Summary
Detta protokoll beskriver metoder för att mäta smittsamma resultat underliggande sekundära sjukhusförvärvade infektioner i det immunsuppressiva tillståndet, först genom att etablera cecal ligation/punktering möss sedan utmana dem med intranasal infektion för att att skapa en kliniskt relevant modell av immunsuppression sepsis.
Abstract
Sepsis, en svår och komplicerad livs hotande infektion, kännetecknas av en obalans mellan Pro-och antiinflammatoriska svar i flera organ. Med utvecklingen av terapier överlever de flesta patienter den hyperinflammatoriska fasen men går vidare till en immunosuppressiv fas, vilket ökar uppkomsten av sekundära infektioner. Därför är en ökad förståelse av patogenesen bakom sekundära sjukhusförvärvade infektioner i den immunsuppressiva fasen under sepsis av oerhörd betydelse. Rapporterat här är en modell för att testa smittsamma resultat genom att skapa dubbel-drabbade infektioner hos möss. Ett vanligt kirurgiskt ingrepp används för att inducera polymikrobiell peritonit genom CEKAL ligering och punktering (CLP) och följas av intranasal infektion av Staphylococcus aureus för att simulera pneumoni som förekommer i immunsuppression som ofta ses hos patienter med septisk behandling. Denna dubbla modell kan återspegla det immunsuppressiva tillståndet som uppträder hos patienter med utdragen sepsis och mottaglighet för sekundär infektion från nosokomial lung inflammation. Därför ger denna modell en enkel experimentell metod för att undersöka patofysiologin vid sepsis-inducerad sekundär bakteriell lung inflammation, som kan användas för att upptäcka nya behandlingar för sepsis och dess komplikationer.
Introduction
Sepsis initierar ett komplext samspel mellan Host pro-inflammatoriska och antiinflammatoriska processer och kännetecknas av en hyperinflammatorisk respons och efterföljande immun dysfunktion1,2. Sepsis representerar en global hälso prioritet och orsakar ett stort antal dödsfall i intensiv vårds avdelningar (ICUs)3. Incidensen av sepsis uppskattas överstiga 30 000 000 fall över hela världen per år, med dödligheten så hög som 30% Trots framsteg inom ICU Management4,5. I 2017, Världshälso organisationen antog en resolution för att förbättra förebyggande, diagnos och hantering av denna dödliga sjukdom5. Emellertid, nyare studier har illustrerat att döden inte är följden av primär infektion hos svåra septiska patienter utan snarare från sekundär nosokomial infektion (särskilt lung inflammation) som orsakas av immunsuppression6,7 . Därför, förstå mekanismerna för varför septiska patienter utveckla sekundära infektioner och upptäcka mer effektiva behandlingar är brådskande krävs. Häri, en dubbel modell, även känd som en Double-hit modell, för att studera immunosuppressiv fenomen som förekommer hos patienter med utdragen sepsis beskrivs.
Som Gold Standard experimentell modell i forskning om polymikrobiell sepsis, cecal ligering och punktering (CLP) är en operation som kännetecknas av blind tarmen ligering och perforation, som bidrar till polymikrobiell peritonit och sepsis8,9 . Patofysiologiska processen och cytokin profiler, tillsammans med kinetik och magnitud, liknar klinisk sepsis. Placeringen av ligation, nål storlek som används för punktering, och antalet cecal punkteringar är viktiga faktorer som påverkar dödligheten efter CLP.
Den nosokomiala pneumoni är den vanligaste orsaken till dödlighet bland kritiskt sjuka patienter med sepsis. Den huvudsakliga typen av organismer som orsakar svår sepsis inkluderar Staphylococcus aureus (20,5%), Pseudomonas Species (19,9%), enterobacteriacae (huvudsakligen E. coli, 16,0%) och svampar (19%). Under tiden har nyare studier föreslagit en ökande förekomst av grampositiva organismer, som nu nästan lika vanligt som gramnegativa infektioner3.
Den metod som beskrivs i detta protokoll innebär CLP, som utförs som "första hit" för att inducera subletala polymikrobiell peritonit, som manifesterar en immunsuppression tillstånd. Förfarandet innebär också efterföljande intranasal instillation av S. aureus som "andra träffen" för att ge en kliniskt relevant forsknings plattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här utfördes i enlighet med den nationella Institute of Health Guide för vård och användning av försöks djur och godkänts av University of North Dakota institutionella djur vård och användning kommitté (IACUC).
1. cecal ligering och punktering
Anmärkning: kvinnliga C57BL/6 möss (vikt, 18-22 g; ålder, 6-8 veckor) är slumpmässigt indelade i sex grupper: kontroll grupp (Ctrl), infektions grupp (SA för S. aureus), två simulerade grupper, och två CLP grupper. CTRL djur lämnas utan kirurgi och sekundära infektions skador. SA-djur utsätts för lung infektion i S. aureus utan operationen. Simulerade djur genomgår samma laparotomi med en utläggning av blind tarmen (utom blind tarmen är varken liga turer eller punkteras). Åtta möss per grupp används för överlevnads analys, och tre till fem möss används för bedömning av inflammation vid olika tidpunkter.
- Före operationen sterilisera alla kirurgiska instrument och material genom autoklavering i 20 min. Rengör och desinficera Operations bordet med desinfektions torkar. För att fastställa sterila förhållanden under operationen, täcka hela operativa fält med rätt sterila kirurgiska Draper, och bära ett hårlock, kirurgisk mask, skyddande glasögon, kirurgisk klänning, och sterila handskar.
- Väg och söva musen med 0,1 ml/mus av Ketamin (80 mg/kg), xylazin (10 mg/kg) blandning intraperitonealt administreras. Med tummen och pekfingret på vänster hand bildar en U-formad position, närma nacken av musen bakifrån smidigt och försiktigt, håll sedan halsen omedelbart bakom öronen så att mus huvudet är mycket återhållsam. Använd en Pinky att hålla musens högra rygg benet och använda mitten och ring fingrar (alla fingrar från vänster hand) för att hålla kroppen.
- Kontrol lera intensiteten av anestesi med tå nypa tills ingen flexion av extremiteten.
- Raka nedre kvadranter i buken med en elektrisk rakhyvel och desinficera området med jod.
- Placera musen på den sterila ytan i en liggande position, med huvudet riktat bort från operatören. Drapera musen med steril handduk med hål över den planerade kirurgiska snittet för att bibehålla sterila fält.
- Gör en längsgående hudsnitt (ca 0,5 cm lång) med en skalpell i vänster nedre delen av buken. Använd små saxar för att förlänga snittet (1-2 cm).
FÖRSIKTIGHET: var försiktig så att du inte tränger in i peritonealhålan. - Gör intramuskulär snitt för att få till gång till peritonealkaviteten och tillåta exponering av blind tarmen med angränsande tarm.
- Isolera blind tarmen på vänster sida av buken (i de flesta fall, detta görs genom att använda trubbiga anatomiska pincett) och ta bort den på en steril drapera, lämnar de små och stora tarmarna i peritonealhålan.
Var försiktig: Undvik att skada de mesenteriska blod kärlen. - Ligate blind tarmen vid distala 25% position för att skapa en långvarig infektion med relativt låg dödlighet.
Försiktighet: se till att inte ligera den Ileocecal ventilen. - Perforera blind tarmen med en 21 G 1 1/2 nål genom enkel genom-och-genom punktering (två hål) halvvägs mellan ligering och spetsen av blind tarmen på minst vascularized området.
Var försiktig: se till att inte punktera blod kärlen. - Ta bort injektionsnålen. Försiktigt extrudera en liten mängd avföring från penetrationshålen för att säkerställa full tjocklek perforering.
Varning: var noga med att inte hindra tarm kontinuiteten under ingreppet. - Byt ut blind tarmen i bukhålan.
- Stäng buken i två lager med 4-0 nylon kirurgiska suturer. Stäng buk mus kula turen genom att applicera enkla löpsuturer och stäng huden genom att applicera enkla, avbrutna suturer. Rengör huden med jod.
- Injicera 1 ml föruppvärmd (37 ° c) 0,9% steril normal saltlösning (NS) lösningen på bak sidan subkutant för att ersätta tredje utrymme förlust och placera den på en varm pad för att återhämta sig.
- Returnera möss i bur i ett temperaturkontrollerat rum (22 ° c) med 12 h ljus/mörker-cykler och fri till gång till mat och vatten. Övervaka möss varje 0,5 timmar för minst 2 h, sedan varje 6 h för minst 2 d, sedan varje 12 h för 3 dagar, eller euthanize dem när döende för överlevnad analys.
Anmärkning: pre-och postoperativ analgesi (buprenorfin, 50 μg/kg subkutant var 12: e timme) rekommenderas för 24 timmar före operationen till 48 h efter operationen9,10.
2. sekundär lung infektion med S. aureus
Obs: förutom för CTRL-och SA-grupperna bör överlevande möss vid 3 dagar efter CLP i simulerade och CLP-grupper administreras intranasalt med 30 μL av en bakterie SUS pension eller NS, respektive. De överlevande möss i SA-gruppen bör ingjutas intranasalt med bakterie SUS pensionen.
- Anesthetize musen genom intraperitonealt Injicera 100 μL lösning av Ketamin (45mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) och vänta tills musen andas långsamt. Den punktuell vinkeln mellan nålen och buk väggen är mindre än 30 ° för långsam injektion.
- Med hjälp av en mikropipett, långsamt och intranasalt ingjuta med 30 μL 1 x 107 kolonibildande enhet (CFU) av S. aureus som aspireras vid inandning. Håll musen vid öronen i upprätt läge och tappa långsamt 2-3 μL av bakterie SUS pensionen i båda näsborrarna varje gång. Justera hastigheten för frisättning så att musen att andas in utan att bilda bubblor och släppa av.
- Höj musen upp och ner, med huvudet upp och svansen ner, för att hjälpa bakterierna in i luft strupen. Flytta musen upp snabbt och starkt, medan du flyttar den försiktigt och långsamt för att öka gravitationen. Upprepa instillation ca 15x tills alla bakterier inhaleras, vilket bör ta 10-15 min för varje mus.
- Lägg musen på ryggen och huvudet upp på den vinklade sängkläder (ca 35 °) och titta på musen tills dess andning återgår till det normala och det är helt återhämtat sig från anestesi och procedurer.
- Placera musen tillbaka i buren i ett temperaturkontrollerat rum (22 ° c) med 12 h ljus/mörker-cykler och obegränsad till gång till mat och vatten.
- Kontrol lera mus förhållandena var 2 h för den första dagen och var 12 h efteråt i 4 dagar efter operationen. Euthanize dem när döende för överlevnad analys eller 24 h efter infektion för bedömning av inflammation.
3. analyserade parametrar
- Möss överlevnad
- Övervaka mössen i 7 dagar. Euthanize när döende och generera överlevnads kurvor med Kaplan-Meier metoder11.
- Bakterie räkning
- 24 timmar efter SA-injektionen, skörda blodet, bronkoalveolär lavagevätska (BALF) och peritoneallavagevätska (PLF) från mössen. Tillsätt därefter 100 μl av spädnings vätskan till näringsämnes agarplattor och odla dem vid 37 ° c i 24 timmar för att bestämma bakteriekoloniernas antal11,12,13.
- Cytokiner
Observera: proinflammatoriska cytokinkoncentrationer av IL-1 β, IL-6 och TNFα i serum och BALF från möss bör bedömas med hjälp av ELISA-kit enligt tillverkarens anvisningar.- Coat den 96 väl ELISA plattan med 100 μL/brunn av olika Capture anti kropp arbets lösning för att köra normerna i två exemplar och prover i tre exemplar. Försegla plattan och lämna den över natten vid 4 ° c.
- Tvätta plattan tre gånger med 255 μL/brunn tvättbuffert (1x PBS, 0,05% Tween-20).
- För att blockera icke-specifik bindning, tillsätt 200 μL/brunn spädnings vätska. Försegla plattan och inkubera vid rums temperatur (RT) i 1 h.
- Förbered standardlösning: 8 2-faldigt seriella utspädningar från 1000 PG/mL.
- Tillsätt 100 μL/brunn av standarder eller prover till lämpliga brunnar och 100 μL/brunn av spädnings vätska till de tomma brunnarna. Försegla plattan och inkubera vid RT för 2 h eller över natten vid 4 ° c.
- Tvätta plattan 5x med 255 μL/brunn tvättbuffert.
- Tillsätt 100 μL/brunn av olika detekterings anti kropps arbets lösning till lämpliga brunnar. Försegla plattan och inkubera vid RT för 1 h.
- Tvätta plattan 5x med 255 μL/brunn tvättbuffert.
- Tillsätt 100 μL/brunn av utspädd HRP lösning till alla brunnar. Försegla plattan och inkubera vid RT i 30 min.
- Tvätta plattan 5x med 255 μL/brunn tvättbuffert.
- Tillsätt 100 μL/väl utspädd TMB lösning. Inkubera plattan bort från ljus vid RT i 15 min.
- Tillsätt 50 μL/brunn stopp lösning (1 M H3Po4). Läs absorbans vid 450 Nm med en Plattläsare.
- Flödescytometri
- Hämta det totala antalet celler från BALF. Lyse erytrocyter med hjälp av ACK lyseringslösning buffert och tvätta 2x med PBS.
- Analysera sedan Single-cell SUS pensioner av flödescytometri som tidigare beskrivits11. För ytfärgning, fläck-neutrofiler (CD11b + GR-1 +) med APC anti-Mouse CD11b och anti-Mouse gr-1 (ly-6G/ly-6C) anti kroppar. Samla in minst 3 x 104 levande, icke-fragment celler för analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beroende på experimentell design och procedurer utsattes C57BL/6-möss för CLP, och efter 3 dagar administrerades de bakterier intranasalt (figur 1). Som framgår av figur 2, började mössen att dö vid ~ 12 timmar efter induktion av peritonit. Två möss i CLP + SA-gruppen och tre möss i CLP + NS-gruppen avled före intranasal S. aureus instillation. Ingen dödlighet upptäcktes hos icke-infekterade möss med eller utan simulerad drift. Därför, när möss hade CLP före lung inflammation, var dödligheten mycket högre (p < 0,05). Efter en intranasal bakterie utmaning (1 x 107 CFU) överlevde tre av åtta möss i både sa-och Sham + sa-grupperna, och fyra av åtta möss ÖVERLEVDE i CLP + ns-gruppen. Alla åtta möss dog dock i CLP + SA-gruppen. Däremot överlevde varje mus i gruppen CTRL och Sham + NS. CLP-möss visade mer dödlighet när de senare utmanades med S. aureus. Mortalitet av S. aureus efter CLP (100%) var högre än enbart infekterad (37,5%) eller S. aureus efter simulerad drift (37,5%, p < 0,05).
Såsom visas i figur 3, observerades svår kaecum-nekros hos djur efter CLP, men mer från dubbel träff gruppen (CLP + sa). Det fanns dock ingen brutto förändring av blind tarmen i kontroll eller Single-hit med bakterie grupper. Blod, BALF, och PLF var odlade för att bedöma lung bakteriell clearance av möss infekterade med S. aureus 3 dagar efter CLP. Denna höga dödlighet var förknippad med signifikant ökad S. aureus CFU i blodet och PLF av CLP möss jämfört med simulerade möss (p < 0,05; Figur 4a,C). Antalet S. aureus CFU i blodet och Balf för CLP + sa-möss var markant större än CLP + ns-möss (p < 0,01; Figur 4a,B).
För proinflammatoriska cytokiner visade resultaten att uttrycks nivåerna av serum IL-1 β, IL-6 och TNFα ökade signifikant vid 24 timmar efter bakteriell instillation hos sepsis-överlevande möss jämfört med möss som genomgick CLP ensamt eller till den simulerade möss utmanas med S. aureus (figur 5a). Emellertid, de pro-inflammatoriska cytokiner ökade något i BALF av septiska möss med sekundär infektion, skiljer sig från de i kontrollinfekterade möss (SA möss) och Sham + SA. Samtidigt uppvisade dubbeldrabbade möss signifikant sänkta nivåer i BALF IL-1 β-, IL-6-och TNFα-nivåer jämfört med både SA-och Sham + SA-möss (p < 0,001; Figur 5b).
Som framgår av figur 6, möss offrades vid 24 h efter infektion, och relativa neutrofila procent i Balf upptäcktes av flödescytometri. Dubbeldrabbade möss uppvisade en signifikant reduktion av neutrofiler i BALF jämfört med möss som genomgick enbart S. aureus -pneumoni. Sammantaget visade dessa data att CLP försämrar värdens immun svar, vilket resulterar i ökad känslighet för sekundär bakteriell lung inflammation.
Figur 1 : Experimentell design. Möss delades slumpmässigt in i sex grupper. Två grupper genomgick CEKAL ligering och punktering (CLP) vid D0, och de andra var simulerade eller inte fungerade. Tre dagar efter operationen (D3) administrerades S. aureus [sa, 1 x 107 KOLONIBILDANDE enheter (CFU)] eller normal saltlösning (NS) intranasalt. Kontroll gruppen (Ctrl) möss var inte intranasalt instillade. Blod, bronkoalveolär lavagevätska (BALF) och peritoneallavagevätska (PLF) skördades 24 timmar efter SA-injektion för en bakterie räkning analys. Dödligheten i varje grupp observerades under loppet av 7 dagar för överlevnad analys. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Mus överlevnad. C57BL/6 möss som lämnades in till antingen CLP eller simulerad kirurgi fick S. aureus (sa) eller normal SALTLÖSNING (NS) den tredje dagen efter operationen (n = 8 möss per grupp). Mössen övervakades i 7 dagar och dödligheten registrerades var 12: e timme. Kaplan-Meier överlevnads kurvor, log-Rank Test (* p < 0,05) jämfört med Sham + SA-möss och SA-möss. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Mus avskum. Sekundär infektion induceras 3 dagar efter CLP. 24 timmar efter SA-infektion, var möss offrades för att samla kolon vävnader. De representativa fotona av cecal ligering under olik skada hit visas. SA = S. aureus; Ns = normal saltlösning; CLP = CEKAL ligering och punktering. Skalbar = 1 cm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Bakterie räkning och representativa bilder av agarplattor. 3 dagar efter operationen var möss intranasalt instillade med 1 x 107 CFU av S. aureus (sa) (n ≥ 3 möss per grupp). Blod, BALF, och PLF skördades 24 h efter SA injektion, och bakterier kolonier räknas bestämdes efter 24 h inkubation. Resultaten uttrycks som medelvärde ± SEM. enkelriktad ANOVA (Tukey ' s post hoc, * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; NS = inte signifikant). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Elisa detekterar cytokin-sekretion. Sekundär infektion induceras 3 dagar efter CLP. Koncentrationerna av IL-1 β, IL-6 och TNFα i serum (a) och Balf (b) från möss efter sa-infektion (n ≥ 3 möss per grupp). Data presenteras som medelvärdet ± SEM för tre experiment. Enkelriktad ANOVA (Tukey ' s post hoc, * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * * p < 0,0001; NS = inte signifikant). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Representativ frekvens av neutrofilpenetration. 24 timmar efter intranasal infektion offrades möss för att erhålla BALF (n ≥ 3 möss per grupp). Procent andelen neutrofiler (CD11b+, gr-1+) kvantifierades genom flödescytometri och visas som medel ± SEM av tre experiment. Enkelriktad ANOVA (Tukey ' s post hoc, * * * * p < 0,0001; NS = inte signifikant). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som guldmynt standard modell för sepsis forskning, CLP har en kombination av tre förolämpningar, inklusive vävnads trauma orsakad av laparotomi, nekros på grund av ligering av blind tarmen, och infektion till följd av mikrobiellt läckage som orsakar peritonit med translokationen av bakterier i blod8. Därför efterliknar CLP komplexiteten i mänsklig sepsis bättre än många andra modeller. Emellertid, en stor begränsning av nuvarande CLP-modellen är oförmågan att återspegla den mer långvarig fas av sepsis ses hos patienter i ICU3,4,5. Därför föreslogs en kliniskt relevant dubbel modell (dubbel träff modell) för att återspegla fördröjd dödlighet av sepsis och undersöka mekanismerna bakom pulmonell sekundär infektion. I detta protokoll inducerade sepsis genom att kombinera CLP med S. aureus lung infektion vid 3 dagar efter CLP. Två-hit möss uppvisade högre dödlighet, svår blind tarmen skador, försvagat blod, BALF bakterier klare ringar, lägre pro-inflammatoriska cytokiner, och lägre neutrofiler i BALF. Detta resulterade i svår sepsis, som härmar immunsuppression status i klinikerna.
Följande beskrivningar är kritiska steg. Visas i detalj är hur man producerar subletala sepsis under samma förhållanden. Först användes honmöss eftersom honmöss är mer motstånds kraftiga mot CLP än hanmöss11. För det andra, CLP-inducerad dödlighet beror på flera tekniska parametrar, såsom längden på blind tarmen ligated, nål storlek, och antalet cecal punkteringar9. Ligering av cirka 75% av blind tarmen inducerar svår sepsis, ligering av 60% av blind tarmen inducerar medelnivå sepsis, och ligering av 25% eller mindre av blind tarmen resultat i mindre sepsis9. Det valdes att standardisera modellen genom att utföra en mild CLP (25%, enkel genom-och-genom punktering med en 21 G 1 1/2 nål) för att inducera subletala sepsis11,12. För det tredje, vätska återupplivning rekommenderas för att förhindra chock och snabb död på grund av cirkulation kollaps och utveckla en hyperdynamisk djur sepsis modell, som närmare imiterar hemodynamisk profil av mänsklig sepsis13. Dessutom bör användning av analgetika, såsom buprenorfin, övervägas från en experimentell och etisk synvinkel10.
Tre dagar efter CLP valdes som en tidpunkt för att inducera sekundär infektion för att återspegla den immunosuppressiva fasen av sepsis. De flesta patienter med sepsis har en utdragen sjukhus kurs med de flesta dödsfall som inträffar efter 3 dagar, och många sedan in i sekundära sjukhusförvärvad lung inflammation, som konsekvent visades i en nyligen genomförda studie med CLP tillsammans med P. aeruginosa14 . Tidigare resultat från andra laboratorier visar också att 3 dagar efter CLP, möss visar hög känslighet för sekundära ingjutit bakterier, och en dag efter infektion var vänd punkten från över-inflammation till immunsuppression15, och 16.
Dessutom, skillnader i bakterie stammar och dosering ingjutit är betydande faktorer som orsakar variation i den dubbla modellen. Valet av stam-och DOS nivåer baseras på behoven hos experimentell design av sekundär infektion under immunosuppressiv status. Baserat på tidigare fynd, 1 x 107 CFU av S. aureus valdes för denna studie.
För att förbättra effektiviteten av intranasal bakteriell leverans direkt i musens lungor, bör uppmärksamhet ägnas åt instillation volym, tid, och kroppens position. Det finns andra operativa frågor som kan oerhört påverka resultatet av experimentet. Dessa inkluderar hålla musen upprätt, administrera flera lågdos bakterier vätska i båda näsborrarna separat under varje instillation, titta på inandning av vätska utan att bilda bubblor, kontrol lera hastigheten av inandning; flytta musen upp snabbt sedan ner långsamt, och om musen på en 45 ° vinkel att återhämta sig från instillation. Intranasal bakterie administrering är noninvasiv och hjälper till att förhindra kvävning, öka tillgängligheten, förbättra säkerheten och minimera kirurgiska skador.
Denna metod har dock sina begränsningar. Eftersom detta är en metodologisk studie, har data inte diskuterats om förändringar av kliniska tecken; antiinflammatoriska cytokiner; och antal och funktion av monocyter, neutrofiler och lymfocyter i blodet. Laboratorie möss är ofta inavlade, har liknande åldrar och vikter, är inrymt i specifika patogen-fria anläggningar, och ofta inte har sjukdoms tillstånd, såsom redan existerande immunsuppression. Ändå, olika kön, ålder, immun och näringsmässiga status, och eventuell adjuvant behandling såsom antibiotika av patienter kan resultera i heterogena kliniska resultat. Med tanke på heterogenitet hos människa patienter, variabler såsom ålder, vikt, redan existerande sjukdomar, och klinisk stödjande vård bör noga övervakas.
Utvecklingen av denna dubbla modell (dubbel-hit modell) är lägligt och viktigt för infektion och immunitet forsknings samfundet eftersom det liknar utvecklingen från Hyper-till Hypo-inflammatorisk fas av mänsklig sepsis. Det återspeglar det gemensamma kliniska scenariot för en sekundär nosokomial pneumoni hos patienter med sepsis mer exakt. Denna modell kan bidra till att utveckla nya terapeutiska strategier för sepsis-inducerad immunsuppression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga ekonomiska intresse konflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av nationella institut för hälso-och sjukvårds bidrag r01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01, och AI097532-01A1 till M. W. University of North Dakota Core faciliteter stöddes av NIH bidrag (INBRE P20GM103442 och COBRE P20GM113123). Detta arbete stöddes också av det centrala programmet för National Nature Science Foundation i Kina (81530063) till Jianxin Jiang. Finansiär hade ingen roll i studie design, data insamling och analys, beslut att offentliggöra, eller förberedelse av manuskriptet. Vi tackar Marvin Leier (centrum för landsbygdens hälsa, University of North Dakota) för att göra videon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Delano, M. J., Ward, P. A. The immune system's role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome. Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).
- Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C.
- Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
- Reinhart, K., et al. Recognizing Sepsis as a Global Health Priority - A WHO Resolution. The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
- Boomer, J. S., et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure. JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).
- Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis? Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34 (3), 250-260 (2010).
- He, S., et al. Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice. PLoS Pathogens. 12 (7), 23 (2016).
- Pu, Q. Q., et al. Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis. Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).
- Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).
- Chin, W., et al. A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset. Nature Communications. 9 (1), 917 (2018).
- Nascimento, D. C., et al. IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population. Nature Communications. 8, 14919 (2017).
- Deng, D., et al. Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics. International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).
