Summary
이 프로토콜은 면역 억제 상태에서 이차 병원 획득 감염의 근본적인 전염성 결과를 측정하는 기술을 설명합니다. 면역 억제 패혈증의 임상적으로 관련 모델을 만들 수 있습니다.
Abstract
패혈증, 심각하고 복잡한 생명을 위협하는 감염, 여러 장기에 프로 와 항 염증 반응 사이의 불균형을 특징으로한다. 치료의 발달로, 대부분의 환자는 과염증상을 살아남지만 면역 억제 단계로 진행되어 이차 감염의 출현을 증가시킵니다. 따라서 패혈증 중 면역억제 단계에서 이차 병원 획득 감염의 근본적인 발병기전에 대한 이해가 크게 중요하다. 여기에서 보고된 것은 마우스에 있는 이중 명중 감염을 만들어서 감염성 결과를 시험하는 모형입니다. 표준 외과 적 절차는 세칼 결찰과 천자 (CLP)에 의한 다발성 복막염을 유도하는 데 사용되며, 황색포도상구균의 비강 내 감염에 이어 면역 억제에서 발생하는 폐렴을 시뮬레이션하는 것이 빈번하게 보입니다. 정화조 환자에서. 이 이중 모형은 nosocomial 폐염에서 이차 감염에 연장된 패혈증 및 감수성을 가진 환자에서 일어나는 면역 억제 상태를 반영할 수 있습니다. 그러므로, 이 모형은 패혈증 유도한 이차 세균성 폐염의 병리생리학을 조사하기 위하여 간단한 실험적인 접근을 제공합니다, 패혈증과 그것의 합병증을 위한 새로운 처리를 발견하기 위하여 이용될 수 있는.
Introduction
패혈증은 호스트 프로 염증 및 항 염증 과정의 복잡한 상호 작용을 시작하고 과염증 반응 및후속 면역 기능 장애 1,2를특징으로합니다. 패혈증은 글로벌 건강 우선 순위를 나타내고 중환자실 (ICO)3에서 사망자의 높은 숫자를 일으키는 원인이 됩니다. 패혈증의 부각은 ICU 관리에 있는 어드밴스에도 불구하고 30%만큼 높은 사망률과함께, 매년 세계전반 3천만 건을 초과하는 것으로 추정됩니다 4,5. 2017년 세계보건기구(WHO)는 이 치명적인 질병의 예방, 진단 및관리를 개선하기 위한 결의안을 채택했다 5. 그러나, 최근 연구는 죽음이 가혹한 정화조 환자에 있는 1 차적인 감염에서 유래하지 않으며 오히려 면역 억제에 기인한 이차 nosocomial 감염 (특히 폐염)에서 유래하지 않는다는 것을 설명했습니다6,7 . 그러므로, 정화조 환자가 이차 감염을 개발하는 이유의 기계장치를 이해하고 더 효과적인 처리를 발견하는 것은 긴급하게 요구됩니다. 본 명세서에서, 이중 모델은, 또한 이중 히트 모델로 알려져 있으며, 연장된 패혈증환자에서 발생하는 면역억제 현상을 연구하는 것으로 설명된다.
다미생물 패혈증에 대한 연구에서 금 표준 실험 모델로서, 세칼 결찰 및 천공 (CLP)은 항양 결찰 및 천공을 특징으로하는 수술로, 다미생물 후막염 및 패혈증8,9에 기여합니다. . 병리생리학적 과정과 사이토카인 프로파일은 운동학 및 크기와 함께 임상 패혈증과 유사합니다. 결찰의 위치, 천자에 사용되는 바늘 크기 및 세칼 천자의 수는 CLP 다음 사망률에 영향을 미치는 주요 요인입니다.
nosocomial 폐렴은 패혈증을 가진 중요하게 아픈 환자 중 사망의 주요 원인입니다. 가혹한 패혈증을 일으키는 원인이 되는 유기체의 주요 모형은 황색포도상구균 (20.5%), 슈도모나스 종 (19.9%), 장균학 (주로 대장균,16.0%), 및 균류 (19%)를 포함합니다. 한편, 최근 연구는 그람 음성 생물의 증가 발생률을 제안했다, 이는 지금 거의그람 음성 감염으로 일반적이다 3.
이 프로토콜에 기술된 방법은 면역 억제 상태를 나타내는 치명적인 다발성 복막염을 유도하는 "첫 번째 히트"로 수행되는 CLP를 포함합니다. 절차는 또한 임상적으로 관련있는 연구 플랫폼을 제공하기 위하여 "두 번째 명중"으로 S. 아우레우스의 연속적인 비강 점술을 관련시킵니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 방법은 국립 연구소 의 실험실 동물 관리 및 사용에 대한 보건 가이드에 따라 수행되었으며 노스 다코타 대학기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다.
1. 세칼 결찰 및 펑크
참고: 여성 C57BL/6 마우스(체중, 18-22 g, 나이, 6-8주)는 무작위로 6개의 그룹으로 나뉩니다: 대조군(Ctrl), 감염군(S. 아우레우스를위한 SA), 2개의 샴 그룹, 2개의 CLP 그룹. Ctrl 동물은 수술과 이차 감염 부상없이 남아 있습니다. SA 동물은 수술없이 S. 아우레우스 폐 감염을 받게됩니다. 샴 작동 동물은 장의 박람회와 동일한 개복 절제술을 받습니다 (소골이 결찰되거나 구멍을 뚫지 않은 경우 제외). 그룹당 8마리의 마우스가 생존 분석을 위해 사용되며, 3~5마리의 마우스가 다양한 시점에서 염증 을 평가하는 데 사용됩니다.
- 수술 전에 20 분 동안 오토 클레이브하여 모든 수술 기구와 재료를 소독하십시오. 수술 중 멸균 상태를 설정하려면 적절한 멸균 수술 커튼으로 수술 분야 전체를 덮고 머리 덮개, 수술 용 마스크, 보호 안경, 수술 용 가운 및 멸균 장갑을 착용하십시오.
- 케타민 (80 mg/kg), 자일라진 (10 mg/kg) 혼합물을 복강 내 투여한 0.1 mL/마우스를 사용하여 마우스를 계량하고 마취시다. U자 형 의 자세를 형성하는 왼손의 엄지 손가락과 검지 손가락으로, 원활하고 부드럽게 뒤에서 마우스의 목에 접근 한 다음 마우스 머리가 매우 억제되도록 귀 바로 뒤에 목을 잡습니다. 핑키(pinky)를 사용하여 마우스의 오른쪽 등다리를 잡고 가운데손가락과 링 핑거(왼손의 모든 손가락)를 사용하여 몸을 잡습니다.
- 말단의 굴곡이 없을 때까지 발가락 핀치로 마취의 강도를 확인하십시오.
- 전기 면도기로 복부의 하부 사분면을 면도하고 요오드로 부위를 소독하십시오.
- 마우스를 작업자로부터 멀리 향하게 하는 소핀 위치에 마우스를 놓습니다. 멸균 필드를 유지하기 위해 계획된 수술 절개 위에 구멍이있는 멸균 수건으로 마우스를 드레이프하십시오.
- 왼쪽 하복부에 메스로 세로 피부 절개 (약 0.5 cm 길이)를 만듭니다. 작은 가위를 사용하여 절개를 연장하십시오 (1-2cm).
주의: 복강이 침투하지 않도록 주의하십시오. - 복강으로 접근하고 인접한 내장을 가진 소막의 노출을 허용하기 위하여 근육 절개를 합니다.
- 복부의 왼쪽에있는 소장을 분리 (대부분의 경우, 이것은 무딘 해부학 적 집게를 사용하여 수행됩니다) 멸균 드레이프에 제거, 복막 구멍에 소장과 대장을 떠나.
주의: 반막혈관을 손상시키지 마십시오. - 말단 25% 위치에 있는 장합을 리게이트하여 상대적으로 낮은 사망률을 가진 장기간 감염을 만듭니다.
주의: 일레오세칼 밸브를 분리하지 않도록 하십시오. - 최소 혈관 영역에서 결찰과 끝 사이의 중간에 단일 관통 관통 펑크 (두 구멍)에 의해 21 G 1 1/2 바늘로 장혈을 천공.
주의: 혈관에 구멍을 뚫지 않도록 하십시오. - 바늘을 제거합니다. 침투 구멍에서 소량의 대변을 부드럽게 돌출하여 전체 두께 의 천공을 보장합니다.
주의: 시술 중에 장 연속성을 방해하지 않도록 주의하십시오. - 양모를 복강으로 교체하십시오.
- 4-0 나일론 수술 봉합사로 두 층으로 복부를 닫습니다. 간단한 달리기 봉합사를 적용하여 복부 근육을 닫고 간단한 중단 봉합사를 적용하여 피부를 닫습니다. 요오드로 피부를 청소하십시오.
- 3mL의 미리 따뜻해진(37°C) 0.9% 멸균 정상 식염수(NS) 용액을 피하로 후면에 주입하여 세 번째 공간 손실을 대체하고 이를 따뜻한 패드에 놓아 회수합니다.
- 12 시간 빛 / 어두운 주기와 음식과 물에 무료로 액세스 온도 제어 실 (22 ° C)에서 케이지에 마우스를 반환합니다. 적어도 2 시간 동안 매 0.5 시간마다 마우스를 모니터링한 다음 적어도 2 d에 대해 6 시간마다, 3 일 동안 매 12 시간마다, 또는 생존 분석을 위해 moribund 때 안락사시.
참고 : 수술 전 및 수술 후 진통 (buprenorphine, 50 μg / kg마다 12 시간)은 수술 후 48시간까지 수술 전 24 시간 동안 권장됩니다 9,10.
2. S. 아우레우스를 가진 이차 폐 감염
참고: Ctrl 및 SA 기들을 제외하고, 3일 후 CLP 후 샴 및 CLP 그룹에서 생존한 마우스는 각각 30 μL의 세균 현탁액 또는 NS로 경질 투여되어야 한다. SA 그룹에서 살아남은 마우스는 세균 현탁액으로 내적으로 주입되어야 합니다.
- 케타민 (45mg / kg)과 자일라진 (10 mg / kg)의 100 μL 용액을 복강 내 주입하여 마우스를 마취시키고 마우스가 천천히 호흡 할 때까지 기다립니다. 느린 주입을 위해 바늘과 복벽 사이의 천공 각도는 30 ° 미만입니다.
- 마이크로 파이펫의 도움으로, 천천히 그리고 intranasally 흡입에 흡인될 S. 아우레우스의 1 x 107 콜로니 형성 단위 (CFU)의 30 μL로 주입합니다. 마우스를 똑바로 세워서 마우스를 잡고 매번 두 콧구멍에 2-3 μL의 세균 현탁액을 천천히 떨어뜨립니다. 마우스가 거품을 형성하고 떨어뜨리지 않고 흡입할 수 있도록 방출 속도를 조정합니다.
- 마우스를 위아래로 올리고 머리를 위아래로 올리고 꼬리를 아래로 올려 박테리아가 기관에 들어갈 수 있도록 돕습니다. 마우스를 빠르고 강하게 위로 움직이면서 마우스를 부드럽고 천천히 아래로 이동하여 중력을 높입니다. 모든 박테리아가 흡입 될 때까지 약 15 배 의 증원을 반복하며, 각 마우스당 10-15 분이 소요됩니다.
- 마우스를 등에 올려 놓고 각진 침구 (약 35°)에 머리를 올려 놓고 호흡이 정상으로 돌아올 때까지 마우스를 보고 마취 및 절차에서 완전히 회복됩니다.
- 12시간 의 빛/어두운 주기와 음식과 물에 무제한으로 접근할 수 있는 온도 제어 실(22°C)의 케이지에 마우스를 다시 놓습니다.
- 첫날과 수술 후 4일 동안 12시간마다 마우스 상태를 확인합니다. 생존 분석을 위해 moribund 또는 염증의 평가를 위한 감염 후에 24 시간 때 그(것)들을 안락사하십시오.
3. 분석된 매개변수
- 마우스 생존
- 마우스를 7일 동안 모니터링합니다. 카플란-마이어 방법11을사용하여 생존 곡선을 생성할 때 안락사한다.
- 세균 수
- SA 주사 후 24시간, 마우스로부터 혈액, 기관지 정맥 세척액(BALF), 및 상막 세척액(PLF)을 수확한다. 이어서, 희석제의 100 μL을 영양한 한천 판에 넣고 37°C에서 24시간 동안 배양하여 세균 콜로니 카운트11,12,13을결정한다.
- Cytokines
참고: 생쥐의 혈청 및 BALF에서 IL-1β, IL-6 및 TNFα의 염증성 사이토카인 농도는 제조사의 지침에 따라 ELISA 키트를 사용하여 평가되어야 합니다.- 96웰 ELISA 플레이트를 100 μL/well의 다른 포획 항체 작업 용액으로 코팅하여 중복 및 샘플에서 표준을 실행합니다. 접시를 밀봉하고 4 °C에서 하룻밤 둡니다.
- 255 μL/웰 워시 버퍼(1x PBS, 0.05% 트웬-20)로 플레이트를 세 번 세척합니다.
- 비특이적 결합을 차단하려면 200 μL/잘 희석제를 추가합니다. 접시를 밀봉하고 실온 (RT)에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 표준 솔루션 준비: 1000 pg/mL의 8개의 2배 직렬 희석.
- 100 μL/웰의 표준 또는 샘플을 적절한 웰에 추가하고 빈 우물에 희석제 100 μL/well을 추가합니다. 접시를 밀봉하고 4 °C에서 2 시간 또는 하룻밤 동안 RT에서 배양하십시오.
- 255 μL /well 세척 버퍼로 플레이트를 5x 씻으소서.
- 적절한 웰에 100 μL/well의 다양한 검출 항체 작업 용액을 추가합니다. 접시를 밀봉하고 RT에서 1 시간 동안 배양하십시오.
- 255 μL /well 세척 버퍼로 플레이트를 5x 씻으소서.
- 희석된 HRP 용액 100 μL/웰을 모든 웰에 추가합니다. 접시를 밀봉하고 RT에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 255 μL /well 세척 버퍼로 플레이트를 5x 씻으소서.
- 100 μL/잘 희석된 TMB 용액을 추가합니다. 15 분 동안 RT에서 빛에서 멀리 접시를 배양.
- 50 μL/웰 스톱 솔루션(1M H3PO 4)을 추가합니다. 플레이트 리더로 450 nm에서 흡광도를 판독합니다.
- 유세포분석
- BALF에서 총 셀 수를 가져옵니다. ACK 용해 완충제를 사용하여 적혈구를 용해시키고 PBS를 사용하여 2x를 세척하십시오.
- 앞서 설명한 바와 같이 유세포측정에 의한단일세포 현탁액을 분석한다(11). 표면 염색을 위해, APC 항 마우스 CD11b 및 반대로 마우스 Gr-1 (Ly-6G/Ly-6C) 항체를 가진 얼룩 호중구 (CD11b +GR-1+). 분석을 위해 최소 3 x 104 라이브 비 파편 셀을 수집합니다.
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Representative Results
실험 설계 및 절차에 따라, C57BL/6 마우스를 CLP를 실시하였고, 3일 후에, 그들은박테리아를 무성하게 투여하였다(도 1). 도2에 나타낸 바와 같이, 마우스는 후배염의 유도 후 ~12시간에서 죽기 시작했다. CLP+SA 군에서 2마리의 마우스와 CLP+NS 군의 3마리의 마우스가 비강 내 S. 아우레우스 주입 전에 사망했다. 감염되지 않은 비 또는 가짜 작동 마우스에서 사망률이 검출되지 않았다. 따라서, 마우스가 폐렴 전에 CLP를 가졌을 때, 사망률은 훨씬 높았다 (p < 0.05). 비강 내 박테리아 도전 후 (1 x 107 CFU), 8 개의 마우스 중 3 개는 SA 및 Sham + SA 그룹에서 생존했으며 8 명의 마우스 중 4 명이 CLP + NS 그룹에서 생존했습니다. 그러나, 모든 8개의 마우스는 CLP+SA 단에서 정지했습니다. 대조적으로, Ctrl 그룹과 Sham+NS 그룹의 모든 마우스는 살아남았습니다. CLP 마우스는 S. 아우레우스에 도전할 때 더 많은 사망률을 보였다. CLP 후 S. 아우레우스의 사망률 (100%) 혼자 감염(37.5%)보다 높았다. 또는 S. 아우레우스 후 sham-운영 (37.5%; p & 0.05).
도3에 도시된 바와 같이, 심한 케쿰 괴사는 CLP 이후 동물에서 관찰되었지만, 더 많은 이중 히트 군(CLP+SA)으로부터 관찰되었다. 그러나, 통제에 있는 장모의 총 변경이 없었다 또는 박테리아 단을 가진 단 하나 명중. 혈액, BALF 및 PLF는 CLP 후 3일 후 S. 아우레우스에 감염된 마우스의 폐 세균 클리어런스를 평가하기 위해 배양하였다. 이러한 높은 치사성은 샴 마우스와 비교하여 CLP 마우스의 혈액 및 PLF에서 현저하게 증가된 S. 아우레우스 CFU와 연관되었다(p< 0.05; 그림 4A,C). CLP+SA 마우스의 혈액 및 BALF에서 S. 아우레우스 CFU의 수는 CLP+NS 마우스(p< 0.01; 그림 4A,B).
프로-염증 성 사이토카인의 경우, 결과는 CLP 단독으로 또는 sham-operated에 CLP를 시행한 마우스에 비해 패혈증 생존 마우스에서 세균 주입 후 24 시간에서 혈청 IL-1β, IL-6 및 TNFα의 발현 수준이 유의하게 증가한다는 것을 보여주었습니다. S. 아우레우스에 도전 마우스 (그림5A). 그러나, 프로-염증성 사이토카인은 이차 감염을 가진 패혈증 마우스의 BALF에서 약간 증가, 대조군 감염 마우스에서 그들과 다른 (SA 마우스) 및 Sham+SA. 한편, 더블 히트 마우스는 SA 및 Sham+SA 마우스 둘 다에 비해 BALF IL-1β, IL-6 및 TNFα 수준에서 현저하게 감소된 수준을 나타내었다(p< 0.001; 도5B)를 참조하십시오.
도6에 나타낸 바와 같이, 마우스는 감염 후 24시간에서 희생되었고, BALF에서의 상대호중구 백분율은 유세포측정에 의해 검출되었다. 더블 히트 마우스는 단독으로 S. 아우레우스 폐렴을 겪은 마우스에 비해 BALF에서 호중구의 현저한 감소를 나타내었다. 종합적으로, 이 데이터는 CLP가 호스트 면역 반응을 손상한다는 것을 보여주었습니다, 이차 세균성 폐염에 증가한 감수성 귀착되는.
그림 1 : 실험적인 디자인. 마우스를 6개의 그룹으로 무작위로 나누었다. 두 그룹은 D0에서 세칼 결찰 및 펑크 (CLP)를 시행하고, 다른 그룹은 sham-operate 또는 조작되지 않았다. 수술 3일 후(D3), S. 아우레우스[SA, 1 x 107 콜로니 형성 단위(CFU)] 또는 정상 식염수(NS)를 무성하게 투여하였다. 대조군(Ctrl) 마우스는 무성하게 주입되지 않았다. 혈액, 기관지 세척액(BALF) 및 후막 세척액(PLF)은 박테리아 카운트 분석에 대한 SA 주사 후 24시간 후에 수확되었다. 생존 분석을 위해 7일 동안 각 군의 사망률을 관찰하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 마우스 생존. CLP 또는 sham 수술에 제출된 C57BL/6 마우스는 수술 후 3일째에 S. 아우레우스(SA) 또는 정상 식염수(NS)를 받았다(그룹당 8마우스). 마우스를 7일 동안 모니터링하였고, 사망률은 12시간마다 기록되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 마우스 스양. 이차 감염은 CLP 후 3일 후에 유도되었다. SA 감염 후 24시간, 마우스를 결장 조직을 수집하기 위해 희생하였다. 다른 부상 히트에서 세칼 결찰의 대표적인 사진이 표시됩니다. SA = S. 아우레우스; NS = 일반 식염수; CLP = 세칼 결찰 및 펑크. 배율 막대 = 1cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 세균 수와 한천 접시의 대표적인 이미지. 수술 후 3일 후, 마우스는 S. 아우레우스(SA)의 1 x 107 CFU(그룹당 n ≥ 3 마우스)로 무성하게 주입하였다. 혈액, BALF 및 PLF는 SA 주사 후 24시간 수확되었고, 세균 콜로니 카운트는 24시간 배양 후에 결정되었다. 결과는 평균 ± SEM. 단방향 ANOVA(Tukey의 포스트 호크; *p&0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ns = 유의하지 않음)로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : ELISA 검출 사이토카인 분비. 이차 감염은 CLP 후 3일 후에 유도되었다. SA 감염 후 마우스로부터 의 혈청(A) 및 BALF(B)에서 IL-1β, IL-6 및 TNFα의 농도(n ≥ 3 마우스). 데이터는 3개의 실험의 평균 ± SEM으로서 제시된다. 편도 ANOVA (Tukey의 포스트 혹; *p < 0.05; **p < 0.01; ****p < 0.0001; ns = 중요하지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 호중구 침투의 대표적인 주파수. 24시간 비강 내 감염 후, 마우스는 BALF를 얻기 위해 희생하였다(그룹당 3마리의 마우스). 호중구(CD11b+, GR-1+)의백분율은 유세포분석으로 정량화되었고 3가지 실험의 ± SEM을 수단으로 나타내고 있다. 단방향 ANOVA (Tukey의 포스트 혹; ****p & 0.0001; ns = 중요하지 않음). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
패혈증 연구를 위한 금 본위제 모델로서 CLP는 개복술로 인한 조직 외상, 장골 결찰로 인한 괴사, 전좌로 복막염을 유발하는 미생물 누출의 결과로 인한 감염 등 세 가지 모욕을 조합한 것입니다. 혈액으로 박테리아의8. 따라서 CLP는 다른 많은 모델보다 인간 패혈증의 복잡성을 더 잘 모방합니다. 그러나, 현재 CLP 모델의 주요 제한은 ICU 3,4,5에서환자에서 볼 수 있는 패혈증의 더 장기간 단계를 반영할 수 없다는 것입니다. 그러므로, 임상적으로 관련있는 이중 모형 (더블 히트 모형)는 패혈증의 연기한 사망을 반영하고 폐 이차 감염의 근본적인 기계장치를 조사하기 위하여 제안되었습니다. 이 프로토콜에서, 패혈증은 CLP 후 3일 후 CLP에서 ClP와 S. 아우레우스 폐 감염을 결합시킴으로써 유도되었다. 2 히트 마우스 는 더 높은 사망률을 나타냈다, 심한 맹장 손상, 약화 혈액, BALF 박테리아 클리어런스, 낮은 프로 염증 성 사이토 카인, 그리고 BALF에서 낮은 호중구. 이것은 진료소에 있는 면역 억제 상태를 모방하는 가혹한 패혈증 귀착되었습니다.
다음 설명은 중요한 단계입니다. 자세히 표시된 것은 동일한 조건에서 치명적인 패혈증을 생성하는 방법입니다. 먼저, 암컷 마우스는 수컷 마우스(11)보다CLP에 더 내성이 있기 때문에 사용하였다. 둘째, CLP-유도 사망률은 결찰된 장골의 길이, 바늘 크기, 및 세칼 천자 수(9)와 같은 몇몇 기술적 파라미터에 의존한다. 장액의 약 75 %의 결찰은 심한 패혈증을 유도하고, 장액의 60 %의 결찰은 중간 수준의 패혈증을 유도하고, 25 %이하의 결찰은 경미한 패혈증을 초래한다 9. 경질 CLP(25%, 21 G 1 1/2 바늘로 단일 스루-스루 펑크)를 수행하여 치사패혈증을 유도하여 모델을 표준화하도록 선택하였다(11,12. 셋째, 유체 소생술은 순환 붕괴로 인한 충격 및 신속한 사망을 예방하고 인간 패혈증의 혈역학적 프로파일을 보다 밀접하게모방하는 초동적 동물 패혈증 모델을 개발하는 것이 좋습니다 13. 또한, 부프레노르핀과 같은 진통제의 사용은 실험적이고 윤리적인 관점에서 고려되어야 한다10.
3일 후 CLP는 패혈증의 면역억제 상을 반영하도록 이차 감염을 유도하는 시점으로 선택되었다. 패혈증을 가진 대부분의 환자는 3 일 이상 발생하는 대부분의 죽음을 가진 연장된 병원 과정을 가지고 있고, 많은 사람들은 그 후에 P. aeruginosa14와 더불어 CLP를 가진 최근 연구 결과에서 일관되게 보여주었던 이차 병원 취득한 폐염으로 입력합니다 . 다른 실험실에서 이전 결과는 또한 CLP 후 3 일, 마우스가 이차 주입 박테리아에 높은 민감도를 보여주고, 감염 후 1 일 은 면역 억제에 과민성에서 전환점이었다 는 것을 보여줍니다15, 16.
또한, 박테리아 균주와 투여량의 차이는 이중 모델에서 가변성을 유발하는 중요한 요인이다. 균주 및 투여 량 수준의 선택은 면역 억제 상태 동안 이차 감염의 실험 설계의 요구에 기초한다. 이전 연구 결과에 근거하여, S. 아우레우스의 1 x 107 CFU는 이 연구 결과를 위해 선택되었습니다.
마우스 폐로 직접 비강 내 세균 전달의 효율성을 향상시키기 위해, 주조 볼륨, 시간, 신체 위치에주의를 기울여야한다. 실험 결과에 엄청난 영향을 미칠 수 있는 다른 운영 문제가 있습니다. 이들은 마우스를 똑바로 잡고, 각 주입 도중 두 콧구멍으로 다중 저용량 박테리아 액체를 개별적으로 관리하고, 거품을 형성하지 않고 액체의 흡입을 보고, 흡입의 속도를 통제하는 포함합니다; 마우스를 빠르게 위로 이동한 다음 천천히 아래로 내려가고, 주입에서 회복하기 위해 마우스를 45° 각도로 놓습니다. 비강 내 박테리아 투여는 비침습적이며 질식을 방지하고 접근성을 높이며 안전성을 향상시키고 외과 적 부상을 최소화하는 데 도움이됩니다.
그러나 이 방법에는 한계가 있습니다. 이것은 방법론 적 연구가기므로 임상 징후의 변화에 대한 데이터는 논의되지 않았습니다. 항 염증 성 사이토 카인; 혈액내 단핵구, 호중구 및 림프구의 양과 기능. 실험실 마우스는 수시로 근친상간이고, 유사한 나이 및 무게를 가지고, 특정 병원체 자유로운 시설에 보관되고, 일반적으로 기존 면역 억제와 같은 comorbidities가 없습니다. 그럼에도 불구하고, 다른 성별, 나이, 면역 및 영양 상태, 및 환자의 항생제와 같은 가능한 보조 치료는 이질적인 임상 결과를 초래할 수 있다. 인간 환자의 이질성을 고려하여 나이, 체중, 기존 질병 및 임상 지원 치료와 같은 변수를 주의 깊게 관찰해야합니다.
이 이중 모델 (더블 히트 모델)의 개발은 인간 패혈증의 하이퍼 - 저염증 기에서 진행과 유사하기 때문에 감염 및 면역 연구 커뮤니티에 적시에 중요합니다. 그것은 패혈증을 가진 환자에서 이차 nosocomial 폐렴의 일반적인 임상 시나리오를 보다 정확하게 반영합니다. 이 모형은 패혈증 유도한 면역 억제를 위한 새로운 치료 전략을 개발하는 것을 도울 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 관계의 재정적 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건 원 R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01, AI097532-01A1에서 M.W. 노스 다코타 핵심 시설의 대학은 NIH 보조금에 의해 지원되었다 (INBRE P20GM103442 및 코브레 P20GM113123). 이 작품은 또한 중국 국립 자연 과학 재단의 주요 프로그램에 의해 지원되었다 (81530063) Jianxin 장. 기금 모금자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할을 하지 않았습니다. 우리는 비디오를 만들기위한 마빈 라이어 (농촌 건강 센터, 노스 다코타 대학)에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
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