Summary
Mikrobielle biofilmer danner komplekse arkitekturer ved interfaser og udvikler sig til meget skala afhængige rumlige mønstre. Her introducerer vi et eksperimentelt system (Hard-og software) til automatiseret erhvervelse af 3D optisk kohærens tomografi (OCT) datasæt. Dette værktøjsæt tillader ikke-invasiv og multi-skala karakterisering af biofilm morfogenese i rum og tid.
Abstract
Biofilms er en mest succesfuld mikrobiel livsstil og fremherskende i en lang række miljømæssige og konstruerede indstillinger. Forståelse af biofilm morfogenese, det er den strukturelle diversificering af biofilmer under Fællesskabs forsamlingen, repræsenterer en bemærkelsesværdig udfordring på tværs af rumlige og tidsmæssige skalaer. Her præsenterer vi et automatiseret biofilm billedsystem baseret på optisk kohærens tomografi (OCT). OCT er en spirende billeddannelses teknik i biofilm Research. Mængden af data, der i øjeblikket kan erhverves og behandles, hæmmer imidlertid den statistiske slutning af store mønstre i biofilm morfologi. Det automatiserede OLT-billedbehandlingssystem giver mulighed for at dække store rumlige og udvidede tidsmæssige skalaer for biofilm vækst. Det kombinerer et kommercielt tilgængeligt OLT-system med en robot positionerings platform og en række softwareløsninger til at styre placeringen af OLT-scannings sonden samt erhvervelse og behandling af 3D biofilm-billedbehandlings datasæt. Dette setup giver mulighed for in situ og ikke-invasiv automatiseret monitorering af biofilm udvikling og kan videreudvikles til par OCT Imaging med makrofotografering og mikrosensor profilering.
Introduction
Biofilms er en meget vellykket mikrobiel livsstil tilpasning og disse Interphase-associerede og matrix-indesluttet samfund af mikroorganismer dominerer mikrobielle liv i naturlige og industrielle indstillinger1,2. Der, biofilm danner komplekse arkitekturer, såsom aflange streamere3, krusninger4 eller champignon-lignende caps5 med vigtige konsekvenser for biofilm vækst, strukturel stabilitet og modstandsdygtighed over for stress6. Mens meget om biofilm strukturel differentiering er blevet lært fra arbejde på mono-arter kulturer dyrket i miniature flow kamre, de fleste biofilm er meget komplekse samfund, der ofte omfatter medlemmer af alle områder af livet6. At værdsætte disse komplekse biofilder som mikrobielle landskaber7 og forstå, hvordan biofilm struktur og funktion interagerer i komplekse samfund er således på forkant med biofilm forskning.
En mekanistisk forståelse af morfogenesen af komplekse biofilm som reaktion på Miljøsignaler kræver omhyggeligt udformede eksperimenter sammen med rumligt og timeligt løste observationer af den fysiske struktur af biofilder på tværs af relevante vægte8. Den ikke-destruktive observation af biofilm-væksten i forsøgssystemer er imidlertid blevet stærkt begrænset af logistiske begrænsninger såsom behovet for at flytte prøver (f. eks. til et mikroskop), der ofte skader den delikate biofilm struktur.
Protokollen præsenteres her introducerer et fuldt automatiseret system baseret på optisk kohærens tomografi (Oct), som tillader in situ, ikke-invasiv overvågning af biofilm morfogenese på en (mm rækkevidde). Oct er en spirende billeddannelses teknik i biofilm forskning med anvendelser i vandbehandling og foulingmiljø forskning, medicin9 og Stream økologi10. I OLT opdeles en lyskilde med lav sammenhæng i en prøve-og reference arm. interferensen af det lys, der reflekteres og spredes af biofilm (prøve armen) og lyset fra reference armen, analyseres. En række aksiale intensitets profiler (A-scanninger), som indeholder dybde-løste strukturelle oplysninger er erhvervet og fusioneret til en B-scanning (et tværsnit). En række tilstødende B-scanninger komponerer den endelige 3D-volumen scanning10. Oct giver en lateral optisk opløsning i intervallet ca. 10 μm og er derfor velegnet til at studere mesoskopisk strukturel differentiering af biofilm10,12. For en mere detaljeret beskrivelse af OLT henvises til Drexler og Fujimoto13og fercher og kolleger14. Selv om det synsfelt af en enkelt OLT XY-scanning når op til hundredvis af firkantede mikrometer, kan større skala mønstre ikke kvantificeres ved hjælp af OLT i en enkelt scanning. Med hensyn til biofilm i naturlige habitater som vandløb og floder begrænser dette i øjeblikket vores evne til at vurdere biofilden morfogenese på skalaer, der matcher den fysiske og hydrauliske skabelon af habitat.
For at overgå disse rumlige grænser og for at erhverve OCT scanninger automatisk, en spektral-domæne OCT Imaging Probe blev monteret på en 3-akse positionering system. Installationen tillader erhvervelse af flere Oct scanninger i et overlappende mosaik mønster (flise scanning), effektivt at opnå tomografisk Imaging af overfladearealer op til 100 cm2. Desuden gør dette Systems høje positionerings præcision det muligt pålideligt at overvåge væksten og udviklingen af biofilm-funktioner på bestemte steder under længerevarende eksperimenter. Systemet er modulært og individuelle komponenter (dvs. positionering enhed og OLT) af anlægget kan bruges som standalone løsninger eller fleksibelt kombineret. Figur 1 giver en oversigt over hard-og softwarekomponenterne i installationen.
Systemet blev testet med en kommercielt tilgængelig GRBL-kontrolleret CNC positionering enhed (tabel over materialer). Drifts afstanden for denne specifikke positionerings platform er 600 × 840 × 140 mm, med en fabrikant-angivet nøjagtighed på +/-0,05 mm og en programmerbar opløsning på 0,005 mm. GRBL er en open source (GPLv3 licens), højtydende bevægelsesstyring til CNC Enheder. Derfor bør alle GRBL-baserede (version > 1,1) positionerings enheder være kompatible med de retningslinjer og softwarepakker, der præsenteres her. Desuden kan softwaren tilpasses andre stepmotor controllere med trin-DIR INPUTTYPE med få modifikationer.
OLT-enheden, der anvendes til at vurdere systemets ydeevne (tabel over materialer), har en lyskilde med lav sammenhæng med en midterbølge længde på 930 nm (båndbredde = 160 nm) og justerbar reference Armlængde og-intensitet. I eksemplet præsenteret her, en nedsænkning adapter til dypning af OLT sonde i strømmende vand blev også brugt (tabel over materialer). Den softwarepakke udviklet her til automatiseret OLT scanning erhvervelse kritisk afhænger af SDK leveres sammen med det specifikke OLT-system, dog, OLT-systemer fra samme producent med forskellige scannings linser og centrale bølgelængder bør være let kompatible.
GRBL-enheden styres af en webserver, der er installeret på en computer med enkelt kort (figur 1). Dette giver fjernstyring af enheden fra enhver computer med lokale netværk eller internetadgang. OLT-enheden styres af en separat computer, der tillader driften af OLT-systemet til side den automatiserede eksperimentelle opsætning. Endelig, softwarepakkerne omfatter biblioteker til at synkronisere OCT Probe positionering og OLT scanning erhvervelse (dvs. at automatisk erhverve 3D imaging datasæt i en mosaik mønster eller i et sæt definerede positioner). Definere placeringen af OCT sonde i 3D effektivt gør det muligt at justere brændplanet specifikt for (regionale) sæt af scanninger. Specifikt på ujævne overflader kan forskellige målfly (dvs. forskellige positioner i z-retningen) specificeres for hver OLT-scanning.
Et sæt softwarepakker blev udviklet til at behandle rå OCT scanninger (tabel 1). Navigation af positionering enhed, OCT scanning erhvervelse og datasæt behandling udføres med Python-kodet Jupyter notebooks, som giver mulighed for bemærkelsesværdig fleksibilitet i udviklingen og optimering af softwaren. To arbejdede og kommenterede eksempler på sådanne notesbøger (til henholdsvis billed erhvervelse og-behandling) er tilgængelige fra https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git de er beregnet som udgangspunkt for tilpasning af metoden. En Jupyter notesbog er et webbrowser baseret program, der indeholder celler med kommenteret Python-kode. Hvert trin er indeholdt i en celle i notesbogen, som kan udføres separat. På grund af den forskellige længde af lysbanen gennem scannings linsen (sfærisk aberration)15, vises de rå Oct-scanninger forvrænget (figur 2a). Vi udviklede en algoritme til automatisk at korrigere for denne forvrængning i erhvervede OCT scanninger (indeholdt i Imageprocessing. ipynb, supplerende fil 1). Desuden kan biofilm morfologi visualiseres som et 2D-højde kort, som tidligere blev brugt i membransystemer16, og vi illustrerer, hvordan højde kort opnået fra scanninger taget i en flisebelægning kan sys.
Endelig illustreres funktionaliteten af den beskrevne laboratorieinstallation ved hjælp af et Flume-eksperiment, hvor fototrofisk Stream biofilm udsættes for en gradient af strømningshastigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. opsætning af positionerings enheden
- Wire positionerings enheden til et microcontroller Board, efter instruktionen i https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl.
- Tilslut mikrocontrolleren til en computer med en enkelt plade med internetforbindelse via et USB-kabel, og Installer GRBL-serveren som beskrevet i https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git. Nu skal positionerings enheden være navigerbar fra en webside, der hostes på http://IP:5020/. Alternativt kan positionerings enheden navistes med et Python-script, som det fremgår af den første del af det arbejdede eksempel imagesacquisition. ipynb (supplerende fil 2).
2. OCT-opsætning
- Monter OCT-sonden på positionerings enheden ved hjælp af en kompatibel Due-Tail-holder. Hvis det er nødvendigt, skal du installere en nedsænknings adapter på objektivlinsen.
- Placer computeren og Oct-basisenheden på en bænk ved siden af eksperimentet (f. eks. mikrofluidisk-enheder, flow kamre, flumes, filtreringssystemer). Sørg for, at den optiske ledning (maksimal længde på ca. 1,8 m) bevæger sig frit, længe nok til at nå alle tiltænkte steder og ikke forstyrrer den eksperimentelle opsætning.
- Installer OLT-systemet sammen med den tilgængelige software som beskrevet af producenten.
- Installer softwarepakkerne til automatiseret OLT-scannings anskaffelse som beskrevet i https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git.
3. erhvervelse af billede
- Tænd for OLT-systemet og positionerings enheden. Sørg for, at enheden kan bevæge sig frit.
- Åbn filen config. JSON i et tekstredigeringsprogram. Rediger filen config. JSON for at justere standardparameteren for billed anskaffelse (tabel 2), såsom brydningsindekset (1,33 for vand ved 20 °c, 1,00 for luft) og destinationsmappen for erhvervede data og metadata.
- Definer størrelsen på feltvisningen (FOV) og antallet af A-scanninger pr. B-scanning i config. JSON.
Bemærk: disse to parametre bestemmer størrelsen af voxels af det endelige datasæt og størrelsen af outputfilen og skal matche den optiske opløsning af sonden (x-y voxel størrelse bør ikke være mindre end halvdelen af den optiske opløsning). Antallet af A-og B-scanninger påvirker den rumlige udstrækning, der skal dækkes, som afhandler mod tilgængelig diskplads og processorkraft. - Definer signal grænserne for output OCT-scanningen i config. JSON. Disse afhænger af typen af prøve. Det anbefales derfor at bestemme disse parametre baseret på intensitet histogrammer af et sæt af indledende scanninger. Gem ændringerne i config. JSON.
- Naviger OLT-sonden til et sted af interesse. Fokuser prøven, og Juster reference armen og lyskildens intensitet for at opnå optimal billedkvalitet. Gentag denne procedure for en række positioner, og notér koordinaterne.
Bemærk: Dette vil gøre det muligt efterfølgende automatisk OLT scanning erhvervelse omkring disse referencepunkter. Bemærk, at reference armlængden og intensiteten ikke kan ændres under automatiseret billed erhvervelse. - Åbn filen Imageacquisition. ipynb (supplerende fil 2) i Juypter notebook. Hver celle indeholder kode til at udføre bestemte opgaver og kan køres separat via tryk på celle | Kør, eller CTRL + ENTER eller Shift + ENTER.
- Angiv stien til de påkrævede biblioteker og standard konfigurationsparametrene. Alternativt kan du definere et nyt sæt midlertidige parametre.
- Opret forbindelse til positionerings enheden, og Initialiser OLT.
- Kalibrer positionerings anordningen (dvs. udføre en "homing").
- Erhverve datasæt, der dækker positioner af interesser i single-Scan eller mosaik mønster, med angivelse af antallet og overlapning (f. eks., 30%) af tilstødende fliser.
Bemærk: hukommelsen allokeres før scanningen, hvilket optimerer brugen af computer ressourcer. Data gemmes i 8 bits *. RAW -format for at spare lagerplads i den destinationsmappe, der er defineret i config. JSON, ved hjælp af tidsstemplet og placeringen som navngivningskonvention (dvs.% Y% m% D_% H% m% S_ < position >). Metadata, herunder OLT-indstillingerne og-koordinaterne, gemmes i den samme mappe i en *. SRM -fil med samme navngivningskonvention. Afhængigt af indstillinger som FOV og opløsning kan filstørrelsen nå op til 1,5 GB pr. okt-scanning.
- For at undgå abort af dataindsamling, skal du sørge for, at der er tilstrækkelig ledig diskplads eller kontinuerligt flytte OCT datasæt til en ekstern harddisk.
4. billedkorrektion og-visning
- Åbn Jupyter notebook Imageprocessing. ipynb (supplerende fil 1) for et bearbejdet eksempel på Oct billedbehandling (korrektion af forvrængning, baggrund subtraktion, beregning af højde kort, højde kort syning).
- Hvis det er nødvendigt, beskære OCT scanninger for at udelukke falske signaler og omorienteret datasættet (biofilm skal vises over substratum).
- Korrekt til sfærisk aberration. Dette opnås ved en korrektions algoritme, der udnytter en meget reflekterende referenceflade kendt for at være flad (f. eks. bunden af Flume, substratum). For det første definerer algoritmen et gitter på 20 × 20 lodrette linjer, der regelmæssigt fordeles over XY-planet af OCT-scanningen. Derefter vælger det et cirkulært område omkring hvert punkt og gennemsnit signal intensiteter langs den lodrette profil (figur 2b). De lodrette profiler behandles med et modificeret Gaussian-filter:
hvor x er indgangssignalet, og σ dets standardafvigelse, mens C er bestemt som:
Reference overfladen er lokaliseret som lokale maksime i hver af disse profiler. Fejl identificerede punkter filtreres ud fra deres naboeres positioner i tre dimensioner (figur 2c). Endelig er en 2nd Order polynomium overflade, der afspejler den forvrængning, der introduceres af scannings linsen, monteret på tværs af disse punkter (figur 2c). Den monterede overflade bruges derefter til at skifte hver pixel i z-retning og dermed opnå et fladt billede. Parametrene for denne algoritme bør justeres til egenskaberne ved OCT-scanningen. - Korrekt for baggrundsstøj. Identificer et tomt område af billedet (typisk over biofilm), og brug korrektions algoritmen til at trække den gennemsnitlige baggrunds intensitet fra billedets intensitetsværdier til at producere et endeligt korrigeret OCT-billede (figur 2D).
- Beregn et elevations kort fra 3D OCT-datasættet. I dette trin skal du definere en referenceflade af interesse for det specifikke eksperiment (f. eks. substratum) og en passende tærskel intensitet. Brug derefter algoritmen til beregning af højde kort til at beregne tykkelsen af biofilm for hver koordinat (x, y) af den binære maske, og tildel den til en ny 2D-matrix (figur 3a). Tykkelses værdier tildeles derefter til en 2D-matrix af størrelsen på det oprindelige billede i x-og y-retninger. Et billede gengives, hvor højden af overfladen rapporteres som gråtoneværdi (figur 3b).
- I tilfælde af flere OCT scanninger er taget i et mosaik mønster, definere antallet af rækker og kolonner og sy de respektive højde kort. Figur 5 præsenterer eksempler på syede højde kort, der dækker den brede vifte af rumlige skalaer og opløsninger opnåelige med den beskrevne opsætning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi demonstrerer funktionaliteten af det automatiserede OCT-billedbehandlingssystem ved hjælp af et Flume-eksperiment, der er designet til at studere den spatio-temporale morfogenesis af fototrofisk Stream biofilms. En gradvist indsnævring geometri af flumes inducerede gradienter i strømningshastigheden langs midten af fluen (Se reference17). Den tidsmæssige udvikling og strukturelle differentiering af biofilm blev overvåget i løbet af 18 dage med henblik på bedre at forstå virkningerne af hydrodynamiske tilstande på biofilm morfogenesis. Figur 4 viser væksten i en biofilm mikrokoloni efterfulgt af 18 dages vækst. Overflade morfologien af biofilm blev kvantificeret ved hjælp af det ovenfor beskrevne værktøjsæt (figur 4a). Biovolume blev beregnet (Se bearbejdet eksempel Imageprocessing. ipynb, supplerende fil 1) for et firkantet bevægende vindue med 3,6 mm kantlængde (figur 4b) for hver position langs strømningshastigheden gradient (figur 4c). Ophobning af biofilm faldt markant med stigende strømningshastighed (angivet som afstanden fra den bredeste del af Flume; Figur 4). Det er vigtigt, at denne eksperimentelle opsætning muliggør en kontinuerlig måling af strukturelle parametre (f. eks. biovolume, tykkelse, ruhed) langs store rumlige gradienter. Derfor er dette nye værktøj giver mulighed for at få indsigt i forholdet mellem biofilm struktur og miljømæssige signaler.
| Software komponent | Beskrivelse |
| stepcraft.py | Et Python-bibliotek til at styre positionerings enheden. Den indeholder definitioner til navigering og homing af enheden. |
| OctControl. cpp | C++-kode afledt af SDK (Software Development Kit), som distribueres sammen med OLT-systemet. Dette skal kompileres ved hjælp af VisualStudio 2017, PythonC/API og SDK. |
| ImagesAcquisition.py | Et Python-bibliotek, der indeholder kommandoerne til at tage OCT-scanninger i udvalgte positioner og definere scannings mønsteret. |
| ImagesAcquisition. ipynb | Jupyter notesbog bruges til at navigere positionerings enheden, erhverve OCT scanninger og til automatiseret billed erhvervelse. |
| OctCorrection.py | Et Python-bibliotek, som definerer de funktioner, der bruges til rettelse af de rå OLT-billeder og baggrunds subtraktion. |
| OctProcessing.py | Et Python-bibliotek, der indeholder funktionerne til at beregne og sy højde kort. |
| OctProcessing. ipynb | Jupyter notesbog til at visualisere, korrigere og behandle OCT scanninger. Dette indeholder også et eksempel på biovolumen beregning. |
Tabel 1. Software komponenter.
| Parameter | Værdi | Beskrivelse |
| Ganymede | 1, 2, 3 | Valg af OLT-system og version |
| Sonde | 1, 2 | Valg af scannings objektiv |
| nAscans | 32-900 | Antal A-scanninger pr. B-scanning |
| nBscans | 1-900 | Antal B-scanninger |
| nCscans | 128-1024 | Antal dybde pixels |
| X | 0,1-10 | Billedets størrelse i x-retning (mm) |
| Y | 0,1-10 | Billedets størrelse i y-retning (mm) |
| Refr | 1-1.6 | Brydningsindeks (1 for luft, 1,33 for vand) |
| avg_Ascans | 3 | Antal A-Scan-gennemsnit |
| scanspeed | 1, 2, 3 | A-scanningshastighed (5,5, 15 og 36 kHz) |
| Sti | ".. /% Y-% m-% D_% H_% M_% S " | Destinationsmappe for de erhvervede OCT scanninger, bruger tidsstempel som navngivning Confessions |
| Colorafgrænsninger | [0,0-256.0, 0,0-256.0] | Farvegrænser for de erhvervede scanninger |
Tabel 2. OCT-parameterindstillinger.
Figur 1. Oversigt over hard-og softwarekomponenter. Stepmotorerne på en GRBL-kontrolleret positionerings enhed er forbundet til en microcontroller, der er tilsluttet via USB til en enkelt-bord computer. GRBL-serveren er installeret på sidstnævnte, og bevægelse af positionerings enheden kan styres fra enhver webbrowser via TCP/IP-forbindelse. Alternativt kan navigation af positionerings anordningen udføres fra en Python-kodet Jupyter notebook (Imagesacquisition. ipynb, supplerende fil 2) ved hjælp af GRBLServer.py biblioteket. OCT-systemet er forbundet til en separat computer, hvorfra automatiseret OLT scanning erhvervelse kan udføres via en Python script. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. OCT scanning korrektion workflow. Panel A viser en ikke-forarbejdet B-scanning af biofilm, der vokser på en flad plexiglas overflade. Billedet er forvrænget (bøjning) på grund af forskelle i stilængde af den lave kohærens lys gennem linsen. OCT billedforvrængning kan korrigeres ved at identificere en stærkt reflekterende, flad reference overflade i billedet. For det første er 20 × 20 referencepunkter jævnt fordelt over hele stakken af billeder. I hvert af disse punkter er billedsignalet gennemsnitligt på tværs af et cirkulært område (i x-y-retning) for hver dybde (z-plan) og opnår en gennemsnitlig dybde profil af signal intensiteten. Derefter anvendes et modificeret Gaussian-filter på hver af 400-reference profilerne. Panel B giver et eksempel på det oprindelige signal langs den dybde profil, der er angivet af den lodrette røde linje i panel A, den gennemsnitlige dybde profil og den samme profil, efter at det modificerede Gaussianfilter er blevet anvendt. Det modificerede Gaussian-filter gør det muligt at identificere de lokale maksime i signal intensiteten og dermed fastslå placeringen af den stærkt reflekterende referenceflade. Korrekt identificerede referencepunkter vælges derefter baseret på koordinaterne for deres naboer i tre dimensioner. I eksemplet i panel C blev de gule punkter holdt for efterfølgende billedkorrektion, hvorimod de lilla blev kasseret. En 2nd Order polynomium overflade er derefter egnet til de korrekt placerede referencepunkter og bruges til at korrigere forvrængningen i det oprindelige Oct-billede ved at skifte pixel i z-retningen. Den gennemsnitlige baggrunds intensitet anslås ud fra et tomt område af billedet og trækkes fra de rettede billeder. Panel D viser den samme B-scanning efter korrektion og baggrunds subtraktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Højde kort. Biofilm topologi kan visualiseres som 2D-højde kort, hvor tykkelsen af biomassen er farvekodet. Til dette, en 3D OCT billede er thresholded og biofilm tykkelse beregnet som afstanden af det øverste signal til substratet. Panel A viser den binære maske af en B-scanning opnået efter thresholding. Den blå linje angiver det øverste signal, mens den røde linje viser reference overfladen. Panel B viser et eksempel på den opnåede højde kort, skaleret i henhold til den aksiale opløsning af OLT-sonden. Den røde linje angiver placeringen af B-scanningen i panel A.
Figur 4. Repræsentative resultater, der viser effekten af strømningshastigheden på væksten af biofilm. Vi har studeret phototrophic Stream biofilm morfogenese langs en gradient i flowhastighed ved hjælp af Flume eksperimenter. Strømningshastigheden steg med afstanden fra fluens indløb. Efter 10 dages vækst var biofilm morfologi karakteriseret ved automatiseret OLT ved forskellig opløsning og dækkede forskellige rumlige skalaer. Højde kort (A, B og C) viser morfologien for biofilm, der dyrkes under henholdsvis lav, medium og høj strømningshastighed. Disse højde kort er beregnet fra OCT scanninger med voxels størrelse i x, y retning af 4 μm. Scannings overfladearealet er en firkant på 3,6 mm kantlængde. Paneler D, E og F viser højde kort (henholdsvis lav, medium og høj strømningshastighed) opnået ved syning 3 × 3 okt scanninger med en voxel størrelse i XY-retning af 11 μm, scanningsområde på 10 mm2 og en overlapning mellem tilstødende scanninger af 30%. Panel G viser et højde kort over biofilm, som vokser langs hele den hastigheds gradient, som er opnået i dette Flume-eksperiment. Det blev opnået ved syning 3 × 51 okt scanninger med en voxel størrelse i XY-retning af 40 μm, Scan område på 10 mm2 og en overlapning mellem tilstødende scanninger af 30%. Det samlede scanningsområde, der opnås, er 24 × 353 mm. panel H rapporterer biovolumen i et firkantet bevægende vindue på 3,6 mm kant. Gennemsnitlig biovolumen faldt signifikant som en funktion af afstanden fra indløbet (I). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Præcisions test for positionerings enheden. Præcisionen af positionerings anordningen blev vurderet ved at montere et 20,2 megapixel kamera udstyret med en 35 mm makro linse på positionerings enheden, fokuseret på et farvet mærke. Positionerings enheden blev flyttet i en tilfældig retning væk fra mærket og derefter placeret tilbage til i alt 80 cyklusser. Positionen af mærket blev derefter sammenlignet. Figuren viser skiftet i x-og y-retning med hensyn til det første billede. Bemærk, at det maksimale Skift er ca. 16 μm i y-retning og endnu mindre i x-retning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil 1. Imageprocessing. ipynb. Klik venligst her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2. Imagesacquisition. ipynb. Klik venligst her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCT Imaging er velegnet til at løse strukturer i mikrometer området med en FOV på flere kvadrat millimeter. Det er således et effektivt værktøj til forskning i biofilm10,18. Men, OCT er i øjeblikket begrænset til et maksimum Scan område på 100-256 mm2, mens biofilm strukturelle mønstre ofte overstiger denne rumlige skala19, især når morfologiske differentiering er drevet af store miljømæssige gradienter 20. det automatiserede OLT-billedbehandlingssystem, der er beskrevet i denne protokol, udvider det overfladeareal, som er karakteriseret ved OLT, til flere kvadratcentimeter, hvilket effektivt gør det muligt at overvåge biofilm morfologiske differentiering over et relevant interval (fra få millimeter til flere centimeter). Den høje positioneringsnøjagtighed (inden for 16 μm; Figur 5) giver mulighed for nøjagtigt at overvåge den strukturelle udvikling af biofilmer i længere perioder (figur 4), hvilket effektivt øger mulighederne for at opnå en mekanistisk forståelse af drivkræfterne for biofilm morfologiske differentiering . På samme tid er denne in situ-biofilm-karakteriserings teknik ikke-invasiv og minimerer interferensen med biofilm vækst. De billedbehandlings løsninger, der præsenteres her, bygger på tidligere beskæftigede analyser af biofilm Oct datasæt16, men automatiseringen giver værktøjer til hidtil uset tid-og plads løst OLT-datasætanalyser.
Dette system blev udtænkt og benchmarkes med en specifik OLT-enhed, som beskrevet i protokollen. Kritiske trin i protokollen vedrører hovedsageligt fastsættelsen af OLT-resolution og fokusering, som begge er afgørende for høj billedkvalitet. En begrænsning af korrektionen af sfæriske aberrationer rutine er, at det afhænger af tilstedeværelsen af en meget reflekterende flad overflade. Alternativt kan en standardkorrektion overflade måles, og derefter bruges til at korrigere OCT scanninger. Desuden, syning af OCT scanninger afhænger af tilstrækkelige strukturelle funktioner til at tilpasse tilstødende scanninger. I tilfælde af ensartet biofilm-distribution eller lav biofilm-dækning kan syningen opnås ved udelukkende at være afhængig af positionerings enhedens præcision. Endelig, som i enhver anden billedbehandling rørledning, når du konfigurerer disse værktøjer, er det vigtigt at nøje vurdere udførelsen af behandlingen algoritme på et sæt repræsentative scanninger før håndtering af partier af billeder.
Både hard-og software er designet til at give fuld modularitet af de enkelte dele. Mere specifikt, dette system kan let tilpasses til at arbejde med andre værktøjer til biofilm karakterisering såsom makro-fotografering billeddannelse ved hjælp af hyperspectral kameraer eller mikrosensor profilering. Koblingen af strukturel information med lokaliserede gradienter i ressourcer omkring og inden for biofilm vil give nye og afgørende indblik i, hvordan biofilm er tilpasset for at optimere ressourceallokering. Fleksibiliteten er også implementeret ved brug af Jupyter notebooks, et åbent, hurtigt og alsidigt softwareudviklings værktøj.
En kritisk begrænsning af OCT Imaging i almindelighed forbliver handicappet til at løse hurtigt bevægende objekter. F. eks. er streamere, der går ind i og bevæger sig med flowet, ikke afbildet nøjagtigt. Anvendeligheden af dette værktøj er således begrænset til relativt faste, ikke-bevægende biofilm strukturer. Systemet er optimeret til at arbejde selvstændigt, dog, indledende indstillinger og om nødvendigt Manuel justering af fokus og belysning, er stadig påkrævet. Dette udgør en betydelig begrænsning, hvis prøverne afviger betydeligt i tæthed og reflekterende egenskaber. Fuld automatisering, herunder softwarestyret fokusering og justering af belysningen, kan dog opnås ved hjælp af lignende principper (f. eks. stepper motorer og software-hardware-feedbacks).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Sebastian Schäfer er ansat hos Thorlabs Inc.
Acknowledgments
Vi takker Mauricio Aguirre Morales for hans bidrag til udviklingen af dette system. Finansiel støtte kom fra Swiss National Science Foundation til T.J.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
References
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).
- Flemming, H. -C., et al. Biofilms: an emergent form of bacterial life. Nature reviews. Microbiology. 14, 563 (2016).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop. Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow. Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).
- Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Microbiology. 14, 251-263 (2016).
- Battin, T. J., et al. Microbial landscapes: new paths to biofilm research. Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).
- Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm. J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002 (2016).
- Wagner, M., Horn, H. Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review. Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
- Haisch, C., Niessner, R. Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography. Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , Springer Verlag. (2008).
- Fercher, A. F. Optical coherence tomography – development, principles, applications. Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).
- Lee, H. -C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy. Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).
- Fortunato, L., Leiknes, T. In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping. Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
- Roche, K. R., et al. Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams. Water Resources. 53, 222-236 (2016).
- Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor. Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).
- Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales. Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).
