Summary
Mikrobiell biofilm danner komplekse arkitekturer på interphases og utvikler seg til svært skala-avhengige romlige mønstre. Her introduserer vi et eksperimentelt system (hard-og programvare) for automatisert anskaffelse av 3D optisk sammenheng tomografi (OCT) datasett. Dette verktøysettet tillater ikke-invasiv og multi-skala karakterisering av biofilm morphogenesis i rom og tid.
Abstract
Biofilm er en mest vellykkede mikrobiell livsstil og råde i en rekke miljømessige og konstruerte innstillinger. Forståelse biofilm morphogenesis, som er den strukturelle diversifisering av biofilm under samfunnet forsamlingen, representerer en bemerkelsesverdig utfordring på tvers av romlige og timelige skalaer. Her presenterer vi en automatisert biofilm Imaging system basert på optiske sammenheng tomografi (OCT). OCT er en fremvoksende Imaging teknikk i biofilm forskning. Men mengden av data som for tiden kan skaffes og behandles hemmer statistisk slutning av stor skala mønstre i biofilm morfologi. Det automatisert OCT tenkelig system innrømmer avdekker stor romlig og utbygget Temporal skalaer av biofilm oppblomstringen. Den syndikatene en kommersielt anvendelig OCT system med en Robotic plasserer plattform og en suite av programvare løsninger å administrere plasseringen av det OCT skanning sonde, likeledes idet oppkjøpet og bearbeiding av 3D biofilm tenkelig datasett. Denne setup innrømmer det inne situ og ingen-invasjonen automatisert avlytting av biofilm utviklingen og kanskje være fremme bebygget å par okt tenkelig med macrophotography og microsensor profilering.
Introduction
Biofilm er en svært vellykket mikrobiell livsstil tilpasning og disse Interphase-assosiert og Matrix-vedlagte samfunn av mikroorganismer dominerer mikrobiell liv i naturlige og industrielle innstillinger1,2. Der biofilm form komplekse arkitekturer, slik som langstrakte strøm strømmer3, bølgene4 eller sjampinjong-lignende caps5 med viktige konsekvenser for biofilm vekst, strukturell stabilitet og motstand mot stress6. Mens mye om biofilm strukturelle differensiering har blitt lært fra arbeid på mono-arter kulturer vokst i miniatyr Flow kamre, de fleste biofilm er svært komplekse samfunn ofte inkludert medlemmer av alle domener av livet6. Verdsette disse komplekse biofilm som mikrobielle landskap7 og forstå hvordan biofilm struktur og funksjon samhandle i komplekse samfunn er dermed i forkant av biofilm forskning.
En mekanistisk forståelse av morphogenesis av komplekse biofilm som svar på miljømessige stikkord krever nøye utformede eksperimenter i forbindelse med romlig og timelig løst observasjoner av biofilm fysiske struktur på tvers av relevante skalaer8. Imidlertid har den ikke-destruktive observasjonen av biofilm vekst i eksperimentelle systemer blitt sterkt begrenset av logistikk begrensninger som behovet for å flytte prøver (for eksempel til et mikroskop) ofte skade den delikate biofilm strukturen.
Protokollen som presenteres her introduserer et helautomatisk system basert på optisk sammenheng tomografi (OCT), som gjør at in situ, ikke-invasiv overvåking av biofilm morphogenesis på mesoscale (mm rekkevidde). OCT er en fremvoksende Imaging teknikk i biofilm forskning med applikasjoner i vannbehandling og begroing forskning, medisin9 og stream økologi10. I OCT, en lav sammenheng lys kilde er delt inn i en prøve og referanse arm; forstyrrelser i lyset som reflekteres og spres av biofilm (prøve armen) og lyset fra referanse armen analyseres. En serie med aksial intensitet profiler (A-skanner) som inneholder dybde-løst strukturelle informasjon er ervervet og fusjonert inn i en B-Scan (et tverrsnitt). En serie med tilstøtende B-skanninger komponerer det endelige 3D-volumet for skanning10. Oct gir en lateral optisk oppløsning i området på ca 10 μm og er derfor godt egnet til å studere Mesoskopisk strukturelle differensiering av biofilm10,12. For en mer detaljert beskrivelse av OCT, se Drexler og Fujimoto13og Fercher og kolleger14. Til tross for feltet-av-utsikt av en enkelt OCT XY-avsøke når til flere hundre av kvadrat mikrometer, større-skalaen mønstre kan ikke være kvantifisert ved hjelp av OCT inne en enkelt avsøke. Med hensyn til biofilm i naturlige habitater som bekker og elver, begrenser denne tiden vår evne til å vurdere biofilm morphogenesis i vekter som matcher den fysiske og hydrauliske malen til habitat.
For å overgå disse romlige grensene og å erverve OCT skanninger automatisk, en Spectral-domene OCT Imaging probe ble montert på en 3-akse posisjoneringssystem. Installasjonen tillater oppkjøpet av flere OCT skanninger i en overlappende mosaikk mønster (flis skanning), effektivt oppnå klare avbildning av overflateområder opp til 100 cm2. Den høye posisjonerings presisjonen til dette systemet gjør det dessuten mulig å overvåke veksten og utviklingen av biofilm funksjoner på bestemte steder i løpet av langsiktige eksperimenter på en pålitelig måte. Systemet er modulær og individuelle komponenter (dvs. posisjonering enheten og Oct) av installasjonen kan brukes som frittstående løsninger eller fleksibelt kombinert. Figur 1 gir en oversikt over hard-og programvarekomponenter i installasjonen.
Systemet ble testet med en kommersielt tilgjengelig GRBL-kontrollerte CNC posisjonerings enhet (tabell med materialer). Drifts avstander for denne spesifikke posisjonerings plattformen er 600 × 840 × 140 mm, med en produsent-indikert nøyaktighet på +/-0,05 mm og en programmerbar oppløsning på 0,005 mm. GRBL er en åpen kildekode (GPLv3 License), høyytelses bevegelseskontroll for CNC Enheter. Derfor bør hver GRBL-baserte (versjon > 1,1) posisjonering enheten være kompatibel med retningslinjer og programvarepakker som presenteres her. Videre kan programvaren bli tilpasset andre stepmotor kontrollere med STEP-DIR Inndatatype med få modifikasjoner.
OCT enheten brukes til å vurdere ytelsen til systemet (tabell av materialer) har en lav sammenheng lyskilde med et senter bølgelengde på 930 NM (båndbredde = 160 NM) og justerbar referanse arm lengde og intensitet. I eksempelet som presenteres her, en nedsenking adapter for dyppe OCT sonden i rennende vann ble også brukt (tabell over materialer). Programvarepakken utviklet her for automatisert OCT Scan oppkjøpet kritisk avhenger av SDK leveres sammen med den spesifikke OCT system, men, OCT systemer fra samme produsent med ulike skanne linser og sentrale bølgelengder bør er lett kompatible.
GRBL-enheten styres av en webserver som er installert på en datamaskin med én tavle (figur 1). Dette gir fjernkontroll over enheten fra en hvilken som helst datamaskin med lokale nettverk eller Internett-tilgang. OCT-enheten styres av en egen datamaskin, slik at driften av OCT-systemet til side det automatiserte eksperimentelle oppsettet. Til slutt, programvaren pakkene inkluderer bibliotekene å synkronisere OCT probe posisjonering og OCT Scan oppkjøpet (dvs. å automatisk erverve 3D Imaging datasett i en mosaikk mønster eller i et sett med definerte posisjoner). Definere plasseringen av OCT sonden i 3D effektivt gjør det mulig å justere fokalplanet spesielt for (regionale) sett av skanninger. Spesielt på ujevne overflater kan forskjellige fokal plan (dvs. forskjellige posisjoner i z-retning) spesifiseres for hvert søk i OCT.
Et sett med programvarepakker ble utviklet for å behandle rå OCT-skanninger (tabell 1). Navigering av posisjonerings enheten, OCT skanning oppkjøp og datasett behandling utføres med Python-kodet Jupyter notatbøker, som tillater bemerkelsesverdig fleksibilitet i utvikling og optimalisering av programvaren. To jobbet og kommenterte eksempler på slike notatbøker (for bildeoppkjøp og prosessering, henholdsvis) er tilgjengelige fra https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git de er ment som utgangspunkt for tilpasning av metoden. En Jupyter notisbok er en nettleser basert program som inneholder celler med kommenterte Python-kode. Hvert trinn finnes i en celle i notatblokken, som kan utføres separat. På grunn av den forskjellige lengden på lys banen gjennom skanne linsen (sfærisk avvik)15, RAW Oct skanninger vises forvrengt (figur 2a). Vi utviklet en algoritme for å automatisk korrigere for denne forvrengningen i ervervet OCT skanninger (finnes i ImageProcessing. ipynb, supplerende fil 1). Videre kan biofilm morfologi bli vist som en 2D høyde kart, som tidligere ble brukt i membran systemer16, og vi illustrerer hvordan høyde kart innhentet fra skanninger tatt i en flislegging Array kan bli sydd.
Til slutt, er funksjonaliteten til den beskrevne laboratoriet installasjonen illustrert ved hjelp av en flume eksperiment der phototrophic stream biofilm er utsatt for en gradient av strømningshastighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. oppsett av posisjonerings enheten
- Koble posisjonerings enheten til et microcontroller bord ved å følge instruksjonen i https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl.
- Koble microcontroller til en enkelt tavle-PC med Internett-tilkobling via en USB-kabel, og Installer GRBL-serveren som beskrevet i https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git. Nå posisjonering enheten skal være å navigere fra en webside vert på http://IP:5020/. Alternativt kan posisjonering enheten bli navigert med et Python-skript, som demonstrert i den første delen av arbeidet eksempel ImagesAcquisition. Ipynb (supplerende fil 2).
2. installasjon av OCT
- Monter OCT sonden til posisjonering enheten ved hjelp av en kompatibel Due-tail holderen. Installer om nødvendig en nedsenking adapter på objektivlinsen.
- Plasser datamaskinen og OCT base enhet på en benk ved siden av eksperimentet (for eksempel mikrovæskebasert enheter, strømnings kamre, vannsklier, filtreringssystemer). Sørg for at den optiske ledningen (maksimal lengde på ca. 1,8 m) beveger seg fritt, lenge nok til å nå alle tiltenkte steder og ikke forstyrrer det eksperimentelle oppsettet.
- Installer OCT-systemet sammen med tilgjengelig programvare som beskrevet av produsenten.
- Installere programvarepakker for automatisert OCT skanning oppkjøpet som beskrevet i https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git.
3. image oppkjøp
- Slå på OCT-systemet og posisjonerings enheten. Kontroller at enheten kan bevege seg fritt.
- Åpne filen config. JSON i et tekstredigeringsprogram. Rediger filen config. JSON for å justere standard bilde anskaffelses parameter (tabell 2), for eksempel brytningsindeksen (1,33 for vann ved 20 ° c, 1,00 for luft) og målmappen for mottatte data og metadata.
- Definere størrelsen på feltet-of-view (FOV) og antall A-skanninger per B-Scan i config. JSON.
Merk: disse to parametrene bestemme størrelsen på voxels av det endelige datasettet og størrelsen på utdatafilen og bør matche den optiske oppløsningen av sonden (x-y Voxel størrelse bør ikke være mindre enn halvparten av den optiske oppløsningen). Antall A-og B-skanninger påvirker den romlige utstrekningen som skal dekkes, noe som handler-off mot tilgjengelig diskplass og prosessorkraft. - Definer signal grensene for utdata OCT-skanningen i config. JSON. Disse avhenger av typen prøve. Det er derfor anbefalt å bestemme disse parametrene basert på intensitet histogrammer av et sett av foreløpige skanninger. Lagre endringene i config. JSON.
- Naviger til OCT-proben til et interesseområde. Fokuser prøven og Juster intensiteten på referanse armen og lyskilden for optimal bildekvalitet. Gjenta denne fremgangsmåten for en rekke stillinger, og Legg merke til koordinatene.
Merk: Dette gjør at den påfølgende automatiske skanningen av OCT Scan rundt disse referansepunktene. Vær oppmerksom på at referanse arm lengden og-intensiteten ikke kan endres under automatisert bildeinnhenting. - Åpne ImageAcquisition. ipynb -filen (tilleggsfil 2) i Juypter notatblokk. Hver celle inneholder kode for å utføre bestemte oppgaver og kan kjøres separat via trykke Cell | Kjør, eller CTRL + ENTER eller Shift + Enter.
- Angi banen til de nødvendige bibliotekene og standard konfigurasjonsparametere. Du kan også definere et nytt sett med midlertidige parametere.
- Koble til posisjonerings enheten og Initialiser Tilpasningsverktøy for OCT.
- Kalibrer posisjonerings enheten (dvs. Utfør en "homing").
- Skaff datasettene som dekker interessene til enkelt Skann eller mosaikk mønster, og angi antall og overlapping (f.eks. 30%) av nærliggende fliser.
Merk: minnet er tildelt før skanningen, som optimaliserer datamaskinen ressursbruk. Data lagres i 8 biter *. Raw -format for å spare lagringsplass, i målmappen som er definert i config. JSON, ved hjelp av tidsangivelsen og posisjonen som navnekonvensjon (dvs.% Y% m% D_% H% m% S_ < posisjon >). Metadata inkludert OCT-innstillinger og-koordinater lagres i samme mappe i en *. SRM -fil med samme navnekonvensjon. Avhengig av innstillinger som FOV og oppløsning, kan filstørrelsen nå opptil 1,5 GB per OCT-skanning.
- For å unngå abort av datainnhenting må du kontrollere at det er nok ledig diskplass, eller at du kontinuerlig flytter datasett fra OCT til en ekstern harddisk.
4. bildekorrigering og-visning
- Åpne Jupyter bærbare ImageProcessing. ipynb (tilleggsfil 1) for en jobbet eksempel på Oct bildebehandling (korrigering av forvrengning, bakgrunn subtraksjon, beregning av høyde kart, høyde kart søm).
- Hvis nødvendig, beskjære OCT skanner for å utelukke falske signaler og reorientert datasettet (biofilm skal vises over undergrunnen).
- Riktig for sfærisk avvik. Dette oppnås ved en korreksjon algoritme som utnytter en svært reflekterende referanse overflaten kjent for å være flat (f. eks bunnen av flume, undergrunnen). Først definerer algoritmen et rutenett på 20 × 20 vertikale linjer regelmessig linjeavstand over XY-flyet av OCT Scan. Deretter velger den en sirkulær område rundt hvert punkt og gjennomsnitt signal intensitet langs den vertikale profilen (figur 2b). De vertikale profilene behandles med et modifisert Gaussian-filter:
der x er inngangssignalet, og σ sitt standardavvik, mens C er bestemt som:
Referanse overflaten er lokalisert som lokal Maxima i hver av disse profilene. Feilidentifisert poeng filtreres basert på posisjonene til naboene i tre dimensjoner (figur 2C). Til slutt, en 2nd rekkefølge polynom overflate reflekterer forvrengningen introdusert av skanningen linsen er montert på tvers av disse punktene (figur 2C). Den monterte overflaten blir deretter brukt til å skifte hver piksel i z-retning, og dermed få et flatt bilde. Parameterne for denne algoritmen bør justeres etter egenskapene til OCT Scan. - Riktig for bakgrunnsstøy. Identifiser et tomt område av bildet (vanligvis over biofilm) og bruk korreksjon algoritmen til å trekke den gjennomsnittlige bakgrunns intensiteten fra intensiteten verdiene av bildet for å produsere en endelig korrigert OCT bilde (figur 2D).
- Beregn et høyde kart fra 3D OCT-datasett. I dette trinnet definerer du en referanse overflate av interesse for det bestemte eksperimentet (for eksempel undergrunnen) og en passende terskel intensitet. Deretter bruker du algoritmen for stignings tilordnings beregning til å beregne tykkelsen på biofilm for hver koordinat (x, y) for den binære masken og tilordne den til en ny 2D-matrise (figur 3a). Tykkelse verdier blir deretter tildelt en 2D matrise av størrelsen på det opprinnelige bildet i x og y retninger. Et bilde gjengis der høyden på overflaten rapporteres som gråtoneverdi (figur 3b).
- I tilfelle flere OCT skanninger er tatt i en mosaikk mønster, definere antall rader og kolonner og sy de respektive høyde kartene. Figur 5 presenterer eksempler på sydd høyde kart, som dekker det brede spekteret av romlige skalaer og oppløsninger oppnåelig med det beskrevne oppsettet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi demonstrerer funksjonaliteten til automatiserte OCT Imaging system ved hjelp av et flume eksperiment utformet for å studere spatio-Temporal morphogenesis av phototrophic stream biofilm. En gradvis innsnevring av geometrien i vannsklier induserte graderinger i strømningshastighet langs midten av flume (se referanse17). Den timelige utviklingen og strukturelle differensiering av biofilm ble overvåket over 18 dager med sikte på å bedre forstå virkningene av hydrodynamisk forhold på biofilm morphogenesis. Figur 4 demonstrerer veksten av en biofilm microcolony fulgt over 18 dager med vekst. Overflate morfologi av biofilm ble kvantifisert ved hjelp av verktøysettet som er beskrevet ovenfor (figur 4a). Biovolume ble beregnet (se arbeidet eksempel ImageProcessing. ipynb, supplerende fil 1) for et firkantet bevegelig vindu med 3,6 mm kant lengde (figur 4b) for hver posisjon langs strømningshastighet gradient (figur 4c). Biofilm akkumulering betydelig redusert med økende strømningshastighet (indikert som avstanden fra den bredeste delen av flume; Figur 4). Viktigere, dette eksperimentelle oppsettet tillater en kontinuerlig måling av strukturelle parametre (f. eks, biovolume, tykkelse, ujevnheter) langs store romlige graderinger. Derfor gir dette nye verktøyet midlene til å få innsikt i relasjoner mellom biofilm struktur og miljømessige signaler.
| Programvarekomponent | Beskrivelse |
| stepcraft.py | Et Python-bibliotek for å kontrollere posisjonerings enheten. Den inneholder definisjoner for navigering og homing enheten. |
| OctControl. cpp | C++-kode avledet fra Software Development Kit (SDK) som distribueres med OCT-systemet. Dette må kompileres ved hjelp VisualStudio 2017, PythonC/API og SDK. |
| ImagesAcquisition.py | Et Python-bibliotek som inneholder kommandoer for å ta OCT skanninger i utvalgte posisjoner og definere skanningen flislegging mønster. |
| ImagesAcquisition. ipynb | Jupyter bærbar PC som brukes til å navigere posisjonerings enheten, anskaffe OCT-skanninger og for automatisert bilde anskaffelse. |
| OctCorrection.py | Et Python-bibliotek som definerer funksjonene som brukes til korrigering av de rå OCT-bildene og bakgrunns subtraksjon. |
| OctProcessing.py | Et Python-bibliotek som inneholder funksjoner for å beregne og sy høyde kart. |
| OctProcessing. ipynb | Jupyter notisbok å visualisere, korrigere og behandle OCT skanninger. Dette inneholder også et eksempel på biovolume beregning. |
Tabell 1. Programvarekomponenter.
| Parameteren | Verdi | Beskrivelse |
| Ganymedes | 1, 2, 3 | Valg av OCT system og versjon |
| Sonde | 1, 2 | Valg av skanne linse |
| nAscans | 32-900 | Antall A-skanninger per B-skanning |
| nBscans | 1-900 | Antall B-skanninger |
| nCscans | 128-1024 | Antall dybde piksler |
| X | 0.1-10 | Bildestørrelse i x-retning (mm) |
| Y | 0.1-10 | Størrelsen på bildet i y-retning (mm) |
| refr | 1-1.6 | Brytningsindeks (1 for luft, 1,33 for vann) |
| avg_Ascans | 3 | Antall A-skanning i snitt |
| scanspeed | 1, 2, 3 | A-skanning rate (5,5, 15 og 36 kHz) |
| Banen | ".. /% Y-% m-% d_% H_% M_% S " | Målmappe for ervervet OCT skanninger, bruker tidsangivelse som navngiving confention |
| colorBoundaries | [0,0-256.0, 0,0-256.0] | Color grensene for ervervet skanninger |
Tabell 2. OCT parameterinnstillinger.
Figur 1. Oversikt over hard-og programvarekomponenter. Stepmotors av en GRBL-styrt posisjonerings enhet er kablet til en microcontroller, koblet via USB til en enkelt-Board-datamaskin. Den GRBL serveren er installert på sistnevnte, og bevegelse av posisjonering enheten kan styres fra en hvilken som helst nettleser via TCP/IP-tilkobling. Navigering i posisjonerings enheten kan eventuelt utføres fra en Python-kodet Jupyter bærbar PC (ImagesAcquisition. ipynb, tilleggsfil 2) ved hjelp av GRBLServer.py-biblioteket. OCT-systemet er koblet til en egen datamaskin som automatiserte OCT Scan oppkjøpet kan utføres via et Python-skript. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Arbeidsflyt for skanning av OCT. Panel A viser en ikke-bearbeidet B-skanning av biofilm vokser på en flat plexiglass overflate. Bildet er forvrengt (bøy) på grunn av forskjeller i banelengde på lav sammenheng lys gjennom linsen. Bildeforvrengning i OCT kan korrigeres ved å identifisere en sterkt reflekterende, flat referanse overflate i bildet. Først 20 × 20 referansepunkter er jevnt fordelt over hele stabelen av bilder. I hvert av disse punktene, er bildet signalet gjennomsnitt over et sirkulært område (i x-y retning) for hver dybde (z fly), få en gjennomsnittlig dybde profil av signal intensitet. Deretter brukes et endret Gaussian-filter på hver av de 400 referanse profilene. Panel B gir et eksempel på det opprinnelige signalet langs dybde profilen som indikeres av den vertikale røde linjen i panel A, gjennomsnitts dybde profilen og den samme profilen etter at det modifiserte Gaussian-filteret er brukt. Den modifiserte Gaussian filteret tillater identifisering av lokale Maxima i signal intensitet, og dermed identifisere plasseringen av den sterkt reflekterende referanse overflaten. Korrekt identifiserte referansepunkter blir deretter valgt basert på koordinatene til sine naboer i tre dimensjoner. I eksempelet i panel C ble de gule punktene beholdt for påfølgende bildekorrigering, mens purpur de ble forkastet. En 2nd rekkefølge polynom overflaten er da passe til riktig plasserte referansepunkter og brukes til å korrigere forvrengningen i det opprinnelige Oct bildet ved å forskyve piksler i z retning. Gjennomsnittlig bakgrunns intensitet anslås ut fra et tomt område i bildet og trekkes fra de korrigerte bildene. Panel D viser samme B-skanning etter korrigering og bakgrunns subtraksjon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Høyde kart. Biofilm topologi kan visualisere som 2D høyde kart der tykkelsen av biomasse er fargekodet. For dette er en 3D OCT bilde thresholded og biofilm tykkelse beregnet som avstanden fra de øverste signal til underlaget. Panel A viser den binære masken av en B-Scan innhentet etter terskelverdi. Den blå linjen angir det øverste signalet mens den røde linjen viser referanse overflaten. Panel B viser et eksempel på det oppnådde høyde kartet, skalert i henhold til aksial oppløsningen til OCT-proben. Den røde linjen indikerer posisjonen til B-skanningen i panel A.
Figur 4. Representative resultater som viser effekten av strømningshastighet på biofilm vekst. Vi studerte phototrophic stream biofilm morphogenesis langs en gradient i strømningshastighet ved hjelp av flume eksperimenter. Strømningshastighet økte med avstand fra innløpet til flume. Etter 10 dager med vekst, biofilm morfologi var preget av automatiserte OCT på ulike vedtak og dekker ulike romlige skalaer. Elevation kart (A, B og C) demonstrere morfologi av biofilm vokst under lav, middels og høy strømningshastighet, henholdsvis. Disse høyde kartene beregnes fra OCT-skanninger med voxels størrelse i x, y-retning på 4 μm. Skanne flaten er et kvadrat av 3,6 mm kant lengde. Paneler D, E og F viser høyde kart (lav, middels og høy strømningshastighet, henholdsvis) oppnås ved å sy 3 × 3 OCT skanner med en Voxel størrelse i xy-retning av 11 μm, skanneområde på 10 mm2 og en overlapping mellom nabokommunene skanninger av 30%. Panel G viser en høyde kart over biofilm vokser langs hele hastigheten gradient oppnådd i dette flume eksperimentet. Det ble oppnådd ved å sy 3 × 51 OCT skanner med en Voxel størrelse i xy-retning av 40 μm, skanneområde på 10 mm2 og en overlapping mellom nabokommunene skanninger av 30%. Det totale skanneområdet oppnådd er 24 × 353 mm. panel H rapporter biovolume i en firkantet glidende vindu på 3,6 mm kanten. Gjennomsnittlig biovolume betydelig redusert som en funksjon av avstand fra innløpet (I). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Presisjons test for posisjonerings enheten. Presisjonen av posisjonering enheten ble vurdert ved å montere en 20,2 megapiksler kamera utstyrt med en 35 mm makro objektiv på posisjonering enheten, fokusert på et farget merke. Posisjonering enheten ble flyttet i en tilfeldig retning bort fra merket og deretter plassert tilbake for totalt 80 sykluser. Plasseringen av merket ble deretter sammenlignet. Figuren viser skiftet i x og y retning i forhold til det første bildet. Merk at det maksimale skiftet er ca. 16 μm i y-retning og enda mindre i x-retning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggsfil 1. ImageProcessing. ipynb. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2. ImagesAcquisition. ipynb. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCT Imaging er godt egnet til å løse strukturer i mikrometer rekkevidde med en FOV av flere kvadratmillimeter. Det er således et kraftig verktøy for biofilm forskning10,18. Imidlertid er OCT foreløpig begrenset til et maksimalt skanneområde på 100-256 mm2, mens biofilm strukturelle mønstre ofte overstiger denne romlige skalaen19, spesielt når morfologiske differensiering er drevet av stor skala miljømessige graderinger 20. den automatiserte Oct Imaging system beskrevet i denne protokollen utvider arealet PREGET av Oct til flere kvadratcentimeter, effektivt gjør det mulig å overvåke biofilm morfologiske differensiering over et relevant spekter av romlige skalaer (fra noen få millimeter til flere centimeter). Den høye Posisjonsnøyaktigheten (innen 16 μm; Figur 5) gjør det mulig å nøyaktig overvåke den strukturelle utviklingen av biofilm over lengre perioder (Figur 4), effektivt øke mulighetene for å få en mekanistisk forståelse av driverne av biofilm morfologiske differensiering . Samtidig er dette in situ biofilm karakterisering teknikken ikke-invasiv og minimerer interferens med biofilm vekst. Den bildebehandling løsninger som presenteres her bygger på tidligere ansatt analyser av biofilm OCT datasett16, men automatisering gir verktøy for enestående tid-og plass løst Oct datasett analyser.
Dette systemet ble unnfanget og benchmarked med en bestemt OCT enhet, som beskrevet i protokollen. Kritiske trinn i protokollen i hovedsak gjelder innstillingen av OCT oppløsning og fokus, som er både avgjørende for høy bildekvalitet. En begrensning av korreksjon av sfærisk avvik rutine er at det avhenger av tilstedeværelsen av en svært reflekterende flat overflate. Alternativt kan en standard korreksjon overflaten måles, og deretter brukes til å korrigere OCT skanninger. Videre er sømmene av OCT skanninger avhengig av tilstrekkelig strukturelle funksjoner for å justere nærliggende skanninger. I tilfelle ensartet biofilm fordeling eller lav biofilm dekning, kan søm oppnås stole utelukkende på presisjonen av posisjonering enheten. Til slutt, som i alle andre bildebehandling rørledning, når du setter opp disse verktøyene, er det viktig å nøye vurdere ytelsen til behandling algoritmen på et sett av representative skanninger før håndtering grupper av bilder.
Både hard-og programvare ble utviklet for å gi full fleksibilitet av de enkelte delene. Mer spesifikt, kan dette systemet være lett tilpasses til å arbeide med andre verktøy for biofilm karakterisering som makro-fotografering Imaging bruker hyperspektral kameraer eller microsensor profilering. Koblingen av strukturell informasjon med lokaliserte graderinger i ressurser rundt og innenfor biofilm vil gi romanen og sentral innsikt i hvordan biofilm er tilpasset for å optimalisere Ressursallokering. Fleksibiliteten er også implementert gjennom bruk av Jupyter bærbare datamaskiner, en åpen tilgang, rask og allsidig programvare utvikle verktøyet.
En kritisk begrensning av OCT Imaging generelt forblir funksjonshemming å løse raskt bevegelige objekter. For eksempel er strømmere elongating til og i bevegelse med flyten ikke nøyaktig avbildet. Anvendelsen av dette verktøyet er således begrenset til relativt faste, ikke-bevegelige biofilm strukturer. Systemet er optimalisert for å fungere selvstendig, men innledende innstillinger og om nødvendig, manuell justering av fokus og belysning, er fortsatt nødvendig. Dette representerer en betydelig begrensning hvis prøvene avviker betydelig i tettheten og reflekterende egenskaper. Full automatisering, inkludert programvarestyrt fokusering og justering av belysning kan imidlertid oppnås ved hjelp av lignende prinsipper (f. eks, stepper motorer og programvare-maskinvare tilbakemeldinger).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sebastian Schäfer er ansatt ved Thorlabs Inc.
Acknowledgments
Vi takker Mauricio Aguirre Morales for sitt bidrag til utviklingen av dette systemet. Finansiell støtte kom fra Swiss National Science Foundation til T.J.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
- Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
- Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
- Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).
- Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , Springer Verlag. (2008).
- Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
- Lee, H. -C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
- Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
- Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
- Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).
