Summary
Denne protokollen beskriver teknikker for å måle smittsomme utfall underliggende sekundære sykehus-ervervet infeksjoner i immunsuppressiv tilstand, først ved å etablere cecal ligation/punktering mus deretter utfordre dem med intranasal infeksjon til opprette en klinisk relevant modell av immunsuppresjon sepsis.
Abstract
Sepsis, en alvorlig og komplisert livstruende infeksjon, er preget av en ubalanse mellom Pro-og anti-inflammatorisk respons i flere organer. Med utviklingen av terapier, de fleste pasienter overlever hyperinflammatory fasen, men fremgangen til en immunsuppressiv fase, noe som øker fremveksten av sekundære infeksjoner. Derfor, forbedret forståelse av patogenesen underliggende sekundære sykehus-ervervet infeksjoner i immunsuppressiv fasen under sepsis er av enorm betydning. Rapportert her er en modell for å teste smittsomme utfall ved å opprette dobbel-hit infeksjoner i mus. En standard kirurgisk prosedyre brukes til å indusere polymikrobielle peritonitt ved cecal ligation og punktering (CLP) og etterfulgt av intranasal infeksjon av Staphylococcus aureus for å simulere lungebetennelse forekommende i immunforsvaret undertrykkelse som ofte sett i pasienter med Denne doble modellen kan gjenspeile immunsuppressiv tilstand forekommer hos pasienter med langvarig sepsis og mottakelighet for sekundær infeksjon fra nosocomial lungebetennelse. Derfor gir denne modellen en enkel eksperimentell tilnærming for å undersøke patofysiologi av sepsis-indusert sekundær bakteriell lungebetennelse, som kan brukes til å oppdage romanen behandlinger for sepsis og dens komplikasjoner.
Introduction
Sepsis initierer et komplekst samspill av Host Pro-inflammatorisk og anti-inflammatoriske prosesser og er preget av en hyperinflammatory respons og påfølgende immune dysfunksjon1,2. Sepsis representerer en global helse prioritet og forårsaker et høyt antall dødsfall i intensivavdelinger (intensivavdelinger)3. Forekomsten av sepsis anslås å overstige 30 000 000 tilfeller over hele verden per år, med dødelighet så høyt som 30% til tross for fremskritt i ICU Management4,5. I 2017 vedtok verdenshelseorganisasjon en resolusjon for å forbedre forebygging, diagnostisering og forvaltning av denne dødelige sykdommen5. Men, nyere studier har illustrert at døden ikke skyldes primær infeksjon i alvorlig under-pasienter, men heller fra sekundær nosocomial infeksjon (spesielt lungebetennelse) som forårsaket av immunsuppresjon6,7 . Derfor, forstå mekanismene for hvorfor pasienter utvikle sekundær infeksjon og oppdage mer effektive behandlinger er presserende behov. Heri, en dobbel modell, også kjent som en dobbel-hit-modell, for å studere immunsuppressiv fenomenet forekommer hos pasienter med langvarig sepsis er beskrevet.
Som gull standard eksperimentell modell i forskning på polymikrobielle sepsis, cecal ligation og punktering (CLP) er en kirurgi preget av cecum ligation og perforering, som bidrar til polymikrobielle peritonitt og sepsis8,9 . Patofysiologiske prosessen og cytokin profiler, sammen med Kinetics og størrelsesorden, ligner klinisk sepsis. Ligation posisjon, nåle størrelse brukt til punktering og antall cecal hull er viktige faktorer som påvirker dødeligheten etter CLP.
Den nosocomial lungebetennelse er den ledende årsaken til dødelighet blant kritisk syke pasienter med sepsis. De viktigste type organismer forårsaker alvorlig sepsis inkluderer Staphylococcus aureus (20,5%), Pseudomonas arter (19,9%), Enterobacteriacae (hovedsakelig E. coli, 16,0%), og sopp (19%). I mellomtiden har nyere studier antydet en økende forekomst av gram-positive organismer, som nå er nesten like vanlig som gram-negative infeksjoner3.
Metoden beskrevet i denne protokollen involverer CLP, utført som "første treffet" for å indusere subletale polymikrobielle peritonitt, som manifesterer en immunsuppresjon tilstand. Prosedyren innebærer også påfølgende intranasal drypping av S. aureus som "Second hit" for å gi en klinisk relevant forskning plattform.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her ble utført i samsvar med National Institute of Health guide for omsorg og bruk av laboratorium dyr og godkjent av University of North Dakota institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).
1. Cecal ligation og punktering
Merk: kvinnelige C57BL/6-mus (vekt, 18-22 g; alder, 6-8 uker) er tilfeldig delt inn i seks grupper: kontrollgruppe (Ctrl), infeksjons gruppe (SA for S. aureus), to humbug grupper og to CLP-grupper. CTRL dyrene er igjen uten kirurgi og sekundær infeksjon skadene. SA dyr er utsatt for S. aureus lungeinfeksjon uten bruk. Humbug-opererte dyr gjennomgår samme laparotomy med en utredning av cecum (bortsett fra cecum er verken ligaturer eller punktert). Åtte mus per gruppe brukes til overlevelse analyse, og tre til fem mus brukes til vurdering av betennelse ved ulike tidspunkter.
- Før operasjonen steriliseres alle kirurgiske instrumenter og materialer ved autoklavering i 20 min. Rengjør og desinfisere drifts bordet med desinfiserende kluter. For å etablere sterile tilstander under operasjonen, dekker hele operative felt med riktig sterile kirurgiske forheng, og bære et hår deksel, kirurgisk maske, vernebriller, kirurgisk kappe, og sterile hansker.
- Veie og bedøve musen med 0,1 mL/mus av ketamin (80 mg/kg), xylazine (10 mg/kg) blanding intraperitonealt administrert. Med tommelen og pekefingeren på venstre hånd danner en U-formet posisjon, tilnærming nakken av musen bakfra jevnt og forsiktig, og deretter holde halsen rett bak ørene slik at musen hodet er svært behersket. Bruk en pinky å holde musen rett tilbake beinet og bruke midten og ring fingrene (alle fingre fra venstre hånd) for å holde kroppen.
- Kontroller intensiteten av anestesi ved tå klemme til ingen fleksjon av ytterste.
- Barbere nedre kvadranter av magen ved hjelp av en elektrisk barberhøvel og desinfisere området med jod.
- Plasser musen på den sterile overflaten i en liggende posisjon, med hodet orientert bort fra operatøren. Gardin musen med sterilt håndkle med hull over den planlagte kirurgisk snitt for å opprettholde sterile felt.
- Lag en langsgående hud snitt (ca 0,5 cm lang) med en skalpell i venstre nedre del av magen. Bruk små saks for å forlenge snittet (1-2 cm).
FORSIKTIG: Pass på at du ikke trenger å trenge gjennom bukhulen. - Gjør intramuskulær snitt for å få tilgang til bukhulen og tillate eksponering av cecum med tilstøtende tarmen.
- Isoler cecum på venstre side av magen (i de fleste tilfeller er dette gjort ved hjelp av Butt anatomisk tang) og fjerne den på en steril gardin, slik at små og store tarmen i bukhulen.
FORSIKTIG: unngå å skade de chrezbryzheechno blodkarene. - Ombinde cecum ved den nedre 25%-posisjonen for å skape en langvarig infeksjon med relativt lav dødelighet.
FORSIKTIG: Pass på at du ikke ombinde ileocecal ventilen. - Perforere cecum med en 21 G 1 1/2 nål ved enkel gjennom-og-gjennom punktering (to hull) midt mellom ligation og spissen av cecum på det minst vascularized området.
FORSIKTIG: Pass på at blodkarene ikke punktering. - Fjern nålen. Forsiktig extrude en liten mengde avføring fra penetrasjon hullene for å sikre full tykkelse perforering.
FORSIKTIG: Pass på at du ikke hindrer tarm kontinuitet under prosedyren. - Sett cecum inn i bukhulen.
- Lukk magen i to lag med 4-0 nylon kirurgiske sting. Lukk abdominal muskulaturen ved å bruke enkle kjører sting og lukke huden ved å bruke enkle avbrutte sting. Rengjør huden med jod.
- Injiser 1 mL prewarmed (37 ° c) 0,9% steril normal saltvann (NS) løsning på baksiden subkutant å erstatte tredje plass tap og plassere den på en varm pad for å gjenopprette.
- Returner musene i buret i et temperatur kontrollert rom (22 ° c) med 12 h lys/mørke sykluser og fri tilgang til mat og vann. Overvåk mus hver 0,5 time i minst 2 timer, deretter hver 6 h i minst 2 d, deretter hver 12 h for 3 dager, eller euthanize dem når døende for overlevelse analyse.
Merk: pre-og post-operative analgesi (buprenorfin, 50 μg/kg subkutant hver 12 h) anbefales for 24 timer før operasjonen til 48 h etter operasjonen9,10.
2. sekundær lungeinfeksjon med S. aureus
Merk: med unntak av Ctrl-og SA-gruppene bør overlevende mus på 3 dager etter CLP i humbug-og CLP-gruppene administreres intranasalt med 30 μL av en bakteriell suspensjon eller NS, henholdsvis. De overlevende musene i SA-gruppen bør være innpodet intranasalt med bakteriell suspensjon.
- Bedøve musen ved å intraperitonealt sprøyte 100 μL oppløsning av ketamin (45mg/kg) og xylazine (10 mg/kg) og vent til musen åndedrag langsomt. Punktering vinkelen mellom nålen og bukveggen er mindre enn 30 ° for langsom injeksjon.
- Med hjelp av en micropipette, langsomt og intranasalt innpode med 30 μL av 1 x 107 koloni forming enhet (CFU) av S. aureus å bli pustende ved innånding. Hold musen ved ørene i oppreist stilling, sakte slipp 2-3 μL av bakteriell suspensjon i begge neseborene hver gang. Juster hastigheten på utgivelsen slik at musen til å inhalere uten å danne bobler og slippe av.
- Hev musen opp og ned, med hodet opp og halen ned, for å hjelpe bakteriene inn i luftrøret. Beveg musen raskt og sterkt, mens du flytter den forsiktig ned og sakte for å øke tyngdekraften. Gjenta drypping ca 10-15 til alle bakteriene er inhalert, noe som bør ta min for hver mus.
- Lay musa på ryggen og hodet opp på vinklet sengetøy (ca 35 °) og se på musen til den puster tilbake til det normale, og det er helt utvinnes fra anestesi og prosedyrer.
- Plasser musen tilbake i buret i et temperatur kontrollert rom (22 ° c) med 12 h lys/mørke sykluser og ubegrenset tilgang til mat og vann.
- Sjekk muse forhold hver 2 h for den første dagen og hver 12 h etterpå for 4 dager etter operasjonen. Euthanize dem når døende for overlevelse analyse eller 24 h etter smitte for vurdering av betennelse.
3. analyserte parametre
- Mus overlevelse
- Overvåk musene i 7 dager. Euthanize når døende og generere overlevelse kurver bruker Kaplan-Meier metoder11.
- Bakteriell teller
- 24 h etter SA injeksjon, høste blodet, lunges tømming væske (BALF), og bukhulen væske (PLF) fra mus. Deretter legger 100 μL av fortynningsmidler til næringsstoffer agar plater og kultur dem ved 37 ° c for 24 h å bestemme bakteriell koloni teller11,12,13.
- Cytokiner
Merk: Pro-inflammatoriske cytokin konsentrasjoner av IL-1β, IL-6, og TNFα i serum og BALF fra mus bør vurderes ved hjelp av ELISA kits i henhold til produsentens instruksjoner.- Coat 96 godt ELISA plate med 100 μL/brønn av forskjellig fangst antistoff arbeider løsning for å kjøre standarder i duplikat og prøver i tre eksemplarer. Forsegle platen og la den over natten ved 4 ° c.
- Vask platen tre ganger med 255 μL/brønn vaskebuffer (1x PBS, 0,05% mellom-20).
- Legg til 200 μL/brønn fortynningsmiddel for å blokkere ikke-spesifikk binding. Forsegle platen og ruge ved romtemperatur (RT) for 1 time.
- Forbered standard løsning: 8 2-fold seriell fortynninger fra 1000 PG/mL.
- Tilsett 100 μL/brønn av standarder eller prøver til de aktuelle brønnene og 100 μL/brønn av fortynningsvæske til blanke brønner. Forsegle platen og ruge ved RT for 2 timer eller over natten ved 4 ° c.
- Vask platen 5x med 255 μL/brønn vaskebuffer.
- Tilsett 100 μL/brønn av forskjellig deteksjon antistoff arbeids løsning til de aktuelle brønnene. Forsegle platen og ruge ved RT for 1 t.
- Vask platen 5x med 255 μL/brønn vaskebuffer.
- Tilsett 100 μL/brønn av fortynnet HRP-løsning for alle brønner. Forsegle platen og ruge ved RT i 30 min.
- Vask platen 5x med 255 μL/brønn vaskebuffer.
- Tilsett 100 μL/godt fortynnet TMB-løsning. Ruge platen vekk fra lys ved RT i 15 minutter.
- Tilsett 50 μL/brønn stopp løsning (1 M H3PO4). Les absorbansen på 450 nm med en plate leser.
- Flow-flowcytometri
- Få det totale antallet celler fra BALF. Lyse erytrocytter ved hjelp av ACK lysering buffer og vask 2x med PBS.
- Analyser deretter enkelt celle suspensjoner av Flow flowcytometri som tidligere beskrevet11. For overflate farging, stain nøytrofile (CD11b + GR-1 +) med APC anti-mus CD11b og anti-mus gr-1 (ly-6G/ly-6C) antistoffer. Samle minimum 3 x 104 Live, ikke-avfall celler for analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Avhengig av eksperimentell design og prosedyrer ble C57BL/6-mus utsatt for CLP, og etter 3 dager ble de administrert bakterie intranasalt (figur 1). Som vist i figur 2, begynte musene å dø ved ~ 12 h etter induksjon av peritonitt. To mus i CLP + SA-gruppen og tre mus i CLP + NS-gruppen døde før intranasal S. aureus drypping. Ingen dødelighet ble påvist hos mus som ikke er infisert av andre enn eller humbug. Derfor, når mus hadde CLP før lungebetennelse, var dødeligheten mye høyere (p < 0,05). Etter intranasal bakterier utfordring (1 x 107 CFU), tre av åtte mus overlevde i både sa og SHAM + sa grupper, og fire av åtte mus OVERLEVDE i CLP + NS gruppen. Alle åtte mus døde imidlertid i CLP + SA-gruppen. I kontrast, hver mus i CTRL-gruppen og Sham + NS gruppen overlevde. CLP-mus viste mer dødelighet da de senere ble utfordret av S. aureus. Dødelighet av S. aureus etter CLP (100%) var høyere enn smittet alene (37,5%) eller S. aureus etter humbug-opererte (37,5%; p < 0,05).
Som vist i Figur 3, ble alvorlig blindtarmen nekrose observert i post-CLP-dyr, men mer fra Double-hit-gruppen (CLP + sa). Men det var ingen brutto endring av cecum i kontroll eller single-hit med bakterie grupper. Blood, BALF, og PLF var kultivert å vurdere lunge bakteriell clearance av mus smittet med S. aureus 3 dager etter CLP. Denne høye dødeligheten ble assosiert med betydelig økt S. aureus CFU i BLODET og plf av CLP-mus sammenlignet med humbug mus (p < 0,05; Figur 4a,C). Antall S. aureus CFU i BLODET og BALF av CLP + sa-mus var markant større enn CLP + NS-mus (p < 0,01; Figur 4a,B).
For Pro-inflammatorisk cytokiner, resultatene viste at uttrykket nivåer av serum IL-1β, IL-6, og TNFα betydelig økt ved 24 h etter bakteriell drypping i sepsis-overlevende mus sammenlignet med musene som gjennomgikk CLP alene eller til humbug-opererte mus utfordret med S. aureus (figur 5a). Men den Pro-inflammatorisk cytokiner økt litt i BALF av andre mus med sekundær infeksjon, forskjellig fra de i kontroll-infiserte mus (SA mus) og Sham + SA. I mens, dobbel-finne mus forevise viktig avtatt høyder inne BALF IL-1β, IL-6, og TNFα høyder sammenlignet med begge to SA og humbug + SA mus (pencen < 0,001; Figur 5B).
Som vist i figur 6, ble mus ofret ved 24 h etter smitte, og relativ nøytrofile prosent i BALF ble oppdaget av Flow flowcytometri. Dobbel-hit mus utstilt en betydelig reduksjon av nøytrofile i BALF sammenlignet med mus som gjennomgikk S. aureus lungebetennelse alene. Samlet sett viste disse dataene at CLP svekker verts immunresponsen, noe som resulterte i økt mottakelighet for sekundær bakteriell lungebetennelse.
Figur 1 : Eksperimentell design. Mus ble tilfeldig delt inn i seks grupper. To grupper gjennomgikk cecal ligation og punktering (CLP) på D0, og de andre var humbug-opererte eller ikke operert. Tre dager etter operasjonen (D3), S. aureus [sa, 1 x 107 KOLONI forming enheter (CFU)] eller normal saltvann (ns) ble administrert intranasalt. Kontrollgruppen (Ctrl) musene ble ikke intranasalt innpodet. Blod, lunges tømming væske (BALF), og Mages tømming væske (PLF) ble høstet 24 h etter SA injeksjon for en bakterie telling analysen. Dødeligheten i hver gruppe ble observert i løpet av 7 dager for overlevelse analyse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Mus overlevelse. C57BL/6 mus sendt til enten CLP eller humbug kirurgi mottatt S. aureus (sa) eller normal saltvann (ns) på den tredje dagen etter operasjonen (n = 8 mus per gruppe). Musene ble overvåket i 7 dager, og dødelighet ble registrert hver 12 h. Kaplan-Meier overlevelse kurver, log-Rank test (* p < 0,05) sammenlignet med Sham + SA mus og SA mus. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Mus cecum. Sekundær infeksjon ble indusert 3 dager etter CLP. 24 h etter SA infeksjon, ble mus ofret for å samle kolon vev. Representative bilder av cecal ligation under ulike skade treff vises. SA = S. aureus; NS = normal saltvann; CLP = cecal ligation og punktering. Scale bar = 1 cm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Bakteriell teller og representative bilder av agar plater. 3 dager etter operasjonen ble mus intranasalt innpodet med 1 x 107 CFU av S. aureus (sa) (n ≥ 3 mus per gruppe). Blood, BALF, og PLF ble høstet 24 h etter SA injeksjon, og bakteriell koloni teller ble bestemt etter 24 h av inkubasjons. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittet ± SEM. enveis ANOVA (Tukey ' s post hoc; * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; NS = ikke signifikant). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Elisa oppdage cytokin sekresjon. Sekundær infeksjon ble indusert 3 dager etter CLP. Konsentrasjoner av IL-1β, IL-6, og TNFα i serum (A) og BALF (B) fra mus etter sa infeksjon (n ≥ 3 mus per gruppe). Data presenteres som gjennomsnittet ± SEM av tre eksperimenter. Enveis ANOVA (Tukey ' s post hoc; * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * * p < 0,0001; NS = ikke signifikant). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Representativ hyppighet av nøytrofile penetrering. 24 timer etter intranasal infeksjon ble mus ofret for å få BALF (n ≥ 3 mus per gruppe). Prosenten av nøytrofile (CD11b+, gr-1+) ble kvantifisert av Flow flowcytometri og vises som betyr ± SEM av tre eksperimenter. Enveis ANOVA (Tukey ' s post hoc; * * * * p < 0,0001; NS = ikke signifikant). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som gull standard modell for sepsis forskning, CLP har en kombinasjon av tre fornærmelser, inkludert vevs traumer forårsaket av laparotomy, nekrose på grunn av ligation av cecum, og infeksjon som følge av mikrobiell lekkasje som forårsaker peritonitt med translokasjon av bakterier i blod8. Derfor etterligner CLP kompleksiteten av menneskelig sepsis bedre enn mange andre modeller. En stor begrensning av dagens CLP-modell er imidlertid manglende evne til å reflektere den mer langvarige fasen av sepsis sett hos pasienter i ICU3,4,5. Følgelig ble en klinisk relevant dobbel modell (dobbel-hit modell) foreslått å reflektere forsinket dødelighet av sepsis og undersøke mekanismene underliggende lunge sekundær infeksjon. I denne protokollen ble sepsis indusert ved å kombinere CLP med S. aureus lungeinfeksjon på 3 dager etter CLP. To-hit mus utstilt høyere dødelighet, alvorlig cecum skade, svekket blod, BALF bakterier klareringer, lavere Pro-inflammatorisk cytokiner, og lavere nøytrofile i BALF. Dette resulterte i alvorlig sepsis, som etterligner immunsuppresjon status i klinikker.
Følgende beskrivelser er viktige trinn. Vist i detalj er hvordan man skal produsere subletale sepsis under de samme forholdene. For det første ble kvinnelige mus brukt fordi kvinnelige mus er mer motstandsdyktige mot CLP enn mannlige mus11. For det andre, CLP-indusert dødelighet avhenger av flere tekniske parametre, slik som lengden på cecum ligaturer, nål størrelse, og antall cecal punktering9. Ligation på ca 75% av cecum induserer alvorlig sepsis, ligation av 60% av cecum medfører middelnivå sepsis, og ligation av 25% eller mindre av cecum resultater i mindre sepsis9. Det ble valgt å standardisere modellen ved å utføre en mild CLP (25%, singel gjennom-og-gjennom punktering med en 21 G 1 1/2 nål) for å indusere subletale sepsis11,12. Tredje, Fluid gjenoppliving anbefales å hindre sjokk og rask død på grunn av sirkulasjon kollaps og utvikle en hyperdynamic dyr sepsis modell, som nærmere etterligner hemodynamisk profil av menneskelig sepsis13. I tillegg bør bruk av smertestillende, slik som buprenorfin, vurderes fra en eksperimentell og etisk standpunkt10.
Tre dager etter CLP ble valgt som timepoint for å indusere sekundær infeksjon for å gjenspeile den immunsuppressiv fasen av sepsis. De fleste pasienter med sepsis har en langvarig sykehus kurs med de fleste dødsfall forekommer utover 3 dager, og mange deretter inn i sekundære sykehus-ervervet lungebetennelse, som ble konsekvent vist i en fersk studie med CLP sammen med P. aeruginosa14 . Tidligere resultater fra andre laboratorier viser også at 3 dager etter CLP, mus viser høy følsomhet for sekundære innpodet bakterier, og en dag etter smitte var vendepunktet fra over-betennelse til immunsuppresjon15, 16i den.
I tillegg er forskjeller i bakteriestammer og doserings innpodet betydelige faktorer som forårsaker variasjon i den doble modellen. Valg av belastning og dose nivåer er basert på behovene til den eksperimentelle utformingen av sekundær infeksjon under immunsuppressiv status. Basert på tidligere funn, 1 x 107 CFU av S. aureus ble valgt for denne studien.
For å forbedre effektiviteten av intranasal bakteriell levering direkte inn i musen lungene, oppmerksomhet bør vies til drypping volum, tid og kropp posisjon. Det er andre operative saker som kan uhyre påvirke utfallet av eksperimentet. Disse inkluderer holde musen oppreist, administrere flere-lav-dose bakterier væske i begge neseborene separat under hver drypping, se inhalasjon av væske uten å danne bobler, kontrollere hastigheten på innånding; flytte musen opp raskt og ned sakte, og legger musen på en 45 ° vinkel for å gjenopprette fra drypping. Intranasal bakterie administrasjon er ikke-invasiv og bidrar til å hindre kvelning, øke tilgjengeligheten, forbedre sikkerheten og minimere kirurgiske skader.
Denne metoden har imidlertid sine begrensninger. Ettersom dette er en metodisk studie, har data ikke blitt diskutert på endringer av kliniske tegn; anti-inflammatorisk cytokiner; og kvantitet og funksjon av monocytter, nøytrofile, og lymfocytter i blodet. Laboratoriemus er ofte innavlet, har lignende aldre og vekter, er plassert i bestemte patogen-frie anlegg, og vanligvis ikke har komorbiditeter, slik som eksisterende immunsuppresjon. Likevel, ulike kjønn, alder, immun-og ernæringsmessige status, og mulig adjuvant behandling som antibiotika av pasientene kan føre til heterogene kliniske utfall. Tatt i betraktning heterogenitet av menneskelige pasienter, variabler som alder, vekt, pre-eksisterende sykdommer, og klinisk støttende omsorg bør nøye overvåket.
Utviklingen av denne doble modellen (Double-hit modell) er betimelig og viktig for smitte og immunitet forskning samfunnet fordi det ligner progresjon fra Hyper-til allergi-inflammatorisk fase av menneskelig sepsis. Det reflekterer den vanlige kliniske scenariet av en sekundær nosocomial lungebetennelse hos pasienter med sepsis mer nøyaktig. Denne modellen kan bidra til å utvikle nye terapeutiske strategier for sepsis-indusert immunsuppresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen økonomiske konflikter av interesse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01, og AI097532-01A1 til M. W. University of North Dakota Core fasiliteter ble støttet av NIH tilskudd (INBRE P20GM103442 og COBRE P20GM113123). Dette arbeidet ble også støttet av den sentrale program for National Nature Science Foundation i Kina (81530063) til Jianxin Jiang. Oppdragsgivers hadde ingen rolle i studien design, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet. Vi takker Marvin leier (Center for Rural Health, University of North Dakota) for å gjøre videoen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Delano, M. J., Ward, P. A. The immune system's role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome. Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).
- Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C.
- Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
- Reinhart, K., et al. Recognizing Sepsis as a Global Health Priority - A WHO Resolution. The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
- Boomer, J. S., et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure. JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).
- Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis? Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34 (3), 250-260 (2010).
- He, S., et al. Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice. PLoS Pathogens. 12 (7), 23 (2016).
- Pu, Q. Q., et al. Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis. Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).
- Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).
- Chin, W., et al. A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset. Nature Communications. 9 (1), 917 (2018).
- Nascimento, D. C., et al. IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population. Nature Communications. 8, 14919 (2017).
- Deng, D., et al. Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics. International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).
