Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Differentiering kapacitet av mänskliga aorta perivaskulär Adipose stamceller

Published: March 5, 2019 doi: 10.3791/59337
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Maine Medical Center Research Institute

Summary

Målet med detta protokoll är att testa stamceller som härrör från mänskliga perivaskulär fettvävnad förmåga att differentieras till flera cell härstamningar. Differentiering jämfördes mesenkymala stamceller som härrör från human benmärg, som är känd att differentieras till fettceller, osteocyte och chondrocyte härstamningar.

Abstract

Fettväv är en rik källa av flera potenta mesenkymala stamceller (MSC) kan differentiera till osteogent, adipogena, och chondrogenic härstamningar. Adipogena differentiering av stamceller är en viktig mekanism körning adipose vävnadsexpansion och dysfunktion i svar till fetma. Förståelse ändringar perivaskulär fettvävnad (PVAT) är alltså kliniskt relevanta i metabola sjukdomar. Tidigare studier har dock huvudsakligen utförs i musen och andra djur modeller. Detta protokoll använder mänskliga bröstkorg PVAT prover som samlats in från patienter som genomgick koronar bypass kirurgi. Fettvävnad från aorta ascendens var samlas och används för explantation av stromal vaskulär fraktionen. Vi tidigare bekräftat förekomsten av fett stamceller i mänskliga PVAT med förmåga att differentieras till lipid-innehållande adipocyter. I denna studie analyserade vi ytterligare differentiering potential celler från den stromal vaskulära fraktionen, som förmodligen innehåller flera potenta stamceller. Vi jämförde PVAT-derived celler till mänsklig benmärg MSC för differentiering in adipogena, osteogena, och chondrogenic härstamningar. Efter 14 dagar av differentiering, utnyttjades specifika fläckar för att upptäcka lipid ackumulering i adipocyter (olja röd O), förkalkade inlåning i osteogena celler (Alizarin Red), eller glykosaminoglykaner och kollagen i chondrogenic celler (Masson's Trichrome). Samtidigt benmärg MSC effektivt differentieras efter alla tre härstamningar, PVAT-derived celler hade adipogena och chondrogenic potentiella, men saknade robust osteogent potential.

Introduction

Fettväv är en rik källa av flera potenta mesenkymala stamceller (MSC) kan differentiera till osteogent, adipogena, och chondrogenic härstamningar1. Denna vävnad expanderar genom hypertrofi av mogen adipocyter och de novo differentiering av bosatta MSC till adipocyter. Perivaskulär fettväv (PVAT) omger blodkärl och reglerar vaskulär funktion2,3. Fetma-inducerad PVAT expansion förvärrar kardiovaskulära patologier. Medan Multipotenta potentialen hos MSC från mänskliga subkutana fett depåer har varit studerade4,5, har inga studier explanterad och utvärderas differentiering kapaciteten av mänsklig PVAT-derived stamceller, sannolikt på grund invasivitet av upphandling. Målet med detta arbete är således att tillhandahålla metoder att explant och propagera stamceller från mänskliga aorta PVAT från patienter med hjärtkärlsjukdom och testa deras benägenhet att differentiera till osteogent, chondrogenic och adipogena härstamningar. Våra PVAT kommer från platsen för anastomos av bypass transplantat på stigande aorta av överviktiga patienter som genomgick koronar bypass kirurgi. Färsk-isolerad PVAT är enzymatiskt-differentierade och stromal vaskulär fraktionen är isolerade och förökade in vitro gör det möjligt för oss att testa för första gången differentiering kapaciteten av mänsklig PVAT-derived stamceller.

Med primära odlade mänskliga PVAT stromal vaskulär bråkdel, testade vi tre analyser för att inducera stamceller/stamceller att differentiera mot adipogena, osteogena, eller chondrogenic härstamningar. Vår tidigare studie identifierat en befolkning på CD73 +, CD105 + och PDGFRa + (CD140a)-celler som kraftfullt kan skilja i adipocyter6, även om deras multipotency inte testades. PVAT reglerar direkt vaskulär tonen och inflammation7. Grunden för testning differentiering potentialen i denna roman cell befolkningen är att börja förstå specialiserade påverkan av PVAT på vaskulär funktion och mekanismer för PVAT expansion under fetma. Denna metod ökar vår förståelse för funktionerna av fettvävnad härledda stamceller och gör det möjligt för oss att identifiera och jämföra likheter och skillnader av stamceller från olika vävnad källor. Vi bygger på etablerade och validerade metoder för isolering och differentiera MSC mot olika härstamningar och optimera procedurer för att maximera lönsamheten för mänskliga PVAT-derived stamceller. Dessa tekniker har bred applikationer i fälten av stammen och progenitor cell forskning och fettvävnad utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Användningen av mänskliga vävnader i denna studie var utvärderats och godkänts av institutionella i styrelsen av Maine Medical Center, och all personal fått lämplig utbildning före experiment.

1. förberedelser

  1. Gör dissociation buffert genom beredning av 50 mg djurfria kollagenas/dispase blandning jag lösning med 1 mL nanopure H2O. förbereda 1 mg/mL arbetslösning genom att tillsätta höga glukos DMEM som innehåller 1% w/v BSA till den rekonstituerade kollagenas 49 mL / dispase lösning. Lagra 5 mL arbetande alikvoter vid-20 ° C och varma till 37 ° C med ett vatten bad före för att använda.
  2. Gör antibiotika lösning genom att tillsätta 1 mL 100 x antibiotikum/antimycotic lösning (slutlig koncentration är 200 enheter/mL penicillin, 200 enheter/mL streptomycin och 0,5 µg/mL fungizone) till 49 mL HBSS och lagra på is.
  3. Förbereda gelatin lösningen (0,2% w/v) genom upplösning 200 mg gelatin från nötkreatur hud i 100 mL nanopure H2O. autoklav lösningen för 20 min och förvaras vid 4 ° C.
  4. Förbereda 500 mL av PVAT tillväxt medier: hög glukos DMEM/F12 med glutamin tillägg, natrium Pyruvat och natriumbikarbonat, kompletterad med 10% FBS och 100 µg/mL antimikrobiellt medel (se Tabell för material).
  5. Förbered 50 mL adipogena induktion: 40,8 mL hög glukos DMEM, kompletterat med 7,5 mL PVAT tillväxt medier, 500 µL av 100 x antibiotikum/antimycotic lösning (slutlig koncentration är 100 enheter/mL penicillin, 100 enheter/mL streptomycin och 0,25 µg/mL fungizone), 0,5 mM IBMX (500 mM lager i 0,1 M NaOH), 1 µM dexametason (1 mM lager i etanol), 5 µM Rosiglitazon (5 mM lager i DMSO), 33 µM biotin (66 mM lager i DMSO), 100 nM insulin (200 µM lager i 0,1% ättiksyra) och 20 µM Pantotensyra (100 mM lager i H2 (O).
  6. Förbereda 50 mL kontroll induktion media för den adipogena härstamning: 40,8 mL hög glukos DMEM kompletteras med 7,5 mL PVAT tillväxt medier och 500 µL av pen-strep (100 x lager).
  7. Förbereda 50 mL adipogena underhållsmassmedia: 41,5 mL hög glukos DMEM kompletteras med 7,5 mL PVAT tillväxt medier från steg 1.3, 500 µL penna-strep (100 x lager), 1 µM dexametason (1 mM lager i EtOH), 33 µM biotin (66 mM lager i DMSO), 100 nM insulin (200 µM lager i 0,1% ac etic syra), och 20 µM Pantotensyra (100 mM lager i H2O).
  8. Förbereda 500 mL Odlingsmedier för de osteogent och chondrogenic härstamningar: hög glukos αMEM kompletteras med 10% FBS, 1 x glutamin komplement (se Tabell av material) och 5 mL penna-strep (100 x lager).
  9. Förbereda 50 mL induktion media osteogent härstamning: 50 mL benmärg MSC tillväxt medier kompletteras med 10 nM dexametason och 10 mM β-glycerofosfat.
  10. Förbereda 50 mL induktion media för den chondrogenic härstamning: 50 mL benmärg MSC tillväxt medier kompletteras med 100 nM dexametason, 50 µg/mL askorbat-2-natriumfosfat och 10 ng/mL TGFβ1. Osteogena och chondrogenic villkor, kommer att basal benmärgen MSC tillväxtmassmedia fungera som icke-induktion media.

2. protokoll 1: Kultur mänskliga PVAT celler från det Stromal vaskulära bråket

Obs: PVAT är resected från platsen för transplantat anastomos på aorta ascendens sövda patienter som genomgick koronar bypass transplantat förfaranden. Aorta PVAT är i en 15 mL koniska innehållande 10 mL is kall hög glukos DMEM F12 och flyttas från operationssalen till laboratoriet inom 2 timmar efter resektion. Aorta PVAT är kasserad vävnad under bypass förfarandet och har bedömts som icke-mänskliga försökspersoner forskning av Maine Medical Centers interna Review Board.

  1. Detta protokoll är för ett ~ 500 mg humant PVAT (cirka 3 x 1 x 0.5 cm3). Överföra färska mänskliga PVAT från DMEM till en 50 mL konisk tub som innehåller 25 mL antibiotika lösning. Inkubera med gunga under 20 minuter vid 4 ° C. När PVAT är antibiotiska lösning, Tina en alikvot av dissociation buffert vid 37 ° C.
  2. Tillsätt 50 µL 100 x antibiotikum/antimycotic lösning i 5 mL dissociation buffert och sterilisera med 0,22 µm spruta filter. Tillsätt 1 mL gelatin lösningen till 1 väl av en 24-well platta. I en LAF, Använd steril pincett och sax för att överföra PVAT från antibiotika lösningen till en steril petriskål. Tillsätt 1 mL pre värmde dissociation buffert till vävnaden och fint finhacka hela vävnaden till en slurry (inga bitar större än ~ 2 x 2 mm2) med hjälp av steril pincett och dissektion sax.
  3. Överför 1 mL suspensionen till 4 mL dissociation buffert och Inkubera röret på sin sida i en pre värmde 37 ° C orbital shaker på 200 rpm för 1 h. Efter 1 h, inga synliga vävnad bitar kommer att närvara och lösningen kommer att visas som en grumlig cellsuspension.
  4. Filtrera lösningen genom ett 70 µm cell sil ovanpå en 50 mL konisk tub. Skölj Silen med ytterligare 10 mL antibiotika lösning att fånga så många celler som möjligt. Inte pressa Silen.
  5. Pellet cellerna för 12 min på 300 x g i en svängande hink centrifug.
    Obs: Efter centrifugering, kommer att röret delas in i en fet översta lagret av adipocyter, en interphase och en pellet. Pelleten är andelen stromal vaskulär innehållande endotelceller, immuna celler, blodkroppar och stamceller.
  6. Återsuspendera pelleten i 10 mL HBSS och Centrifugera under 5 minuter vid 300 x g. Upprepa detta steg för totalt 2 tvättar i HBSS. Efter den sista tvättningen, inte att lysera röda blodkroppar. Upprepade försök med flera kommersiellt tillgängliga buffertar och inkubationstider har lett till en markant minskning progenitor cell fastsättning och livskraft.
  7. Aspirera gelatin från 24-väl plattan. Försiktigt tvätta väl 1 x med HBSS ta bort obundna gelatin.
  8. Återsuspendera stromal vaskulär bråkdel pelleten med intakta röda blodkroppar i 1 mL av tillväxtmassmedia och utsäde på den gelatin-belagd väl. Lägg till mänskliga FGF2 (resuspended i PBS kompletteras med 0,01% BSA w/v) till en slutlig koncentration av 25 ng/mL odlingsmedium. Inkubera under 24 timmar vid 37 ° C med 5% CO2.
  9. Nästa dag brunnar ta bort tillväxt medier och tvätta 5 x med HBSS ta bort röda blodkroppar och döda celler. Lägg i 1 mL av färska tillväxtmassmedia kompletteras med 25 ng/mL FGF2.
  10. Ändra media varje 48 h, se till att komplettera med 25 ng/mL färsk FGF2 varje gång.
  11. Celler normalt nå 100% sammanflödet 7-10 dagar efter explant; passagen celler då:
    1. Aspirera tillväxt medier och tvätta enskiktslager 2 x i 1 mL HBSS. Sug ut alla HBSS från brunnarna och tillsätt några droppar av cell dissociation lösning.
    2. Tryck på och snurra plattan flera gånger och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 för 5 – 7 min att lyfta cellerna. Tillsätt ~ 1 mL färskt odlingssubstrat till fristående celler och fördela 500 µL till 2 brunnar i en 24-well platta, varje innehållande 500 µL tillväxt medier och 25 ng FGF2.
  12. Fortsätt att expandera mänskliga PVAT-derived celler som anges i föregående steg. Varje passage bör inte vara större än en 1:2-split. Celler är överförda 5 – 7 gånger innan tilldelning för differentiering analyser.

3. protokoll 2: Kultur mänsklig benmärg MSC kolonier

Obs: Mänsklig benmärg MSC har isolerats som beskrivs8 och lagras som tidig passage fryst lager i frysa media (70% FBS 20% basala DMEM och 10% DMSO) på ~ 100 000 celler/mL i flytande N2.

  1. Snabbt Tina en injektionsflaska av benmärg MSC från vätska N2 i en 37 ° C vattenbad och plattan till en brunn 6-väl kultur platta innehållande 3 mL MSC tillväxt medier och inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
  2. Nästa dag, aspirera MSC kulturmassmedia och tvätta cellerna 3 x i 2 mL HBSS. På 100% confluence, aspirera tillväxt medier och tvätta cellerna 3 x i 2 mL HBSS. Tillsätt 500 µL per brunn cell avlossning lösning och inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 för 5 min. Tryck plattan att säkerställa alla celler är rubbas och jämnt fördela innehållet till 2 brunnar i en 6-well platta innehållande 2 mL MSC tillväxt medier.
  3. Expandera mänsklig benmärg och PVAT-derived MSC parallellt i cirka 5 – 7 passager eller tills tillräckliga mängder för att testa har uppnåtts.

4. protokoll 3: Plåt och försämrad Adipogena, Osteogena, och Chondrogenic härstamningar

  1. Plattan lämpligt antal benmärg och PVAT-derived celler per 12-well platta och lämpliga replikat för varje experimentella villkor. För adipogena och osteogent villkor, ~ 200, behövs 000 – 225 000 celler per brunn för chondrogenic villkorar, 150 000 – 175 000 celler per brunn behövs.
    Obs: Vi sprang minst N = 3 replikera brunnar för kontroll och inducerad villkor för varje experimentella härstamning för totalt 2 oberoende springa (N = 6 replikat totalt).
  2. Avassociera celler från både den mänskliga PVAT progenitor cell befolkningen och mänsklig benmärg MSC befolkningen använder cell avlossning lösning och inkubation vid 37 ° C och 5% CO2 för 5 min. Pool populationer i separat 15 mL koniska flaskor. Snurra injektionsflaskan nedåt vid 500 x g i 7 min till pellet cellerna. Återsuspendera i 1 mL PBS och Använd en hemocytometer för att uppskatta antalet cell.
  3. Platta celler i 12-väl rätter som anges i steg 4.1. Tillhandahålla separata rätter för inducerad och icke-inducerad adipogena, osteogena, och villkor så att icke-inducerad villkoret kan vara fast vid en tidigare tidpunkt utan att störa fortsätter kultur av inducerad villkora.
  4. Tillsätt 1,5 mL adipogena och osteogent induktion media till varje brunn av inducerad villkora. Tillsätt 1,5 mL adipogena och osteogent icke-induktion media till varje brunn av villkoret icke-inducerad. Börja inkubation av adipogena och osteogent inducerad och icke-inducerad cellpopulationer vid 37 ° C och 5% CO2.
  5. Snurra ner den resterande volymen av mänskliga PVAT stamceller och mänsklig benmärg MSCs för 7 min på 500 x g.
  6. Bestämma den volym som krävs för att resuspendera återstående benmärg och PVAT-derived cell pellets att uppnå en täthet av 100 000 celler/10 µL (106 celler/mL). Återsuspendera pellets i den beräknade volymen MSC Odlingsmedier för chondrogenic härstamning induktion. Flytta försiktigt volymen av celler upp och ner med en Pipettera för att säkerställa en homogen fördelning.
  7. Pipettera en 10 µL droplet koncentrerad cell lösning i mitten av varje brunn för att bilda en micromass av 100 000 celler. Placera 1 mL steril H2O i intilliggande brunnen för att förhindra avdunstning. Inkubera micromass kulturerna för 2 h vid 37 ° C och 5% CO2 att micromass till samlade.
  8. Efter 2 timmar, tillsätt försiktigt chondrogenic differentiering media spetsade med 10 ng/mL mänskliga TGFβ1 vardera till inducerad-skick brunnarna. Tillsätt försiktigt 1,5 mL icke-induktion media (benmärg MSC Tillväxtmassmedia) till icke-inducerad skick brunnarna. Använda separat 12 brunnar för inducerad och icke-inducerad villkoren så att det icke-inducerad villkoret kan fastställas vid en tidigare tidpunkt.

5. protokoll 4: Chondrogenic utvecklingslinjerna i 14 dagar och kultur Adipogena, Osteogena,

  1. Kultur de inducerade och icke-inducerad villkoren för alla tre utvecklingslinjerna för 4 dagar vid 37 ° C och 5% CO2, uppfriskande media varje 2 dagar. På dag 4, ändra villkoret inducerad adipogena härstamning från induktion media till underhållsmassmedia för återstoden av analysen.
  2. Fixa alla icke-inducerad villkor i 10% formalin för 12 h. Kassera formalin och tvätta alla fasta brunnar 2 x i PBS att avlägsna alla spår av formalin. Förvara tallrikar i PBS vid 4 ° C fram till bearbetning.
  3. Kultur inducerad villkoren för totalt 14 dagar, uppfriskande media varje 2 dagar. Lägga till färska TGFβ1 på 10 ng/mL slutlig koncentration med varje uppdatering av chondrogenic induktion media. Fortsätta att kultur adipogena härstamning i adipogena underhållsmassmedia och osteogent härstamning induktion media, uppfriskande varannan dag. Dag 14, fixa alla inducerad villkor för 12 h i 10% formalin för färgning.
  4. Skrapa eller häll i micromass i inducerade chondrogenic villkora i en kassett för inbäddning. Torka av micromass i en serie av alltmer koncentrerad alkohol bad för 5 min, med början i 70%, då 80%, två gånger i 95%, och två gånger mer i absolut alkohol. Placera kassetten i en dealcoholization agent och sedan slutligen bädda in kassetten i paraffin vax för snittning och färgning.

6. protokoll 5: Färgning Adipogena skick med olja röd O

  1. Förbereda olja röd O stamlösning av upplösning 350 mg olja röd O i 100 mL 100% isopropanol. Blanda i 2 h med en uppståndelse bar och vakuum genom ett 0,2 µm filter. Stamlösning kan förvaras i mörker vid rumstemperatur i 1 år.
  2. Förbereda olja röd O arbetar lösning genom att blanda 3 delar stamlösning till 2 delar Dihs20 (t.ex. 60 mL stamlösning till 40 mL Dihs20). Den slutliga koncentrationen av olja röd O i arbetslösning är 2,1 mg/mL.
  3. Ta bort all vätska från brunnar. Tvätta varje väl 2 x med 60% isopropanol, se till att helt ta bort allt vatten från sidorna av brunnarna. Sug ut 60% isopropanol och snabbt lägga till olja röd O fungerande lösning utan att vidröra väggarna av brunnarna att täcka botten. Det är viktigt att detta steg görs snabbt så brunnarna inte torka.
  4. När olja röd O läggs, Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur med mild gunga.
  5. Ta bort alla olja röd O och omedelbart lägga till destillerat H2O. Wash med destillerat H2O för 10 m till börjar ta bort obundna Oil Red O. Efter 10 min, aspirera olja röd O och upprepa förfarandet tvätt 3 x.
  6. När tvätten är klar, tillsätt PBS och bild cellerna. Lagra färgade celler i PBS vid 4 ° C.

7. protokoll 6: Färgning Osteogent skick med Alizarin Red

  1. Ta bort all vätska från varje brunn. Lägg till lämplig volym av 2% Alizarin Red fläcken lösning till varje brunn (1,5 mL per brunn för en 12-well platta) och försiktigt luta den platta sida till sidan tills lösningen helt täcker botten av brunnen.
  2. Inkubera i 15 min i rumstemperatur. Ta bort Alizarin Red från brunnarna. Skölj försiktigt varje brunn fyra gånger med destillerat H2O, tar försiktighet att inte rubba kalcium kristaller. Låt torka.

8. protokoll 7: Färgning Chondrogenic skick med Massons trikrom

  1. Grädda diabilder i 60 ° C torr ugn för 30 min. Deparaffinize och hydrat sektioner till destillerat vatten.
    1. För att rehydrera, placerar diabilder i tre 5 min inkubationer med dealcoholization ombud, följt av 5 min inkubationer i fallande alkohol koncentrationer enligt följande: två på 100% (absolut etanol), två på 95% alkohol, två på 80%, två på 70%, och slutligen två i destillerat H2O. glider kan förbli i H2O samtidigt Bouins fixativ är beredd.
  2. Plats 40 mL Bouins fixativ i en plast mikrovågssäker coplin burk (utan lock). Mikrovågsugn på hög att ta temp till 55 ° C. Placera bilden i uppvärmd lösning för 20 min; Låt stå på köksbänken omfattas. Tvätta i rinnande vatten i ca 10 min eller tills alla av den gula färgen försvinner.
  3. Fläcken sektioner i Weigert's hematoxylin för 10 min. tvätta i rinnande vatten i ca 10 min.
  4. Fläcken sektioner i Beibrich's scarlet syra fuchsin lösning för 10 min. tvätta 3 x 10 min i kranvatten. Betningsmedel diabilder i phosphotungstic/phosphomolybdic syra lösning för 10 min. Skölj inte.
  5. Placera bilder direkt i anilinfärgad blå lösning för 10 min. Skölj med två korta dips i kranvatten.
  6. Placera bilder i 1% ättiksyra för 3 till 5 min. tvätta i vatten i 1 min. plats i 95% etanol för 1 min. Dehydrate som anges i steg 5,4 och montera med syntetisk harts.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isolering av stromal vaskulär fraktionen från mänskliga PVAT

Figur 1A visar en Schematisk bild av anatomiska regionen där den PVAT överliggande aorta ascendens erhölls. Vi beskrev tidigare de patientgrupper som genomgick koronar bypass ympning som dessa prover var härledda6. Figur 1B visar ett exempel på den mänskliga PVAT som erhålls efter operationen. Figur 1 c visar ett representativt PVAT vävnad avsnitt färgas med Massons trikrom fläcken. Figur 1 d är en fas kontrakt mikrograf visar en befolkning på PVAT-derived stromaceller under expansionsfasen före differentiering. Celler kan utvidgas och fryst för framtida bruk. Celler är vanligtvis frysta på en densitet på 2,5 x 105 celler/mL i ett medium som består av 70% FBS, 20% basal (antibiotikum gratis) DMEM F12 och 10% DMSO i en isopropanol kryokammaren vid-80 ° C under 24 h och flyttade till den flytande fasen av en flytande N2 frys för lång-t ERM lagring.

Adipogena differentiering

Studier utfördes parallellt med mänsklig benmärg-derived MSC (figur 2AB) och PVAT-derived stamceller (figur 2 cD). Panelerna vänster i figur 2 visar den icke-inducerad skick, där ingen lipid ackumulering är uppenbart. De högra panelerna visar celler efter fettceller differentiering och färgning av neutrala lipider med Oil Red O. Även graden av differentiering i de mänskliga aorta PVAT-derived cellerna är mer robust, uppvisade både mänsklig cell källor förmågan att skilja mot adipogena härstamning.

Osteogena differentiering

Osteogena differentiering protokollet användes för mänsklig benmärg-derived MSC (figur 3A– C) och PVAT-derived celler (figur 3D– F). Icke-inducerad celler (figur 3AD) inte fläcken med Alizarin Red. Efter protokollet osteogent differentiering, mänskliga MSC utvecklat förkalkade knölar som färgas med Alizarin Red (figur 3B– C), medan mänskliga aorta PVAT-derived celler inte gjorde (figur 3E– F). Dessa data indikerar att våra förberedelser av celler från stromal vaskulär fraktionen av mänskliga PVAT saknar betydande antal föräldraparets med möjlighet att genomgå osteogenesis. Beroende på studie och tid loppet av differentiering är det lämpligt att följa upp standard fläckar med påvisande av molekylära markörer som definierar osteogent härstamning engagemang (t.ex. RUNX2, osterix, alkalisk fosfatas) eller osteoblaster (osteopontin, osteocalcin, alkaliskt fosfatas, BAP1).

Chondrogenic differentiering

Celler som härrör från både mänsklig benmärg MSC (figur 4A) och humant PVAT (figur 4B) Visa funktioner kännetecknar chondrogenic differentiering, med riklig kollagen ackumulering i micromass. Micromasses bildas från human benmärg MSC och aorta PVAT-derived celler uppvisade också riklig ansamling av glykosaminoglykaner (blå) indikerat av Alcian blå färgning (figur 4 c– D, respektive). Morfologiskt, upptäcktes strukturer liknande luckor med celler som sitter i hålrum kring av kollagen nedfall (figur 4, pilar). Beroende på studie och tid loppet av differentiering, påvisande av specifika chondrogenic markörer (aggrekan, kollagen typ II, osteonectin, Sox9) är användbar.

Figure 1
Figur 1: morfologiska kännetecken av mänsklig PVAT. (A) tecknad skildring av mänskliga aorta (röd) med omgivande PVAT (gul). Pilen anger ascendens. (B) en 480 mg bit av mänskliga aorta PVAT från en CABG patient i DMEM före dissociation. (C) Masson trikrom färgning av formalin-fast paraffin-inbäddat mänskliga PVAT (mörk brun/svart = atomkärnor, blå/lila = bindväv, rosa = cytoplasman; Obs, RBC visas röd-rosa. (D) representativ bild av explanterad PVAT-stromaceller 7 dagar i kultur. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Adipogena differentiering. (A) fas mikroskopi av mänskliga benmärgen MSC i icke-inducerad skick visar inga tecken på differentiering. (B) fas mikroskopi av mänskliga benmärgen MSC i villkoret inducerad adipogena visar några differentiering och immobilisering av neutrala lipider, målat med olja röd O efter 14 dagar. (C) fas mikroskopi av mänskliga aorta PVAT-derived cellerna i villkoret icke-inducerad adipogena visar inga tecken på differentiering. (D) fas mikroskopi av mänskliga aorta PVAT-derived cellerna i villkoret inducerad adipogena visar robust differentiering och immobilisering av neutrala lipider, målat med olja röd O efter 14 dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Osteogena differentiering. (A) fas mikroskopi av mänskliga benmärgen MSC i icke-inducerad osteogent skick visar inga tecken av differentiering mot ett osteogent härstamning. (B) fas mikroskopi av mänskliga benmärgen MSC i inducerade skick efter 14 dagar i kulturen visar bevis på differentiering och bildandet av kalkavlagringar som färgas med Alizarin Red (pilar). (C), en bild av den brunn innehållande mänskliga benmärgen MSC i inducerade osteogent skick efter färgning med Alizarin Red indikerar riklig kalcium nedfall, vilket tyder på framgångsrika differentiering mot ett osteogent härstamning (pilar, kalcium deposition). (D) fas mikroskopi av aorta mänskliga PVAT-derived cellerna i icke-inducerad osteogent skick uppvisar inga tecken på differentiering mot ett osteogent härstamning. (E) fas mikroskopi av aorta mänskliga PVAT-derived cellerna i inducerade osteogent villkora efter 14 dagar i kulturen visar inga tecken på differentiering mot ett osteogent härstamning eller avsättning av kalcium när fläckade Alizarin Red, endast icke-specifik färgning. (F), en bild av den väl som innehåller mänskliga aorta PVAT-derived celler i inducerade osteogent tillstånd följande färgning med Alizarin Red visar endast icke-specifik färgning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Chondrogenic differentiering. (A, B) Ljusmikroskop av ett avsnitt av micromass bildas av mänsklig benmärg MSC (A) eller mänskliga aorta PVAT stamceller (B) i inducerade chondrogenic skick efter 14 dagar i kultur och därefter målat med Masson's Trichrome, vilket tyder på betydande nedfall av kollagen (blå) och föreslår framgångsrika differentiering mot en chondrogenic härstamning. (C, D) Ljusmikroskop av ett avsnitt av micromass bildas av mänsklig benmärg MSC (C) eller mänskliga aorta PVAT stamceller (D) i inducerade chondrogenic skick efter 14 dagar i kultur och därefter målat med Alcian blå, vilket indikerar nedfallet av sura proteoglykaner (e.g. glykosaminoglykaner) som normalt återfinns i brosk. Motfärg, nukleära snabb röd; pilar, luckor-liknande strukturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fett stamceller från olika depåer varierar kraftigt i fenotyp och differentiering potentiella9. Odling PVAT-derived stamfäder från en enda patient donator i samtidiga induktion ner tre olika härstamningar, möjliggör adipogena, osteogena, och chondrogenic, en väl kontrollerad undersökning av denna roman pluripotenta kapacitet befolkningen av stamceller. Den metod som beskrivs i denna rapport kan användas för att testa kapaciteten differentiering av stamceller från mänskliga PVAT och förstå deras funktion i PVAT patologier och kärltonus regleras. Några fördelar med denna teknik är dess enkelhet och användning av primära mänsklig vävnad från koronar bypass patienter, vilket gör att utredningen av PVAT progenitor cell-funktion från patienter med svår kardiovaskulär sjukdom. Däremot bladsticklingar från en 500 mg bit vävnad vanligtvis vika < 1000 anhängare celler och därför kräver 5 – 7 passager att erhålla lämpliga nummer, belyser en viktig varning för detta synsätt. Avgörande för framgången av Trilinjär differentiering experimenten är kvaliteten på den initiala cellen explant från givaren PVAT. Det är viktigt att fint finhacka vävnaden noggrant innan enzymatisk dissociation. Dessutom, till skillnad från andra explant protokoll hittade vi en dramatisk förlust av mobilnummer, lönsamhet och övergripande kvalitet när röda blodkroppar lyseringsbuffert användes före plätering. Istället, det rekommenderas starkt att platta hela stromal vaskulär bråket (inklusive röda blodkroppar). Efter 24 h, vidhäftande celler kommer har bifogat och icke-lyserat röda blodkroppar kan avlägsnas genom upprepade tvättar med HBSS. Passaging av de PVAT-derived stromaceller bör inte vara större än 1:2 splittringar. Vi observerat en minskning av tillväxttakten när cellerna var split 1:3 eller högre.

Den svåraste delen av trilineage differentiering analysen är det chondrogenic tillståndet, eftersom det kräver en mindre vanlig metod att odla cellerna i en ”micromass” och histologiska inbäddning och snittning. Var noga med att korrekt plattan 10 µL droplet-programmet med 100 000 celler och inte störa massan på lägga till odlingsmediet. Vi hittade variation mellan analyser när det gäller huruvida micromass återstod klibbade till plattan eller upphängd i mediet. Även när massan kvar inte följas, varit micromass struktur och cell livskraft konsekvent.

Stamceller eller stamceller celler inom den vaskulära mikromiljö ansvarar för vävnad reparera svar på skada eller sjukdom. Mest väl karakteriserade finns populationer som härrör från pericyt/adventitial fack, även om det är fortfarande oenighet om huruvida det finns en standardiserad molekylärbiologisk identifiering av dessa populationer i människor10,11 . I detta protokoll studerar vi en progenitor cell befolkningen specifikt härrör från mänskliga PVAT att testa deras benägenhet att differentiera till ett osteogent, chondrogenic eller adipogena härstamning. Använda färgning tekniker för att definiera cellulära engagemang för varje härstamning, visar vi att till skillnad från MSC från human benmärg, stamceller från mänskliga PVAT inte kunde skilja mot ett osteogent härstamning (figur 3) men uppvisar robust adipogena differentiering. Chondrogenic differentiering kapaciteten är jämförbara mellan benmärg och PVAT-derived celler. Detta tyder på att PVAT-derived stamceller kan vara mer härstamning begränsad än benmärgen MSC eller att PVAT föräldraparets inte lätt skiljer i osteogent härstamningar. Framtida studier bör omfatta en undersökning av genen och protein uttryck för markörer för varje härstamning till mer kvantitativt bedöma differentiering kapaciteten av PVAT-derived celler.

Adipose-derived stamceller har varit fokus för regenerativ medicin applikationer, på grund av enkel åtkomst och antalet celler som kan härledas från fettvävnad12,13. Inom den stromal vaskulära fraktionen av fettvävnad finns det vaskulära celler, inflammatoriska celler, fibroblaster, Preadipocyter och adipose-derived stamceller. Det finns skillnader i stamceller befolkningen utifrån anatomiska läge av fett depot och fettceller egenskaper14. Viktigast av allt, verkar stamcellen adipose-derived ha kapacitet inte bara att differentieras till mesenkymala härstamningar15, men också potentialen att anta neuronala16,17 och epidermal18 öden.

Många studier har fokuserat på stammen/stamceller som härrör från mänskliga subkutan vit fettvävnad, men mycket få studier har behandlat egenskaper av stamceller befolkningarna i PVAT. Nyligen genomförda studier har isolerat fettceller stamceller från PVAT omgivande mesenteriala fartyg eller torakala aorta råttans. Dessa CD34 +/ CD140a + populationer som differentieras efter adipocyter, även om kapaciteten att härleda andra inte var testat19.

Vi kännetecknas nyligen fett stamceller som härrör från den stromal vaskulära fraktionen av mänskliga PVAT från patienter med avancerade koronar sjukdom6. Dessa fett stamceller var CD73 +, CD105 + CD140a + och differentieras effektivt efter adipocyter med termogena egenskaper (UCP1 uttryck)6. I det nuvarande arbetet hittade vi en begränsad härstamning styrka av PVAT-derived cellerna jämfört med benmärg-derived MSC, vilket tyder på en brist eller minimal befolkningen av adipose-derived stamceller som har karaktäriserats från andra människors fettvävnad. Ersättning för detta protokoll är den förväntade variabiliteten mellan människors exemplar, som kan påverka antalet stamceller/stamceller inom PVAT provet och deras förmåga att genomgå differentiering till distinkta härstamningar. Ålder, kön, BMI, mediciner och andra kliniska parametrar som sannolikt påverkar fenotypen av stamceller inom PVAT. Förväntade framtida ändringar i detta protokoll väntar således en mer tydligt definierade stamceller befolkning inom mänskliga PVAT, och eventuellt använder cell sortering för att isolera specifika undergrupper för härstamning studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi erkänner stöd av forskning navigering på Maine Medical Center för att bistå med upphandling av kliniska vävnad, och histopatologi och Histomorphometry kärna (stöds av 1P20GM121301, L. Liaw PI) på Maine Medical Center forskning Institutet för snittning och färgning. Detta arbete stöds av NIH bevilja R01 HL141149 (L. Liaw).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animal-free collagenase/dispase blend I   Millipore-Sigma SCR139 50mg
Alcian Blue NewComerSupply 1003A 1% Aqueous solution pH 2.5
Alizarin Red Amresco 9436-25G
alpha-MEM ThermoFisher 12561056
Aniline Blue NewComerSupply 10073C
Antibiotic/antimycotic ThermoFisher 15240062
Beibrich's scarlet acid fuchsin Millipore-Sigma A3908-25G
b-glycerophosphate Millipore-Sigma G9422-10G
Biebrich Scarlet EKI 2248-25G
Biotin Millipore-Sigma B4501-100MG
Bouin's fixative NewComerSupply 1020A
Bovine serum albumin Calbiochem 12659 stored at 4 °C
Cell detachment solution Accutase AT104
Bell strainer (70 mm) Corning 352350
Dexamethasone Millipore-Sigma D4902-100MG
DMEM Corning 10-013-CV 4.5 g/L glucose, L-glut and pyruvate
DMEM/F12 medium ThermoFisher 10565-042 high glucose, glutamax, sodium bicarbinate
DMSO Millipore-Sigma D2650
Fetal bovine serum Atlanta Biologicals  S11550
FGF2 Peprotech 100-18B
Formalin NewComerSupply 1090
Gelatin, bovine skin Millipore-Sigma G9391-500G
Glutamax ThermoFisher 35050061 glutamine supplement
HBSS Lonza 10-547F
IBMX Millipore-Sigma I5879-250MG
Insulin solution Millipore-Sigma I9278-5ML
Oil red O Millipore-Sigma O0625-100G
Pantothenic acid Millipore-Sigma P5155-100G
Penicillin-streptomycin solution ThermoFisher 15240062 100ml
Permount Fisher SP15-500
Phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution Millipore-Sigma P4006-100G/221856-100G
Primocin Invivogen ant-pm-1 Antimicrobial reagent for culture media.
Rosiglitazone Millipore-Sigma R2408-10MG
TGFb1 Peprotech 100-21
Weigert's hematoxylin EKI 4880-100G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
  2. Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
  3. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  4. Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
  5. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  6. Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
  7. Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
  10. de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
  11. Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
  12. Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
  13. Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
  14. Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
  15. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  16. Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
  17. Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
  18. Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
  19. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).

Tags

Biologi fråga 145 mänskliga perivaskulär fettvävnad fett stamceller mesenkymala stamceller kondrogenes osteogenesis adipogenesis celldifferentiering hjärt-kärlsjukdom
Differentiering kapacitet av mänskliga aorta perivaskulär Adipose stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Scott, S. S., Yang, X., Robich, M.,… More

Scott, S. S., Yang, X., Robich, M., Liaw, L., Boucher, J. M. Differentiation Capacity of Human Aortic Perivascular Adipose Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (145), e59337, doi:10.3791/59337 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter