
Figura 1: características morfológicas de PVAT humana. (A) representación de la aorta humana (rojo) con el circundante PVAT (amarillo) de dibujos animados. La flecha indica la aorta ascendente. (B) una pieza de 480 mg de PVAT aórtica humana de un paciente CABG en DMEM antes de la disociación. Manchas trichrome de Masson (C) PVAT humano parafina-encajado formalina-fijos (marrón oscuro/negro = núcleos, azul/púrpura = tejido conectivo, rosa = citoplasma; Nota, RBC aparecen de color rosa rojizo. (D) imagen representativa de las células stromal PVAT explanted en 7 días en la cultura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: diferenciación de Adipogenic. (A) fase de microscopía de la médula ósea humana MSC en la condición inducida por el no muestra ninguna evidencia de diferenciación. (B) microscopía de fase de la médula ósea humana MSC en la condición de adipogenic inducida muestra cierta diferenciación y la inmovilización de lípidos neutros, manchado con aceite rojo O después de 14 días. (C) fase microscopio de las células humanas aórticas PVAT deriva en la condición de adipogenic inducida no muestra ninguna evidencia de diferenciación. (D) fase microscopía de las células humanas aórticas PVAT deriva en la condición de adipogenic inducida muestra diferenciación robusta y la inmovilización de lípidos neutros, manchado con aceite rojo O después de 14 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Diferenciación osteogénica. (A) fase de microscopía de la médula ósea humana MSC en la condición osteogénica inducida no muestra ninguna evidencia de diferenciación hacia un linaje osteogénico. (B) fase de microscopía de la médula ósea humana MSC en la condición inducida después de 14 días en cultivo muestra evidencia de la diferenciación y formación de depósitos de calcio teñidos con rojo de alizarina (flechas). (C) una imagen de la bien que contiene la médula ósea humana MSC en la condición osteogénica inducida tras tinción con alizarina roja indica deposición abundante calcio, sugiriendo la diferenciación exitosa hacia un linaje osteogénico (flechas, deposición de calcio). (D) fase microscopio de las células humanas derivadas de PVAT aórticas en la condición osteogénica no inducida no exhibe ningún indicio de diferenciación hacia un linaje osteogénico. Fase (E) microscopía de las células humanas derivadas PVAT aórticas en la condición osteogénica inducida después de 14 días en cultivo muestra ninguna evidencia de diferenciación hacia un linaje osteogénico o deposición de calcio cuando teñidos con alizarina roja, solo tinción inespecífica. (F) una imagen del bien que contienen las células humanas aórticas PVAT deriva en la condición osteogénica inducida siguiente tinción con alizarina roja muestra sólo no específicos de tinción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Diferenciación condrogénica. (A, B) Microscopía óptica de una sección de la micromass formado por médula ósea humana MSC (A) o PVAT aórtica humana células progenitoras (B) en la condición de inducción condrogénica después de 14 días en la cultura y posteriormente teñidas con TRICROMICA de Masson, que indica importante la deposición de colágeno (azul) y sugiere diferenciación exitosa hacia una estirpe condrogénica. (C, D) Microscopía óptica de una sección de la micromass formado por médula ósea humana MSC (C) o PVAT aórtica humana células progenitoras (D) en las condiciones de inducción condrogénica después de 14 días en la cultura y posteriormente teñidas con Alcian blue, indica que la deposición de ácidos proteoglicanos (por ejemplo glycosaminoglycans) como normalmente se encuentran en el cartílago. Contraste, rojo rápido nuclear; flechas, lagunas-como las estructuras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Células progenitoras adiposas de diferentes depósitos varían ampliamente en la diferenciación y el fenotipo potencial9. Cultivo de progenitores PVAT derivado de un solo donante paciente en inducción simultánea por tres linajes diferentes, adipogenic, osteogénica y condrogénica, permite una investigación bien controlada de la capacidad pluripotencial de esta novela población de células progenitoras. La metodología descrita en este informe se puede utilizar para probar la capacidad de diferenciación de células progenitoras de PVAT humano y comprender su función en la regulación del tono vascular y patologías PVAT. Algunos beneficios de esta técnica son su sencillez y uso de tejido humano primario de arteria coronaria bypass pacientes, lo que permite la investigación de la función de las células progenitoras PVAT de pacientes con enfermedades cardiovasculares graves. Sin embargo, los explantes de una pieza de 500 mg de tejido típicamente rendimiento < 1000 adherente de las células y por lo tanto requieren de 5 – 7 pasos para obtener los números adecuados, destacando una importante salvedad a este enfoque. Crítica para el éxito de los experimentos de diferenciación tri-linaje es la calidad del explante inicial células de donante PVAT. Es esencial para picar finamente el tejido antes de la disociación enzimática. Además, a diferencia de otros protocolos de explante, encontramos una pérdida dramática de numero de celular, viabilidad y calidad global cuando se utilizó el buffer de lisis de glóbulos rojos antes de la galjanoplastia. En cambio, se recomienda que la fracción vascular estromal toda (incluidos los glóbulos rojos) de la placa. Después de 24 h, las células adherentes habremos atado y no sometidas a lisis células de sangre rojas se pueden quitar con repetidos lavados con HBSS. Pases de las células stromal PVAT derivado deben ser no mayor de 1:2 divisiones. Se observó una reducción en la tasa de crecimiento cuando las células eran split 1:3 o mayor.

El componente más difícil de la prueba de diferenciación del trilineage es la condición condrogénica, ya que requiere de un método menos común de cultivo células en "micromass" e histológicos incrustar y seccionamiento. Debe tenerse cuidado al plato correctamente la gota de 10 μl de 100.000 células y no molestar a la masa en la adición de medio de cultivo. Se encontró variación entre los ensayos en cuanto a si la micromass permaneció adherido a la placa o suspendido en el medio. Incluso cuando la masa no permanecieron adherida, la viabilidad de la célula y estructura de micromass seguía siendo constante.

Las células madre o progenitoras en el microambiente vascular son responsables de la reparación de los tejidos en respuesta a lesión o enfermedad. Más bien caracterizadas son las poblaciones que derivan de compartimientos pericyte/adventicial, aunque todavía hay controversia sobre si existe una identificación molecular estandarizada de estas poblaciones en los seres humanos10,11 . En este protocolo, se estudia una población de la célula progenitora derivada específicamente de PVAT humana para probar su propensión para distinguir a una estirpe osteogénica y condrogénica y adipogenic. Usando técnicas de tinción para definir compromiso celular de cada linaje, demostramos que a diferencia de MSC de médula ósea humana, células progenitoras de PVAT humana no fueron capaces de diferenciarse hacia un linaje osteogénico (figura 3) pero exhiben robusta diferenciación de adipogenic. La capacidad de diferenciación condrogénica es comparable entre la médula y las células derivadas de PVAT. Esto sugiere que las células progenitoras derivadas de PVAT podrían ser linaje más restringido que el MSC de la médula o que los progenitores PVAT no se distinguen fácilmente en linajes osteogénicos. Los estudios futuros deben incluir una investigación de la expresión de gene y proteína de marcadores para cada linaje más cuantitativo, evaluar la capacidad de diferenciación de las células derivadas de PVAT.

Células madre procedentes de adiposo han sido un foco para aplicaciones en medicina regenerativa, debido al fácil acceso y el elevado número de células que pueden ser derivadas del tejido adiposo12,13. Dentro de la fracción vascular estromal de tejido adiposo, hay células vasculares, células inflamatorias, fibroblastos, preadipocytes y células madre derivadas de adiposo. Hay diferencias en la población de células madre basado en la localización anatómica de la adiposa depot y adipocito características14. Lo más importante, el adiposo células madre parece tener la capacidad no sólo para diferenciarse en linajes mesenquimales15, sino también potencial neuronal16,17 y epidérmico18 destinos.

Numerosos estudios se han centrado en las células madre/progenitoras derivadas de humanos blanco adiposo los tejidos subcutáneos, pero muy pocos estudios han abordado las características de las poblaciones progenitoras PVAT. Estudios recientes han aislado células progenitoras de adipocito de vasos mesentéricos circundantes PVAT o aorta torácica de rata. Estos CD34 + / CD140a + poblaciones diferenciadas en adipocitos, aunque la capacidad para derivar otros linajes no fue probaron19.

Recientemente hemos caracterizado en células progenitoras adiposas de la fracción vascular estromal de PVAT humano de pacientes con enfermedad de arteria coronaria avanzada6. Estas células progenitoras adiposas eran CD73 + CD105 + y CD140a + y distinguen eficientemente en adipocitos con características termogénicas (expresión de UCP1)6. En el presente trabajo, encontramos una potencia limitada de linaje de las células derivan PVAT comparado con MSC de médula ósea, sugiriendo una falta o mínima población de células madre procedentes de adiposo que se han caracterizado desde otros tejidos adiposos humanos. Una consideración de este protocolo es la variabilidad esperada entre especímenes humanos, que pueden afectar el número de células madre/progenitoras dentro de la muestra PVAT y su capacidad para someterse a la diferenciación de distintos linajes. Edad, género, índice de masa corporal, medicamentos y otros parámetros clínicos probables afectan el fenotipo de las células progenitoras en PVAT. Así, modificaciones futuras esperadas de este protocolo aguardan una población claramente definida del progenitor más PVAT humano, y posiblemente usando celular clasificación para aislar a las subpoblaciones específicas para estudios de linaje.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Reconocemos la ayuda de navegación de la investigación en el centro médico de Maine para ayudar con la obtención de tejido clínico, histopatología y núcleo de histomorfometría (apoyado por 1P20GM121301, L. Liaw PI) en el Maine Medical Center Research Instituto de corte y coloración. Este trabajo fue financiado por los NIH grant HL141149 R01 (Liaw L.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I   Millipore-Sigma SCR139 50mg
Alcian Blue NewComerSupply 1003A 1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red Amresco 9436-25G
alpha-MEM ThermoFisher 12561056
Aniline Blue NewComerSupply 10073C
Antibiotic/antimycotic ThermoFisher 15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin Millipore-Sigma A3908-25G
b-glycerophosphate Millipore-Sigma G9422-10G
Biebrich Scarlet EKI 2248-25G
Biotin Millipore-Sigma B4501-100MG
Bouin's fixative NewComerSupply 1020A
Bovine serum albumin Calbiochem 12659 stored at 4 °C
Cell detachment solution Accutase AT104
Bell strainer (70 mm) Corning 352350
Dexamethasone Millipore-Sigma D4902-100MG
DMEM Corning 10-013-CV 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium ThermoFisher 10565-042 high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO Millipore-Sigma D2650
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals  S11550
FGF2 Peprotech 100-18B
Formalin NewComerSupply 1090
Gelatin, bovine skin Millipore-Sigma G9391-500G
Glutamax ThermoFisher 35050061 glutamine supplement
HBSS Lonza 10-547F
IBMX Millipore-Sigma I5879-250MG
Insulin solution Millipore-Sigma I9278-5ML
Oil red O Millipore-Sigma O0625-100G
Pantothenic acid Millipore-Sigma P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution ThermoFisher 15240062 100ml
Permount Fisher SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution Millipore-Sigma P4006-100G/221856-100G
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone Millipore-Sigma R2408-10MG
TGFb1 Peprotech 100-21
Weigert's hematoxylin EKI 4880-100G

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References

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Scott, S. S., Yang, X., Robich, M., Liaw, L., Boucher, J. M. Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (145), e59337, doi:10.3791/59337 (2019).

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