Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Differentiatie capaciteit van menselijke aorta gerelateerde adipeus voorlopercellen

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59337
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Maine Medical Center Research Institute

Summary

Het doel van dit protocol is voor het testen van de mogelijkheid van voorlopercellen afgeleid van menselijke gerelateerde adipeus weefsel te differentiëren in meerdere cel geslachten. Differentiatie werd vergeleken met mesenchymale stamcellen, afgeleid van menselijke beenmerg, waarvan bekend is dat het differentiëren in adipocyte, Osteocyt en chondrocyten geslachten.

Abstract

Vetweefsel is een rijke bron van multi potente mesenchymale stamcellen (MSC) kunnen differentiëren in osteogenic, adipogenic, en chondrogenic geslachten. Adipogenic differentiatie van voorlopercellen is een belangrijk mechanisme rijden adipeus weefsel expansie en dysfunctie in reactie op obesitas. Begrip wijzigingen in gerelateerde adipeus weefsel (PVAT) is dan ook klinisch relevante in stofwisselingsziekte. Eerdere studies is echter voornamelijk uitgevoerd in de muis en andere dierlijke modellen. Dit protocol maakt gebruik van menselijke thoracale PVAT monsters verzameld van patiënten die een coronaire bypassoperatie graft. Adipeus weefsel van de oplopende aorta werd verzameld en gebruikt voor uitname van de stromale vasculaire breuk. Wij eerder bevestigde de aanwezigheid van obesitas voorlopercellen in menselijke PVAT met de capaciteit om te differentiëren in lipide-bevattende adipocytes. In deze studie, we verder geanalyseerd het potentieel van de differentiatie van cellen uit de stromale vasculaire, vermoedelijk met multi potente voorlopercellen. We vergeleken de PVAT-afgeleide cellen aan menselijke beenmerg MSC voor differentiatie in adipogenic, osteogenic, en chondrogenic geslachten. Na 14 dagen van differentiatie, specifieke vlekken werden gebruikt om het detecteren van accumulatie van lipide in adipocytes (rode olie O), calcific deposito's in osteogenic cellen (Alizarine rood), of glycosaminoglycanen en collageen in chondrogenic cellen (Masson van Trichrome). Terwijl het beenmerg MSC efficiënt gedifferentieerd in alle drie geslachten, PVAT-afgeleide cellen had adipogenic en chondrogenic potentiële, maar miste robuuste osteogenic potentieel.

Introduction

Vetweefsel is een rijke bron van multi potente mesenchymale stamcellen (MSC) kunnen differentiëren in osteogenic, adipogenic, en chondrogenic lineages1. Dit weefsel wordt vergroot door hypertrofie van volwassen adipocytes en de novo differentiatie van resident MSC naar adipocytes. Gerelateerde adipeus weefsel (PVAT) rondom bloedvaten en regelt vasculaire functie2,3. Obesitas-geïnduceerde PVAT uitbreiding verergert cardiovasculaire aandoeningen. Terwijl het multipotente potentieel van MSC van menselijke subcutane obesitas depots zijn goed bestudeerde4,5, geen studies hebben transplanteren en geëvalueerd van de capaciteit van de differentiatie van menselijke PVAT afkomstige voorlopercellen, waarschijnlijk wegens de invasiviteit van overheidsopdrachten. Dus, het doel van dit werk is bedoeld als een methode explant en propageren van voorlopercellen van menselijke aorta PVAT van patiënten met hart-en vaatziekten en het testen van hun neiging om te differentiëren tot osteogenic, chondrogenic en adipogenic geslachten. Onze bron van PVAT is op de website van wapendrager van de rondweg prothese op Oplopend aorta van zwaarlijvige patiënten die een coronaire bypassoperatie graft. Vers-geïsoleerde PVAT is enzymatisch losgekoppeld en de stromale vasculaire breuk is geïsoleerd en gekweekt in vitro, zodat we kunnen testen voor de eerste keer de capaciteit van de differentiatie van menselijke PVAT afkomstige voorlopercellen.

Met behulp van primaire gekweekte menselijke PVAT stromale vasculaire breuk, we drie tests ontworpen voor het opwekken van de stam/voorlopercellen om te differentiëren naar adipogenic, osteogenic, of chondrogenic lineages getest. Onze voorafgaande studie is gebleken dat een bevolking van CD73 +, CD105 +, en PDGFRa + (CD140a) cellen die krachtig in adipocytes6 differentiëren kunnen, hoewel hun multipotent werd niet getest. PVAT regelt rechtstreeks vasculaire Toon en ontsteking7. De grondgedachte voor het testen van het potentieel van de differentiatie van deze roman celpopulatie is om te beginnen te begrijpen van de gespecialiseerde invloed van PVAT op vasculaire functie, en mechanismen van PVAT expansie tijdens obesitas. Deze methode verbetert ons begrip van de functies van vetweefsel afgeleide voorlopercellen en laat ons toe om te identificeren en vergelijken van de overeenkomsten en verschillen van voorlopercellen uit verschillende weefsel bronnen. Wij bouwen op gevestigde en gevalideerde methoden voor het isoleren en differentiatie van MSC naar verschillende geslachten en optimaliseren van procedures voor het maximaliseren van de levensvatbaarheid van menselijke PVAT afkomstige voorlopercellen. Deze technieken hebben brede toepassingen op het gebied van stuurpen en progenitor cel onderzoek en adipeus weefsel ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het gebruik van menselijke weefsels in deze studie werd geëvalueerd en goedgekeurd door de institutionele Review Board van Maine Medical Center, en al het personeel de juiste opleiding voorafgaand aan experimenten.

1. voorbereiding

  1. Dissociatie buffer te maken door de bijenpopulatie 50 mg dier-vrije collagenase/dispase mix ik oplossing met 1 mL van de nanopure H2O. voorbereiden 1 mg/mL werkoplossing door toevoeging van 49 mL van hoge glucose DMEM met 1% w/v BSA bij de gereconstitueerde collagenase / dispase de oplossing. Opslaan van 5 mL werken aliquots bij-20 ° C en warm tot 37 ° C met behulp van een water bad voorafgaande te gebruiken.
  2. Maak antibiotische oplossing door toevoeging van 1 mL 100 x antibiotica/antimycotic oplossing (eindconcentratie is 200 eenheden/mL penicilline, 200 eenheden/mL streptomycine en 0,5 µg/mL fungizone) 49 ml HBSS en sla op ijs.
  3. Bereid gelatine-oplossing (0,2% w/v) door ontbinding van 200 mg gelatine van boviene huid in 100 mL nanopure H2O. autoclaaf de oplossing voor 20 min en bewaren bij 4 ° C.
  4. Bereiden van 500 mL PVAT groei media: hoge glucose DMEM/F12 met glutamine supplement, natrium pyruvaat en natriumbicarbonaat, aangevuld met 10% FBS en antimicrobiële agent van 100 µg/mL (Zie Tabel van materialen).
  5. Bereiden van 50 mL adipogenic inductie media: 40.8 mL hoge glucose DMEM, aangevuld met 7,5 mL PVAT groei media, 500 µL van 100 x antibiotica/antimycotic oplossing (eindconcentratie is 100 eenheden/mL penicilline, 100 eenheden/mL streptomycine en 0,25 µg/mL fungizone), 0,5 mM IBMX (500 mM stock in 0,1 M NaOH), 1 µM dexamethason (1 mM stock in ethanol), 5 µM Rosiglitazon (5 mM stock in DMSO) 33 µM Biotine (66 mM stock in DMSO), 100 nM insuline (200 µM stock in 0,1% azijnzuur) en 20 µM Pantotheenzuur (100 mM stock in H2 O).
  6. 50 mL controle inductie media voorbereiden op de adipogenic afstamming: 40.8 mL hoge glucose DMEM aangevuld met 7,5 mL PVAT groei media en 500 µL van pen-strep (100 x voorraad).
  7. Bereiden van 50 mL adipogenic onderhoud media: 41.5 mL hoge glucose DMEM aangevuld met 7,5 mL PVAT groei media vanaf stap 1.3, 500 µL pen-strep (100 x voorraad), 1 µM dexamethason (1 mM stock in EtOH), 33 µM Biotine (66 mM stock in DMSO), 100 nM insuline (200 µM voorraad in 0,1% ac eTIC zuur), en 20 µM Pantotheenzuur (100 mM stock in H2O).
  8. 500 mL groei media voorbereiden op de osteogenic en chondrogenic geslachten: hoge glucose αMEM aangevuld met 10% FBS, 1 x glutamine supplement (Zie Tabel of Materials), en 5 mL van pen-strep (100 x voorraad).
  9. 50 mL inductie media voorbereiden op de osteogenic afstamming: 50 mL van het beenmerg MSC groei media aangevuld met 10 nM dexamethason en 10 mM β-glycerophosphate.
  10. 50 mL inductie media voorbereiden op de chondrogenic afstamming: 50 mL van het beenmerg MSC groei media aangevuld met 100 nM dexamethason, 50 µg Mo/mL natrium ascorbaat-2-fosfaat en 10 ng/mL TGFβ1. Voor de osteogenic en chondrogenic voorwaarden, zal de basale beenmerg MSC groei media dienen als de niet-inductie-media.

2. protocol 1: Cultuur menselijke PVAT cellen uit de stromale vasculaire afvalfractie

Opmerking: PVAT is van de site van graft wapendrager op de oplopende aorta van narcose patiënten die een coronaire bypass graft procedures gereseceerd. Aorta PVAT is geplaatst in een 15 mL kegelvormig met 10 mL ijs koude hoge glucose DMEM F12 en overgedragen van de operatiekamer naar het laboratorium binnen 2 uur van resectie. Aorta PVAT is afgedankt weefsel tijdens bypass procedure en Maine Medical Center's interne Review Board als niet-menselijke onderwerpen onderzoek heeft geoordeeld.

  1. Dit protocol is voor een stuk van de ~ 500 mg van menselijke PVAT (ongeveer 3 x 1 x 0.5 cm3). Transfer verse menselijke PVAT van DMEM naar een conische tube van 50 mL, met 25 mL antibiotische oplossing. Incubeer met rockende gedurende 20 minuten bij 4 ° C. Terwijl de PVAT zich in antibiotica oplossing, ontdooien een aliquoot gedeelte van dissociatie buffer bij 37 ° C.
  2. Voeg 50 µL van 100 x antibiotica/antimycotic oplossing aan 5 mL dissociatie buffer en steriliseren met behulp van een 0,22 µm spuit filter. 1 mL van gelatine oplossing aan 1 goed van een 24-well-plate toevoegen. In een laminaire flow-kap, steriel pincet en schaar PVAT overdracht van de antibiotica oplossing naar een steriele petrischaal te gebruiken. Voeg 1 mL voorverwarmde dissociatie buffer aan het weefsel en fijn gehakt het hele weefsel in een drijfmest (geen stukken groter dan ~ 2 x 2 mm2) met behulp van steriele pincet en dissectie schaar.
  3. De 1 mL drijfmest overbrengen in 4 mL dissociatie buffer en de buis op zijn kant in een roteerschudapparaat voorverwarmde 37 ° C bij 200 omwentelingen per minuut gedurende 1 uur uit te broeden. Na 1 h, geen zichtbare weefsel stukken aanwezig zal zijn, en de oplossing verschijnt als een bewolkte celsuspensie.
  4. Filtreer de oplossing door een 70 µm cel zeef instellen bovenop een conische tube van 50 mL. Spoel de zeef met een extra 10 mL antibiotica te vangen net zoveel cellen als mogelijk. Knijp niet de zeef.
  5. Pellet de cellen gedurende 12 minuten bij 300 x g in een swingende emmer centrifuge.
    Opmerking: Na centrifugeren, zal de buis worden gescheiden in een vette toplaag van adipocytes, een interfase en een pellet. De pellet is de stromale vasculaire breuk met endotheliale cellen, immune cellen, bloedcellen en voorlopercellen.
  6. Resuspendeer de pellet in 10 mL HBSS en Centrifugeer gedurende 5 min op 300 x g. Herhaal deze stap voor een totaal van 2 wasbeurten in HBSS. Na de definitieve wash, niet lyse van de rode bloedcellen. Herhaalde pogingen met verschillende verkrijgbare buffers en incubatie tijden hebben geleid tot een duidelijke vermindering progenitor cel gehechtheid en levensvatbaarheid.
  7. Gelatine van de 24-well plaat gecombineerd. Voorzichtig wassen de goed 1 x met HBSS voor het verwijderen van niet-afhankelijke gelatine.
  8. Resuspendeer stromale vasculaire breuk met intacte rode bloedcellen pellet in 1 mL groei media en zaad op de gelatine-gecoate goed. Menselijke FGF2 (geresuspendeerde in PBS aangevuld met 0,01% BSA m/v) toevoegen om een eindconcentratie van 25 ng/mL in een cultuurmedium. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 ° C met 5% CO2.
  9. Op de volgende dag wells verwijderen groei media en wassen 5 x met HBSS om rode bloedcellen en dode cellen te verwijderen. Toevoegen in 1 mL verse groei media aangevuld met 25 ng/mL FGF2.
  10. Wijzigen van de media elke 48 h, ervoor zorgend om te vullen met 25 ng/mL verse FGF2 elke keer.
  11. Cellen bereiken 100% samenvloeiing meestal 7-10 dagen na explant; passage cellen vervolgens:
    1. Gecombineerd groei media en wassen enkelgelaagde 2 x in 1 mL HBSS. Alle HBSS de putjes gecombineerd en voeg een paar druppels van cel dissociatie oplossing.
    2. Tik op en swirl van de plaat meerdere keren en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 voor 5 – 7 min te heffen van de cellen. ~ 1 mL verse kweekmedium aan de vrijstaande cellen toevoegen en distribueren van 500 µL aan 2 putjes van de plaat van een 24-well, elk met 500 µL groei media en 25 ng FGF2.
  12. Blijven uitbreiden van menselijke PVAT-afgeleide cellen, zoals aangegeven in de vorige stap. Elke passage moet niet groter dan een split 1:2. Cellen zijn 5-7 keer gepasseerd voordat de toewijzing voor differentiatie testen.

3. protocol 2: Cultuur menselijke beenmerg MSC kolonies

Opmerking: Menselijke beenmerg MSC zijn geïsoleerd als beschreven8 en opgeslagen als bevroren voorraden de vroege passage bevriezen media (70% FBS 20% basale DMEM en 10% DMSO) ~ 100.000 cel/ml in vloeibare N2.

  1. Snel ontdooien van een flacon van beenmerg MSC van de vloeistof N2 in een waterbad 37 ° C en de plaat aan één putje van de plaat van een 6-well cultuur met 3 mL MSC groei media en na een nacht bebroeden bij 37 ° C en 5% CO2.
  2. Op de volgende dag, gecombineerd MSC cultuurmedia en wassen van de cellen 3 x in 2 mL zuiver HBSS. Bij 100% samenvloeiing, gecombineerd groei media en wassen van de cellen 3 x in 2 mL zuiver HBSS. Voeg 500 µL per putje cell detachement oplossing en Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 voor 5 min. Tap de plaat om alle cellen zijn verdreven en inhoud aan 2 putjes van de plaat van een 6-well met 2 mL MSC groei media gelijkmatig te verdelen.
  3. Vouw het menselijke beenmerg en PVAT afkomstige MSC parallel voor ongeveer 5-7 passages of tot voldoende hoeveelheden voor het testen is bereikt.

4. protocol 3: Plaat en veroorzaken Adipogenic, Osteogenic, en Chondrogenic Lineages

  1. De passende nummers van de plaat van beenmerg- en PVAT-afgeleide cellen per putje van de plaat van een 12-goed en passend wordt gerepliceerd voor elke experimentele voorwaarde. Voor adipogenic en osteogenic voorwaarden, ~ 200 zijn 000 – 225.000 cellen/well nodig, voor chondrogenic voorwaarden, 150.000 – 175.000 cellen per putje nodig zijn.
    Opmerking: We liepen een minimum van N = 3 repliceren putten voor controle en voorwaarden voor elk experimenteel lineage geïnduceerde voor een totaal van 2 onafhankelijke loopt (N = 6 replicatieonderzoeken totaal).
  2. Cellen van zowel de menselijke PVAT progenitor cel bevolking en de menselijke beenmerg MSC bevolking met behulp van mobiele-detachement oplossing en incubatie bij 37 ° C en 5% CO2 voor 5 min. zwembad populaties in aparte 15 mL conische flesjes te verbreken. Draai het flesje naar beneden bij 500 x g gedurende 7 minuten aan het einde van de cellen. Resuspendeer in 1 mL PBS en gebruik een hemocytometer om het schatten van het aantal cellen.
  3. Plaat de cellen in 12-well gerechten zoals aangegeven in stap 4.1. Aparte gerechten voor geïnduceerde en niet-geïnduceerde adipogenic, osteogenic, en voorwaarden leveren, zodat de niet-geïnduceerde aandoening kan worden opgelost op een eerder tijdstip zonder het verstoren van de voortzetting van de cultuur van de geïnduceerde aandoening.
  4. Voeg 1,5 mL van adipogenic en osteogenic inductie media aan elk putje van de geïnduceerde aandoening. Voeg 1,5 mL van adipogenic en osteogenic niet-inductie media aan elk putje van de niet-geïnduceerde aandoening. Incubatie van de adipogenic en de osteogenic geïnduceerde en niet-geïnduceerde cel populaties op 37 ° C en 5% CO2te beginnen.
  5. Spin down de resterende hoeveelheid menselijke PVAT voorlopercellen en menselijke beenmerg MSCs gedurende 7 minuten bij 500 x g.
  6. Bepalen het volume moest resuspendeer de resterende beenmerg en PVAT afkomstige cel pellets om een bevolkingsdichtheid van 100.000 cellen/10 µL (106 cellen/mL). Resuspendeer pellets in de berekende hoeveelheid MSC groei media voor chondrogenic lineage inductie. Zachtjes gaan de hoeveelheid cellen op en neer met behulp van een pipet om een homogene verdeling.
  7. Pipetteer een druppel 10 µL van de cel van de geconcentreerde oplossing in het midden van elk putje te vormen van een micromass van 100.000 cellen. Breng 1 mL steriele H2O in de aangrenzende goed ter voorkoming van verdamping. Incubeer de culturen van de micromass gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2 om de micromass tot totaal.
  8. Na 2 uur, voeg voorzichtig chondrogenic differentiatie media verrijkt met 10 ng/mL menselijke TGFβ1 aan elk van de geïnduceerde-conditie putten. Voeg 1,5 mL van de niet-inductie-media (beenmerg MSC groei media) voorzichtig de putjes met niet-geïnduceerde aandoening. Gebruik aparte 12-Wells-platen voor de geïnduceerde en niet-induced voorwaarden zodat de niet-geïnduceerde aandoening kan worden opgelost op een eerder tijdstip.

5. Protocol nr. 4: Adipogenic, Osteogenic, en Chondrogenic Lineages cultuur voor 14 dagen

  1. Cultuur de geïnduceerde en niet-induced voorwaarden voor alle drie geslachten voor 4 dagen bij 37 ° C en 5% CO2, verfrissende media om de 2 dagen. Op dag 4, wijzigen de geïnduceerde adipogenic lineage voorwaarde van inductie media onderhoud media voor de rest van de bepaling.
  2. Alle niet-induced voorwaarden vast te stellen in 10% formaline voor 12 h. vervreemding van formaline en wassen alle vaste wells 2 x in PBS om alle sporen van formaline te verwijderen. Platen in PBS opslaan bij 4 ° C tot verwerking.
  3. Cultuur van de geïnduceerde voorwaarden voor een totaal van 14 dagen, verfrissende media om de 2 dagen. Verse TGFβ1 op 10 ng/mL eindconcentratie met elke refresh van de media van de inductie chondrogenic toevoegen. Blijven aan de cultuur van de bloedlijn van de adipogenic in de adipogenic onderhoud media en osteogenic afkomst inductie, vernieuwen om de 2 dagen. Op dag 14, correctie van alle geïnduceerde voorwaarden voor 12u in 10% formaline voor kleuring.
  4. Schrapen of giet de micromass in de geïnduceerde chondrogenic voorwaarde in een cassette voor het insluiten. Uitdrogen van de micromass in een reeks van steeds meer geconcentreerde alcohol baden voor 5 min, beginnend op 70% dan 80%, tweemaal in 95%, en tweemaal meer in absolute alcohol. Plaats de cassette in een dealcoholization agent en vervolgens ten slotte het insluiten van de cassette in paraffine voor segmenteren en kleuring.

6. protocol 5: Vlekken Adipogenic staat met olie rood O

  1. Bereiden olie Red O stockoplossing door ontbinding van 350 mg van olie Red O in 100 mL voor 100% isopropanol. Meng gedurende 2 uur met een roer bar en vacuüm door een 0,2 µm filter. Stockoplossing kan worden opgeslagen in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 jaar.
  2. Bereiden olie Red O werkoplossing door het mengen van 3 delen stockoplossing met 2 delen diH20 (b.v. 60 mL van de stockoplossing tot 40 mL diH20). De uiteindelijke concentratie van olie Red O in de werkoplossing is 2,1 mg/mL.
  3. Verwijder alle vloeistof uit putten. Wassen elke goed 2 x met 60% isopropanol, ervoor zorgend om volledig verwijderen van al het water uit de zijkanten van de putten. Gecombineerd 60% isopropanol en olie Red O werkoplossing snel toe te voegen zonder te raken de muren van de putten ter dekking van de bodem. Het is essentieel dat deze stap snel gebeurt zodat de putten niet doen droog.
  4. Zodra de olie Red O wordt toegevoegd, Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met zachte schommelen.
  5. Verwijder alle olie Red O en onmiddellijk Voeg gedistilleerd H2O. Wash met gedestilleerd H2O voor 10 m om te beginnen met het verwijderen van niet-afhankelijke olie rood O. Na 10 min, olie Red O gecombineerd en herhaal de procedure wassen 3 x.
  6. Zodra wassen voltooid is, toevoegen van PBS en beeld van de cellen. Gekleurde cellen in PBS bewaren bij 4 ° C.

7. protocol 6: Vlekken Osteogenic staat met Alizarine rood

  1. Verwijder alle vloeistof uit elk putje. Passende omvang van 2% Alizarine rode vlek-oplossing toevoegen aan elk putje (1,5 mL per putje van een 12-well-plaat) en zachtjes de plaat links-naar-rechts kantelen totdat de oplossing volledig de bodem van de put bedekt.
  2. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Alizarine rood verwijderen uit de putten. Spoel zachtjes elk goed viermaal met gedestilleerd H2O, nemen voorzichtigheid te verjagen niet calcium kristallen. Laten drogen.

8. protocol 7: Vlekken Chondrogenic staat met Masson van Trichrome

  1. Bak de dia's in een droge oven van 60 ° C gedurende 30 minuten Deparaffinize en hydraat secties aan gedestilleerd water.
    1. Om te hydrateren, plaatst u de dia's in drie 5 min incubations met dealcoholization agenten, gevolgd door 5 min incubations in aflopende alcohol concentraties als volgt: twee op 100% (absolute ethanol), twee op 95% alcohol, twee op 80%, twee op 70%, en ten slotte twee in gedistilleerd H2O. Slides in H2O kan blijven terwijl de Bouin-fixeerspray is voorbereid.
  2. Plaats 40 mL Bouin van fixeerspray in een pot van kunststof microwavable coplin (onbedekt). Magnetron op hoog om temp aan 55 ° C. Plaats dia in verwarmde oplossing voor 20 min; laat staan op de teller gedekt. Wassen in stromend kraantjeswater gedurende 10 minuten of totdat alle van de gele kleur volledig is verdwenen.
  3. Vlek secties in Weigert de Haematoxyline voor 10 min. Wash in stromend kraantjeswater voor 10 min.
  4. Vlek secties in Beibrich de dieprode zure Fuchsine oplossing voor 10 min. Wash 3 x 10 min in leidingwater. Mordant dia's in de zure oplossing phosphotungstic/phosphomolybdic voor 10 min. Niet spoelen.
  5. Plaats dia's direct in aniline blauwe oplossing gedurende 10 minuten spoelen met twee korte dips in leidingwater.
  6. Dia's in azijnzuur 1%-oplossing gedurende 3 tot 5 minuten wassen in leidingwater voor 1 min. plaats in 95% ethanol voor 1 min. Dehydrate plaatsen, zoals aangegeven in stap 5.4 en zware montering met kunsthars.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolatie van stromale vasculaire breuk van menselijke PVAT

Figuur 1A blijkt een schematische voorstelling van de anatomische regio waar de PVAT de oplopende aorta overliggende werd verkregen. We beschreven eerder de patiënt populaties ondergaan coronaire bypass enten waaruit deze monsters afgeleide6 werden. Figuur 1B ziet u een voorbeeld van de menselijke PVAT verkregen na chirurgie. Figuur 1 c toont een representatieve PVAT weefselsectie gekleurd met Masson van Trichrome vlek. Figuur 1 d is een fase contract opname toont een bevolking van PVAT-afgeleide stromale cellen tijdens de ontwikkelingsfase vóór differentiatie. Cellen kunnen worden uitgebreid en bevroren voor toekomstig gebruik. Cellen zijn meestal ingevroren bij een dichtheid van 2,5 x 105 cellen/mL in een media bestaat uit 70% FBS, 20% basale (antibioticum gratis) DMEM F12 en 10% DMSO in een isopropanol-cryochamber bij-80 ° C gedurende 24 h en verhuisde naar de vloeibare fase van een vloeibare N2 vriezer voor lange-t ERM-opslag.

Adipogenic differentiatie

Studies werden uitgevoerd in parallel met menselijke beenmerg-afgeleide MSC (figuur 2AB) en PVAT-afgeleide voorlopercellen (figuur 2CD). De linker panelen van Figuur 2 Toon de niet-geïnduceerde aandoening, waar geen lipide-accumulatie is duidelijk. De juiste panelen Toon cellen volgend adipocyte differentiatie en verkleuring van de neutrale lipiden met olie rood O. Terwijl de graad van differentiatie in de menselijke aorta PVAT-afgeleide cellen robuuster is, tentoongesteld beide bronnen van menselijke cel de mogelijkheid om te differentiëren naar de afkomst van de adipogenic.

Osteogenic differentiatie

Het osteogenic differentiatie-protocol werd gebruikt voor menselijke beenmerg-afgeleide MSC (figuur 3A-C) en PVAT-afgeleide cellen (figuur 3D– F). Non-geïnduceerde cellen (figuur 3AD) heeft geen vlekken met Alizarine rood. Na het protocol van osteogenic differentiatie, ontwikkeld om de menselijke MSC kalkhoudend knobbeltjes die gekleurd met Alizarine rood (figuur 3B– C), terwijl menselijke aorta PVAT-afgeleide cellen niet (figuur 3E– F). Deze gegevens wijzen erop dat onze voorbereiding van cellen uit de stromale vasculaire afvalfractie mens PVAT niet aanzienlijk aantal progenitoren met de mogelijkheid om ondergaan osteogenesis. Afhankelijk van de studie en tijd loop van differentiatie is het raadzaam te volgen standaard vlekken met opsporing van moleculaire merkers die osteogenic lineage inzet (bijv. RUNX2, osterix, alkalische fosfatase) of botcellen (osteopontin, definiëren osteocalcin, alkalische fosfatase, BAP1).

Chondrogenic differentiatie

Cellen afgeleid van zowel menselijke beenmerg MSC (figuur 4A) en menselijke PVAT (figuur 4B) weer kenmerken kenmerk van chondrogenic differentiatie, met overvloedige collageen accumulatie in de micromass. Micromasses gevormd uit menselijke beenmerg MSC en aorta PVAT-afgeleide cellen ook tentoongesteld overvloedige accumulatie van glycosaminoglycanen (blauw), zoals aangegeven door Alcian blauw kleuring (figuur 4C-D, respectievelijk). Morfologisch, structuren vergelijkbaar met lacunes geconstateerd met cellen zitten in Holten omringende door collageen afzetting (Figuur 4, pijlen). Afhankelijk van de studie en tijd loop van differentiatie, het detecteren van merkers van de specifieke chondrogenic (aggrecan, collageen type II, osteonectin, Sox9) is handig.

Figure 1
Figuur 1: morfologische kenmerken van menselijke PVAT. (A) Cartoon afbeelden van de menselijke aorta (rood) met de omliggende PVAT (geel). Pijl geeft oplopende aorta. (B) een 480 mg stuk van menselijke aorta PVAT uit een CABG patiënt in DMEM vóór dissociatie. (C) Masson van trichrome kleuring van formaline-vaste paraffine-ingebedde menselijke PVAT (donker bruin/zwart = kernen, blauw/paarse = bindweefsel, roze = cytoplasma; Opmerking, RBC verschijnen rood-roze. (D) representatieve afbeelding van transplanteren PVAT-stromale cellen op 7 dagen in de cultuur. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: Adipogenic differentiatie. (A) fase microscopie van het menselijke beenmerg MSC in de niet-geïnduceerde aandoening geen van differentiatie getuigt. (B) fase microscopie van het menselijke beenmerg MSC in de geïnduceerde adipogenic voorwaarde bevat enkele differentiatie en immobilisatie van neutrale lipiden, gekleurd met olie Red O na 14 dagen. (C) fase microscopie van de menselijke aorta PVAT-afgeleide cellen in de niet-geïnduceerde adipogenic voorwaarde geen van differentiatie getuigt. (D) fase microscopie van de menselijke aorta PVAT-afgeleide cellen in de geïnduceerde adipogenic voorwaarde toont robuust differentiatie en immobilisatie van neutrale lipiden, gekleurd met olie Red O na 14 dagen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Osteogenic differentiatie. (A) fase microscopie van het menselijke beenmerg MSC in de niet-geïnduceerde osteogenic voorwaarde geen van differentiatie naar een osteogenic afstamming getuigt. (B) fase microscopie van het menselijke beenmerg MSC in de geïnduceerde aandoening na 14 dagen in cultuur toont bewijs van differentiatie en de vorming van kalkaanslag gekleurd met Alizarine rood (pijlen). (C) een beeld van het putje met het menselijke beenmerg MSC in de geïnduceerde osteogenic voorwaarde na kleuring met Alizarine rood geeft overvloedige calcium depositie, succesvolle differentiatie naar een osteogenic afstamming (pijlen, suggereren afzetting van calcium). (D) fase microscopie van de aorta menselijke PVAT-afgeleide cellen in de niet-geïnduceerde osteogenic voorwaarde geen indicatie van differentiatie naar een osteogenic afstamming vertoont. (E) fase microscopie van de aorta menselijke PVAT-afgeleide cellen in de geïnduceerde osteogenic voorwaarde na 14 dagen in cultuur toont geen bewijs van differentiatie naar een osteogenic afstamming of afzetting van calcium wanneer alleen met Alizarine rood gekleurd niet-specifieke kleuring. (F) een beeld van het putje met de menselijke aorta PVAT-afgeleide cellen in de geïnduceerde osteogenic voorwaarde volgende kleuring met Alizarine rood alleen niet-specifieke toont kleuring. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Chondrogenic differentiatie. (A, B) De lichte microscopie van een deel van de micromass gevormd door menselijke beenmerg MSC (A) of menselijke aorta PVAT voorlopercellen (B) in de geïnduceerde chondrogenic voorwaarde na 14 dagen in cultuur en vervolgens gekleurd met Masson van Trichrome, waarin aanzienlijke afzetting van collageen (blauw) en stelt voor succesvolle differentiatie naar een chondrogenic afkomst. (C, D) De lichte microscopie van een deel van de micromass gevormd door menselijke beenmerg MSC (C) of menselijke aorta PVAT voorlopercellen (D) in de geïnduceerde chondrogenic voorwaarde na 14 dagen in cultuur en vervolgens gekleurd met Alcian blauw, wat erop wijst afzetting van zuur proteoglycans (bijvoorbeeld glycosaminoglycanen) als zijn meestal te vinden in kraakbeen. Counterstain, nucleaire snel rood; pijlen, lacunes-achtige structuren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Obesitas voorlopercellen van verschillende depots verschillen in fenotype en differentiatie potentiële9. Kweken van PVAT afkomstige progenitoren uit een enkele patiënt donor in gelijktijdige inductie neer drie verschillende geslachten, zorgt adipogenic, osteogenic, en chondrogenic, voor een goed gecontroleerd onderzoek van de pluripotente capaciteit van deze roman bevolking van voorlopercellen. De in dit verslag beschreven methodologie kan worden gebruikt voor het testen van de capaciteit van de differentiatie van stamcellen van menselijke PVAT en om hun functie bij het reguleren van PVAT pathologieën en vasculaire Toon te begrijpen. Enkele voordelen van deze techniek zijn de eenvoud en het gebruik van primaire menselijk weefsel van coronaire bypass patiënten, waardoor het onderzoek naar de functie van de cel van PVAT voorlopercellen van patiënten met een ernstige hart-en vaatziekten. Echter, explantaten uit 500 mg stuk weefsel meestal opbrengst < 1000 aanhanger cellen en vereisen dus 5 – 7 doorgangen naar voldoende aantallen, markeren een belangrijk voorbehoud om deze aanpak te verkrijgen. Cruciaal voor het succes van de tri-bloedlijn differentiatie experimenten is de kwaliteit van de oorspronkelijke cel explant van donor PVAT. Het is essentieel voor fijn gehakt het weefsel grondig voorafgaand aan enzymatische dissociatie. Bovendien, in tegenstelling tot andere explant protocollen vonden we een dramatisch verlies van celaantal, de levensvatbaarheid en de algehele kwaliteit, toen rode bloedcellen lysis-buffermengsel werd gebruikt voordat plating. In plaats daarvan, is het sterk aanbevolen om de plaat van de gehele stromale vasculaire fractie (met inbegrip van de rode bloedcellen). Na 24u, Adherente cellen zal hebben toegevoegd en niet-lysed rode bloedcellen kan worden verwijderd door middel van herhaalde wast met HBSS. Passaging van de PVAT-afgeleide stromale cellen moet niet groter zijn dan 1:2 splitst. Wanneer de cellen split 1:3 of hoger werden, zien we een daling groeitempo op jaarbasis.

Het moeilijkste onderdeel van de trilineage differentiatie bepaling staat het chondrogenic, daar het vereist dat een minder voorkomende methode van kweken cellen in een "micromass" en histologische insluiten en segmenteren. Zorg moet men zich goed plaat de 10 µL druppel van 100.000 cellen en niet storen de massa over het toevoegen van kweekmedium. We vonden de variatie tussen de tests ten aanzien van al dan niet de micromass bleef zelfklevend aan de plaat of geschorst in het medium. Zelfs wanneer de massa niet gebleven zelfklevend, bleef de micromass structuur en cel levensvatbaarheid consistent.

Cellen van de stam of voorlopercellen communicatie in het vasculaire zijn verantwoordelijk voor weefselherstel in reactie op letsel of ziekte. Populaties die uit pericyte/adventitial compartimenten voortvloeien, meest goed gekenmerkt zijn, hoewel er nog steeds controverse over de vraag of er is een gestandaardiseerde moleculaire identificatie van deze populaties in mensen10,11 . In dit protocol bestuderen we een voorvader-celpopulatie specifiek afgeleid van menselijke PVAT voor het testen van hun neiging om te onderscheiden aan een geslacht van osteogenic, chondrogenic of adipogenic. Definiëren met behulp van kleuring technieken cellulaire inzet voor elk geslacht, we laten zien dat in tegenstelling tot MSC uit menselijke beenmerg, voorlopercellen van menselijke PVAT niet in staat waren om te differentiëren naar een osteogenic afstamming (Figuur 3) maar vertonen robuuste adipogenic differentiatie. De capaciteit van de differentiatie chondrogenic is vergelijkbaar tussen beenmerg- en PVAT-afgeleide cellen. Dit suggereert dat PVAT afkomstige voorlopercellen meer geslacht dan beenmerg MSC beperkt wellicht of dat de progenitoren PVAT geen gemakkelijk onderscheid in osteogenic geslachten maken. Toekomstige studies moeten omvatten een onderzoek van gen- en eiwit expressie van merkers voor elk geslacht aan de capaciteit van de differentiatie van PVAT-afgeleide cellen meer kwantitatief te evalueren.

Stamcellen adipeus afkomstige geweest een focus voor regeneratieve geneeskunde toepassingen, vanwege de gemakkelijke toegang en het hoge aantal cellen die kan worden afgeleid uit vetweefsel12,13. Binnen de stromale vasculaire Fractie van vetweefsel zijn er vasculaire cellen, ontstekingscellen, fibroblasten, preadipocytes en adipeus-afgeleide cellen van de stam. Er zijn verschillen in de bevolking van de cel van de stam op basis van anatomische locatie van de obesitas depot en adipocyte kenmerken14. Bovenal lijkt de cel van de stam van het adipeus afkomstige te hebben van de capaciteit niet alleen om te differentiëren mesenchymale lineages15, maar ook potentieel neuronale16,17 en epidermale18 lot te nemen.

Talrijke studies hebben gericht op stam/voorlopercellen afgeleid van menselijke witte onderhuids vetweefsel, maar zeer weinig studies hebben kenmerken van de bevolking van de voorvader van PVAT gericht. Recente studies hebben geïsoleerd adipocyte voorlopercellen van PVAT omliggende mesenterische vaartuigen of thoracale aorta van de rat. Deze CD34 +/ CD140a + populaties onderscheiden in adipocytes, hoewel de capaciteit voor het afleiden van andere geslachten niet was getest19.

We kenmerkte onlangs obesitas voorlopercellen afgeleid uit de stromale vasculaire afvalfractie menselijke PVAT van patiënten met geavanceerde coronaire ziekte6. Deze obesitas voorlopercellen waren CD73 +, CD105 +, en CD140a +, en efficiënt gedifferentieerd in adipocytes met thermogene kenmerken (UCP1 expressie)6. In het huidige werk vonden we een beperkte lineage potentie van de PVAT-afgeleide cellen ten opzichte van het beenmerg-afgeleide MSC, suggereert een gebrek aan of de minimale bevolking van adipeus afkomstige stamcellen dat van andere menselijke vetweefsel gekenmerkt. Een overweging voor dit protocol is de verwachte variabiliteit tussen menselijke specimens, die invloed kunnen hebben op het aantal stam/voorlopercellen binnen het PVAT monster en hun capaciteit voor het ondergaan van differentiatie naar verschillende geslachten. Leeftijd, geslacht, BMI, medicijnen en andere klinische parameters waarschijnlijk invloed op het fenotype van voorlopercellen binnen PVAT. Verwachte toekomstige wijzigingen van dit protocol wachten dus op een meer duidelijk omschreven voorlopercellen bevolking binnen de menselijke PVAT, en eventueel onder gebruikmaking van cel Sorteren te isoleren van de specifieke subpopulatie voor lineage studies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij erkennen de hulp van onderzoek navigatie in Maine Medical Center voor het helpen met het verkrijgen van klinische weefsel, en de histopathologie en Histomorphometry Core (ondersteund door 1P20GM121301, L. Liaw PI) bij Maine Medical Center Research Instituut voor segmenteren en kleuring. Dit werk werd gesteund door de NIH verlenen R01 HL141149 (L. Liaw).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I   Millipore-Sigma SCR139 50mg
Alcian Blue NewComerSupply 1003A 1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red Amresco 9436-25G
alpha-MEM ThermoFisher 12561056
Aniline Blue NewComerSupply 10073C
Antibiotic/antimycotic ThermoFisher 15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin Millipore-Sigma A3908-25G
b-glycerophosphate Millipore-Sigma G9422-10G
Biebrich Scarlet EKI 2248-25G
Biotin Millipore-Sigma B4501-100MG
Bouin's fixative NewComerSupply 1020A
Bovine serum albumin Calbiochem 12659 stored at 4 °C
Cell detachment solution Accutase AT104
Bell strainer (70 mm) Corning 352350
Dexamethasone Millipore-Sigma D4902-100MG
DMEM Corning 10-013-CV 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium ThermoFisher 10565-042 high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO Millipore-Sigma D2650
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals  S11550
FGF2 Peprotech 100-18B
Formalin NewComerSupply 1090
Gelatin, bovine skin Millipore-Sigma G9391-500G
Glutamax ThermoFisher 35050061 glutamine supplement
HBSS Lonza 10-547F
IBMX Millipore-Sigma I5879-250MG
Insulin solution Millipore-Sigma I9278-5ML
Oil red O Millipore-Sigma O0625-100G
Pantothenic acid Millipore-Sigma P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution ThermoFisher 15240062 100ml
Permount Fisher SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution Millipore-Sigma P4006-100G/221856-100G
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone Millipore-Sigma R2408-10MG
TGFb1 Peprotech 100-21
Weigert's hematoxylin EKI 4880-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
  2. Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
  3. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  4. Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
  5. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  6. Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
  7. Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
  10. de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
  11. Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
  12. Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
  13. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  14. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
  15. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  16. Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
  17. Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
  18. Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
  19. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).

Tags

Biologie kwestie 145 menselijke gerelateerde adipeus weefsel obesitas voorlopercellen mesenchymale stamcellen chondrogenesis osteogenesis adipogenesis celdifferentiatie hart-en vaatziekten
Differentiatie capaciteit van menselijke aorta gerelateerde adipeus voorlopercellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scott, S. S., Yang, X., Robich, M.,… More

Scott, S. S., Yang, X., Robich, M., Liaw, L., Boucher, J. M. Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (145), e59337, doi:10.3791/59337 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter