Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन संक्रामक परिणामों को मापने के लिए माध्यमिक अस्पताल में अंतर्निहित संक्रमण के लिए इम्यूनोसप्रेसिव हालत में, पहले cecal ligation / इम्यूनोसुप्रेशन सेप्सिस का नैदानिक रूप से प्रासंगिक मॉडल बनाएं।
Abstract
सेप्सिस, एक गंभीर और जटिल जीवन-धमकी देने वाला संक्रमण, कई अंगों में समर्थक और विरोधी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के बीच असंतुलन की विशेषता है। चिकित्सा के विकास के साथ, अधिकांश रोगी अति भड़काऊ चरण से बचते हैं लेकिन एक इम्यूनोसुप्रेसिव चरण में प्रगति करते हैं, जो माध्यमिक संक्रमण के उद्भव को बढ़ाता है। इसलिए, सेप्सिस के दौरान इम्यूनोसप्रेसिव चरण में माध्यमिक अस्पताल द्वारा प्राप्त संक्रमण के अंतर्निहित रोगजन की बेहतर समझ अत्यधिक महत्व की है। यहाँ रिपोर्ट चूहों में डबल हिट संक्रमण पैदा करके संक्रामक परिणामों का परीक्षण करने के लिए एक मॉडल है. एक मानक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया का उपयोग पॉलीमाइक्रोबियल पेरिटनिटिस को सीकल लिगेशन और पंचर (सीएलपी) द्वारा प्रेरित करने के लिए किया जाता है और इसके बाद प्रतिरक्षा दमन में होने वाले निमोनिया का अनुकरण करने के लिए स्टेफिलोकोकस ऑरियस के इंट्रानैसल संक्रमण द्वारा किया जाता है जो अक्सर देखा जाता है सेप्टिक रोगियों में। यह दोहरी मॉडल लंबे समय सेसेप्सिस और नोसोकोरियल निमोनिया से माध्यमिक संक्रमण के लिए संवेदनशीलता वाले रोगियों में होने वाली इम्यूनोसप्रेसिव राज्य को प्रतिबिंबित कर सकता है। इसलिए, यह मॉडल सेप्सिस प्रेरित माध्यमिक जीवाणु निमोनिया के पैथोफिजियोलॉजी की जांच करने के लिए एक सरल प्रयोगात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है, जिसका उपयोग सेप्सिस और इसकी जटिलताओं के लिए उपन्यास उपचार की खोज के लिए किया जा सकता है।
Introduction
सेपसिस मेजबान समर्थक भड़काऊ और विरोधी भड़काऊ प्रक्रियाओं की एक जटिल परस्पर क्रिया शुरू करता है और एक अति भड़काऊ प्रतिक्रिया और बाद में प्रतिरक्षा रोग1,2की विशेषता है। सेपसिस एक वैश्विक स्वास्थ्य प्राथमिकता का प्रतिनिधित्व करता है और गहन देखभाल इकाइयों (आईसीयू)3में मौतों की एक उच्च संख्या का कारण बनता है। सेप्सिस की घटनाओं के प्रति वर्ष दुनिया भर में 30 लाख से अधिक मामलों का अनुमान है , आईसीयू प्रबंधन4,5में अग्रिम के बावजूद मृत्यु दर 30% के रूप में उच्च के साथ . 2017 में, विश्व स्वास्थ्य संगठन ने इस घातक बीमारी की रोकथाम, निदान और प्रबंधन में सुधार करने के लिए एक प्रस्ताव पारित किया5. हालांकि, हाल के अध्ययनों से यह स्पष्ट है कि मौत गंभीर सेप्टिक रोगियों में प्राथमिक संक्रमण से नहीं बल्कि माध्यमिक नोसोकोमिक संक्रमण (विशेष रूप से निमोनिया) से होती है जो इम्यूनोसुप्रेशन6,7 के कारण होती है . इसलिए, क्यों सेप्टिक रोगियों माध्यमिक संक्रमण विकसित और अधिक प्रभावी उपचार की खोज के तंत्र को समझने के लिए तत्काल आवश्यक हैं. इसमें, एक दोहरी मॉडल, जिसे एक डबल-हिट मॉडल के रूप में भी जाना जाता है, लंबी सेप्सिस वाले रोगियों में होने वाली इम्यूनोसप्रेसिव घटना का अध्ययन करने के लिए वर्णित है।
बहुसूक्ष्मात्मक सेप्सिस पर अनुसंधान में सोने के मानक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में, सीकल लिगेशन और पंचर (सीएलपी) एक सर्जरी है जो सीकम लिगेशन और वेध की विशेषता है, जो पॉलीमाइक्रोबियल पेरिटोनिटिस और सेप्सिस8,9 में योगदान देती है। . पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रिया और साइटोकिन प्रोफाइल, गतिज और परिमाण के साथ, नैदानिक सेप्सिस के समान हैं। पंचर के लिए उपयोग किए जाने वाले लिगेशन, सुई के आकार और सीकल पंचर की संख्या की स्थिति प्रमुख कारक हैं जो सीएलपी के बाद मृत्यु दर को प्रभावित करते हैं।
नोसोकोमिल निमोनिया सेप्सिस के साथ गंभीर रूप से बीमार रोगियों के बीच मृत्यु का प्रमुख कारण है। गंभीर सेप्सिस के कारण जीवों के प्रमुख प्रकार में स्टैफिलोकोकस ऑरियस (20.5%), स्यूडोमोनास प्रजाति (19.9%), एंटोबैक्टीरिया (मुख्य रूप से ई. कोलाई, 16.0%), और कवक (19%) शामिल हैं। इस बीच, हाल के अध्ययनों से ग्राम-पॉजिटिव जीवों की बढ़ती घटनाओं का पता चला है, जो अब ग्राम-नकारात्मक संक्रमण3के समान हैं।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि में सीएलपी शामिल है, जो सबलेथल पॉलीमाइक्रोबियल पेरिटनिटिस को प्रेरित करने के लिए "पहली हिट" के रूप में प्रदर्शन करता है, जो इम्यूनोसुप्रेशन स्थिति को प्रकट करता है। प्रक्रिया भी एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक अनुसंधान मंच प्रदान करने के लिए "दूसरी हिट" के रूप में एस aureus के बाद intranasal instillation शामिल है.
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Protocol
यहाँ वर्णित सभी तरीकों की देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार प्रदर्शन किया गया और उत्तरी डकोटा संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. सीकल लिगेशन और पंचर
नोट: महिला C57BL/6 चूहों (वजन, 18-22 जी; उम्र, 6-8 सप्ताह) बेतरतीब ढंग से छह समूहों में विभाजित हैं: नियंत्रण समूह (Ctrl), संक्रमण समूह (S. Aureusके लिए एसए), दो शर्म समूहों, और दो CLP समूहों. Ctrl जानवरों सर्जरी और माध्यमिक संक्रमण चोटों के बिना छोड़ दिया जाता है. एसए जानवरों के ऑपरेशन के बिना एस ऑरियस फेफड़ों के संक्रमण के अधीन हैं। शाम संचालित जानवरों सीकम की एक प्रदर्शनी के साथ एक ही laparotomy से गुजरना (सेकम को छोड़कर न तो ligated है और न ही पंचर). प्रति समूह आठ चूहों अस्तित्व विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है, और तीन से पांच चूहों विभिन्न timepoints पर सूजन के आकलन के लिए उपयोग किया जाता है.
- सर्जरी से पहले, 20 मिनट के लिए autoclaving द्वारा सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों और सामग्री बाँझ. स्वच्छ और कीटाणुनाशक पोंछे के साथ ऑपरेटिंग टेबल कीटाणुरहित। सर्जरी के दौरान बाँझ शर्तों की स्थापना करने के लिए, उचित बाँझ शल्य चिकित्सा पर्दे के साथ पूरे ऑपरेटिव क्षेत्रों को कवर, और एक बाल कवर पहनते हैं, शल्य मुखौटा, सुरक्षात्मक eyewear, शल्य गाउन, और बाँझ दस्ताने.
- केटामाइन (80 मिलीग्राम/किग्रा), जाइलज़ीन (10 मिलीग्राम/किग्रा) मिश्रण को इंट्रापेरिटोनली प्रशासित किया गया 0.1 एमएल/माउस का उपयोग करके माउस को वजन और एनेस्थेटाइज करें। एक यू के आकार की स्थिति बनाने के अंगूठे और तर्जनी के साथ, आसानी से और धीरे पीछे से माउस की गर्दन दृष्टिकोण, तो तुरंत कान के पीछे गर्दन पकड़ इतना है कि माउस सिर अत्यधिक संयमित है. माउस के दाहिने वापस पैर पकड़ और शरीर को पकड़ने के लिए मध्य और अंगूठी उंगलियों (बाएं हाथ से सभी उंगलियों) का उपयोग करने के लिए एक पिंकी का उपयोग करें।
- चरम सीमा का कोई लचीलापन जब तक टो प्रति अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की तीव्रता की जाँच करें.
- एक बिजली के रेजर का उपयोग कर पेट के निचले वृत्ताकार दाढ़ी और आयोडीन के साथ क्षेत्र कीटाणुरहित।
- माउस को एक सुपाच्य स्थिति में बाँझ सतह पर रखें, जिसमें सिर ऑपरेटर से दूर उन्मुख होता है। बाँझ क्षेत्रों को बनाए रखने के लिए योजना बनाई शल्य चीरा पर छेद के साथ बाँझ तौलिया के साथ माउस को दबाओ।
- बाएं निचले पेट में स्केलपेल के साथ एक अनुदैर्घ्य त्वचा चीरा (लगभग 0.5 सेमी लंबा) बनाएं। चीरा (1-2 सेमी) का विस्तार करने के लिए छोटी कैंची का उपयोग करें।
चेतावनी: peritoneal गुहा घुसना करने के लिए नहीं सावधान रहें। - peritoneal गुहा में पहुँच प्राप्त करने के लिए इंट्रामस्क्युलर चीरा बनाओ और आसपास की आंत के साथ सीकम के जोखिम की अनुमति दें।
- पेट के बाईं ओर सीकम को अलग करें (ज्यादातर मामलों में, यह कुंद शारीरिक सम्प्स का उपयोग करके किया जाता है) और इसे एक बाँझ पर्दे पर हटा दें, जिससे छोटी और बड़ी आंतों को पेरिटोनल गुहा में छोड़ दिया जाता है।
चेतावनी: आंत्ररक्त रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचें। - अपेक्षाकृत कम मृत्यु दर के साथ एक लंबे समय तक संक्रमण बनाने के लिए जिला 25% स्थिति पर सीकम को लिगेट करें।
चेतावनी: सुनिश्चित करें कि ileocecal वाल्व ligate करने के लिए नहीं. - कम से कम संवहनी क्षेत्र में सीकम के लिगेशन और टिप के बीच में एकल के माध्यम से और के माध्यम से पंचर (दो छेद) के बीच में एक 21 जी 1 1 डिग्री 2 सुई के साथ सीकम को परफोरेट करें।
चेतावनी: रक्त वाहिकाओं को पंचर न करें। - सुई निकालें. पूर्ण मोटाई छिद्र सुनिश्चित करने के लिए प्रवेश छेद से मल की एक छोटी राशि धीरे बाहर निकालना।
चेतावनी: प्रक्रिया के दौरान आंत्र निरंतरता में बाधा न बरतने का ध्यान रखें। - सीकम को उदर गुहा में बदलें।
- 4-0 नायलॉन सर्जिकल टांके के साथ दो परतों में पेट बंद करें। साधारण चल टांके लगाने से पेट की पेशी बंद करें और सरल बाधित टांके लागू करके त्वचा को बंद करें। आयोडीन के साथ त्वचा को साफ करें।
- prewarmed के 1 एमएल इंजेक्शन (37 डिग्री सेल्सियस) 0.9% बाँझ सामान्य नमकीन (एनएस) समाधान पीठ पर subcutaneously तीसरे अंतरिक्ष हानि की जगह और इसे ठीक करने के लिए एक गर्म पैड पर जगह है.
- चूहों को एक तापमान-नियंत्रित कमरे (22 डिग्री सेल्सियस) में 12 एच प्रकाश/अंधेरे चक्र और भोजन और पानी तक नि:शुल्क पहुंच के साथ पिंजरे में वापस करें। चूहों की निगरानी कम से कम 2 घंटे के लिए हर 0.5 घंटे, फिर कम से कम 2 घ के लिए हर 6 एच, फिर 3 दिनों के लिए हर 12 एच, या उन्हें इच्छामृत्यु जब अस्तित्व विश्लेषण के लिए मरणासन्न.
नोट: पूर्व और बाद ऑपरेटिव analgesia (buprenorphine, 50 डिग्री ग्राम / किलो subcutaneously हर 12 एच) सर्जरी से पहले 24 एच के लिए सिफारिश कर रहे हैं सर्जरी के बाद 48 एच सर्जरी के बाद9,10.
2. एस ऑरियस के साथ माध्यमिक फेफड़ों के संक्रमण
नोट: Ctrl और SA समूहों को छोड़कर, शम और सीएलपी समूहों में 3 दिनों के बाद सीएलपी पर चूहों जीवित क्रमशः एक जीवाणु निलंबन या एन एस के 30 डिग्री एल के साथ intranasally प्रशासित किया जाना चाहिए। एसए समूह में जीवित चूहों को जीवाणु निलंबन के साथ intranasally पैदा किया जाना चाहिए।
- केटामाइन (45 mg/kg) और xylazine (10 मिलीग्राम/किलोग्राम) के 100 डिग्री एल समाधान को इंट्रापर्टिटोनली इंजेक्शन द्वारा माउस को एनेस्थेटाइज करें और माउस की सांसों को धीरे-धीरे तक प्रतीक्षा करें। सुई और पेट की दीवार के बीच puncturing कोण धीमी गति से इंजेक्शन के लिए कम से कम 30 डिग्री है.
- एक micropipette की मदद से, धीरे धीरे और intranasally के साथ पैदा करना 30 $L के 1 x 107 कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) एस aureus के साँस लेना पर aspirated किया जा करने के लिए. एक ईमानदार स्थिति में अपने कान से माउस पकड़े, धीरे धीरे दोनों नाक में जीवाणु निलंबन के 2-3 $L हर बार ड्रॉप. बुलबुले बनाने और छोड़ने के बिना साँस लेने के लिए माउस की अनुमति देने के लिए रिलीज की दर को समायोजित करें।
- माउस को ऊपर और नीचे उठाएँ, इसके सिर के साथ ऊपर और नीचे पूंछ, बैक्टीरिया श्वासनली में प्रवेश करने में मदद करने के लिए. माउस को जल्दी और दृढ़ता से ऊपर ले जाएँ, जबकि यह धीरे और धीरे धीरे गुरुत्वाकर्षण को बढ़ाने के लिए नीचे ले जा रहा है। 15x के बारे में पुन: डालने जब तक सभी बैक्टीरिया साँस ले रहे हैं, जो प्रत्येक माउस के लिए 10-15 मिनट लेना चाहिए.
- अपनी पीठ पर माउस रखना और angled बिस्तर पर सिर (के बारे में 35 डिग्री) और माउस घड़ी जब तक अपनी सांस सामान्य करने के लिए रिटर्न और यह पूरी तरह से संज्ञाहरण और प्रक्रियाओं से बरामद है.
- माउस को एक तापमान-नियंत्रित कमरे (22 डिग्री सेल्सियस) में वापस पिंजरे में 12 एच प्रकाश/अंधेरे चक्र और भोजन और पानी तक असीमित पहुंच के साथ रखें।
- पहले दिन के लिए हर 2 एच माउस की स्थिति की जाँच करें और सर्जरी के बाद 4 दिनों के लिए हर 12 एच बाद में। उन्हें Euthanize जब अस्तित्व विश्लेषण के लिए मरणासन्न या सूजन के आकलन के लिए संक्रमण के बाद 24 एच.
3. विश्लेषण मानकों
- चूहे अस्तित्व
- 7 दिनों के लिए चूहों की निगरानी. जब मरणासन्न और Kaplan-Meier तरीकों11का उपयोग कर अस्तित्व घटता उत्पन्न Euthanize .
- बैक्टीरियल मायने रखता है
- एसए इंजेक्शन के बाद 24 एच, रक्त फसल, ब्रोंकोएलवेलर लावेज तरल पदार्थ (BALF), और चूहों से peritoneal lavage तरल पदार्थ (PLF).। इसके बाद, पोषक अंगर प्लेटों में 100 प्र. की संख्या 100 प्र. को मिलाकर 24 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संचित करें ताकि जीवाणु कॉलोनी की गणना11,12,13की जा सके .
- साइटोकिन्स
नोट: आईएल-1 के प्रो भड़काऊ साइटोकिन सांद्रता, आईएल-6, और चूहों से सीरम और बीएएलएफ में टीएनएफ का मूल्यांकन किया जाना चाहिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार एलिसा किट का उपयोग करके।- विभिन्न कैप्चर एंटीबॉडी कार्य समाधान के साथ 96 अच्छी तरह से ELISA प्लेट को 100 $L/वेल के साथ कोट करें ताकि डुप्लिकेट और नमूनों में त्रिफला में मानकों को चलाया जा सके। प्लेट को सील करें और इसे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दें।
- प्लेट को 255 जेडएल/वेल वॉश बफर (1x पीबीएस, 0.05% ट्वीन-20) से तीन बार धोएं।
- गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को ब्लॉक करने के लिए, 200 $L/अच्छी तरह से diluent जोड़ें। 1 ज के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर प्लेट को सील करें और इनक्यूबेट करें।
- मानक समाधान तैयार करें: 1000 pg/mL से आठ दो गुना सीरियल कमजोर पड़ने।
- उपयुक्त कुओं में मानकों या नमूनों के 100 एल/वेल और रिक्त कुओं में 100 डिग्री सेल्सियस/कूपों को जोड़ें। प्लेट को सील करें और आरटी पर 2 एच या रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- प्लेट को 255 डिग्री सेल्सियस/
- उपयुक्त कुओं के लिए विभिन्न पहचान एंटीबॉडी कार्य समाधान के 100 $L/अच्छी तरह से जोड़ें। प्लेट को सील करें और 1 एच के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें।
- प्लेट को 255 डिग्री सेल्सियस/
- सभी कुओं में पतला एचआरपी घोल के 100 एल/वेल जोड़ें। प्लेट को सील करें और 30 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करें।
- प्लेट को 255 डिग्री सेल्सियस/
- 100 डिग्री सेल्सियस/अच्छी तरह से पतला TMB समाधान जोड़ें। 15 मिनट के लिए आरटी में प्रकाश से दूर थाली इनक्यूबेट करें।
- जोड़ें 50 $L/अच्छी तरह से बंद समाधान (1 एम एच3पीओ4) जोड़ें. एक प्लेट रीडर के साथ 450 एनएम पर अवशोषण पढ़ें.
- प्रवाह साइटोमेट्री
- BALF से कोशिकाओं की कुल संख्या प्राप्त करें। एरिथ्रोसाइट्स को एके लिसिंग बफर का उपयोग करके और पीबीएस का उपयोग करके 2x धोएं।
- पहले वर्णित11के रूप में प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा तो एकल सेल निलंबन का विश्लेषण करें। सतह धुंधला के लिए, एपीसी एंटी-माउस CD11b और एंटी-माउस Gr-1 (Ly-6G/Ly-6C) एंटीबॉडी के साथ दाग न्यूट्रोफिल (CD11b+ जीआर-1+)। विश्लेषण के लिए कम से कम 3 x 104 लाइव, गैर-डेबोरेट्स कोशिकाओं को एकत्र करें।
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Representative Results
प्रयोगात्मक डिजाइन और प्रक्रियाओं के आधार पर, C57BL/6 चूहों CLP के अधीन थे, और 3 दिनों के बाद, वे intranasally बैक्टीरिया प्रशासित किया गया (चित्र 1)। जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है, चूहों को पेरिटोनाइटिस के प्रेरण के बाद $ 12 एच पर मरने लगे। सीएलपी + एसए समूह में दो चूहों और सीएलपी + एनएस समूह में तीन चूहों इंट्रानासल एस ऑरियस पैदा करने से पहले मर गया। असंक्रमित गैर-या शर्मीले चूहों में कोई मृत्यु दर नहीं पाई गई। इसलिए, जब चूहों निमोनिया से पहले सीएलपी था, मृत्यु दर बहुत अधिक था (पी एंड एलटी; 0.05). intranasal बैक्टीरिया चुनौती (1 x 107 CFU) के बाद, आठ चूहों में से तीन दोनों एसए और शाम + SA समूहों में बच गया, और आठ चूहों में से चार CLP + NS समूह में बच गया. हालांकि, सभी आठ चूहों CLP + SA समूह में मृत्यु हो गई. इसके विपरीत, Ctrl समूह और शाम + NS समूह में हर माउस बच गया. CLP चूहों अधिक मृत्यु दर दिखाया जब बाद में एस ऑरियस के साथ चुनौती दी. सीएलपी के बाद एस ऑरियस की मृत्यु (100%) अकेले संक्रमित से अधिक था (37.5%) या शम-संचालित (37.5%; पी एंड एलटी; 0.05) के बाद एस ऑरियस।
जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, सीएलपी के बाद के जानवरों में गंभीर सीकम नेक्रोसिस देखा गया था, लेकिन डबल-हिट समूह (सीएलपी + एसए) से अधिक। हालांकि, नियंत्रण में सीकम का कोई सकल परिवर्तन नहीं था या बैक्टीरिया समूहों के साथ एकल-हिट था। रक्त, BALF, और पीएलएफ एस aureus से संक्रमित चूहों के फेफड़ों के जीवाणु निकासी का आकलन करने के लिए सुसंस्कृत थे 3 दिन के बाद CLP. इस उच्च घातकता के साथ जुड़ा हुआ था काफी वृद्धि हुई एस aureus CFU रक्त में और CLP चूहों की पीएलएफ शर्म चूहों के साथ तुलना में (पी एंड एलटी; 0.05; चित्र 4क,ग) रक्त में एस ऑरियस CFU और CLP + SA चूहों के BALF की संख्या स्पष्ट रूप से CLP + NS चूहों से अधिक था (पी एंड एलटी; 0.01; चित्र 4क,ब)
समर्थक भड़काऊ cytokines के लिए, परिणाम से पता चला है कि सीरम आईएल-1 के अभिव्यक्ति के स्तर, आईएल -6, और TNF ] काफी सेप्सिस में जीवाणु पैदा करने के बाद 24 एच पर वृद्धि हुई-जीवित चूहों कि अकेले CLP लिया या शम संचालित करने के लिए चूहों एस ऑरियस के साथ चुनौती दी (चित्र 5A) हालांकि, समर्थक भड़काऊ cytokines माध्यमिक संक्रमण के साथ सेप्टिक चूहों के BALF में थोड़ा वृद्धि हुई, नियंत्रण संक्रमित चूहों में उन लोगों से अलग (एसए चूहों) और शाम + एसए. इस बीच, डबल-हिट चूहों ने एसए और शाम + एसए चूहों (पी एंड एलटी; 0.001; दोनों की तुलना में बीएएफ आईएल-1 जेड, आईएल-6 और टीएनएफ के स्तर में काफी कमी का प्रदर्शन किया; चित्र 5ख)
जैसा कि चित्र 6में दर्शाया गया है, संक्रमण के बाद 24 एच पर चूहों का बलिदान किया गया, और बाल्फ में सापेक्ष न्यूट्रोफिल प्रतिशत प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा पाया गया। डबल हिट चूहों अकेले एस ऑरियस निमोनिया लिया है कि चूहों की तुलना में BALF में न्यूट्रोफिल की एक महत्वपूर्ण कमी का प्रदर्शन किया। सामूहिक रूप से, इन आंकड़ों से पता चला है कि सीएलपी मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ख़राब करता है, जिसके परिणामस्वरूप माध्यमिक जीवाणु निमोनिया की संवेदनशीलता में वृद्धि हुई है।
चित्र 1 : प्रायोगिक डिजाइन. चूहे बेतरतीब ढंग से छह समूहों में विभाजित किया गया. दो समूहों ने डी0 में सीकल लिगेशन और पंचर (सीएलपी) किया और अन्य को शम-संचालित किया गया या नहीं किया गया। सर्जरी के तीन दिन बाद (डी 3), एस ऑरियस [एसए, 1 x 107 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU)] या सामान्य नमकीन (एनएस) intranasally प्रशासित किया गया था। नियंत्रण समूह (Ctrl) चूहे intranasally पैदा नहीं किए गए थे. रक्त, ब्रोंकोल्वेलर लावेज तरल पदार्थ (BALF), और peritoneal lavage तरल पदार्थ (PLF) एक बैक्टीरिया गिनती परख के लिए एसए इंजेक्शन के बाद 24 एच काटा गया. जीवित रहने के विश्लेषण के लिए 7 दिनों के दौरान प्रत्येक समूह में मृत्यु दर देखी गई। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2 : माउस अस्तित्व. C57BL/6 चूहों या तो CLP या शर्म सर्जरी प्राप्त एस aureus (एसए) या सामान्य नमकीन (एनएस) सर्जरी के बाद तीसरे दिन (एन $ 8 चूहों प्रति समूह) को प्रस्तुत किया. चूहों 7 दिनों के लिए निगरानी की गई थी, और मृत्यु दर हर 12 ज Kaplan-Meier अस्तित्व घटता दर्ज किया गया था, लॉग रैंक परीक्षण (* पी और 0.05) शाम + एसए चूहों और एसए चूहों के साथ तुलना में. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3 : माउस सीकम. माध्यमिक संक्रमण 3 दिन के बाद सीएलपी प्रेरित किया गया था. एसए संक्रमण के 24 ज के बाद, चूहों को बृहदान्त्र ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए बलिदान कर दिया गया। विभिन्न चोट हिट के तहत cecal ligation के प्रतिनिधि तस्वीरें दिखाए जाते हैं. SA ] एस ऑरियस; एन एस - सामान्य लवण; CLP ] सीकल लिगेशन और पंचर। स्केल बार - 1 सेमी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4 : बैक्टीरियल मायने रखता है और agar प्लेटों के प्रतिनिधि छवियों. सर्जरी के 3 दिन बाद, चूहों intranasally एस aureus के 1 x 107 CFU के साथ पैदा किया गया (एसए) (एन - 3 समूह प्रति चूहों). रक्त, BALF, और पीएलएफ एसए इंजेक्शन के बाद 24 एच काटा गया था, और जीवाणु कॉलोनी गिनती ऊष्मायन के 24 एच के बाद निर्धारित किया गया. परिणाम मतलब के रूप में व्यक्त कर रहे हैं - SEM. एक तरह से ANOVA (Tukey के बाद हॉक; * पी और lt; 0.05; ** पी और lt; 0.01; * * पी और lt; 0.001; एन एस ] महत्वपूर्ण नहीं). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5 : एलिसा साइटोकीन स्राव का पता लगाने। माध्यमिक संक्रमण 3 दिन के बाद सीएलपी प्रेरित किया गया था. एसए संक्रमण के बाद चूहों से आईएल-1, आईएल-6, और टीएनएफ की सांद्रता (ए) और बीएएलएफ (बी) (प्रति समूह 3 चूहे)। डेटा तीन प्रयोगों के अर्थ - SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. एक तरह से ANOVA (Tukey के बाद हॉक; * पी और lt; 0.05; *p और lt; 0.01; * * * पी और lt; 0.0001; एन एस ] महत्वपूर्ण नहीं). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6 : न्यूट्रोफिल प्रवेश के प्रतिनिधि आवृत्ति. 24 ज intranasal संक्रमण के बाद, चूहों BALF प्राप्त करने के लिए बलिदान कर दिया गया (एन - 3 चूहों प्रति समूह). न्यूट्रोफिल (CD11b+, GR-1+) का प्रतिशत प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा परिमाणित किया गया था और तीन प्रयोगों के SEM साधन के रूप में दिखाया गया है। एक तरह से ANOVA (Tukey के बाद हॉक; * * * पी और lt; 0.0001; एन एस - महत्वपूर्ण नहीं). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
सेप्सिस अनुसंधान के लिए सोने के मानक मॉडल के रूप में, सीएलपी तीन अपमान का एक संयोजन है, लेपरोटोमी की वजह से ऊतक आघात सहित, सीकम के लिगेशन के कारण नेक्रोसिस, और माइक्रोबियल रिसाव का एक परिणाम के रूप में संक्रमण जो स्थानांतरण के साथ पेरिटोनिटिस का कारण बनता है रक्त में बैक्टीरिया की8. इसलिए, सीएलपी कई अन्य मॉडलों की तुलना में बेहतर मानव सेप्सिस की जटिलता mimics. तथापि, वर्तमान सीएलपी मॉडल की एक प्रमुख सीमा आईसीयू3,4,5में रोगियों में देखे गए सेप्सिस के अधिक लंबे समय तक चरण को प्रतिबिंबित करने में असमर्थता है । इसलिए, एक चिकित्सकीय प्रासंगिक दोहरी मॉडल (डबल-हिट मॉडल) सेप्सिस की देरी से मृत्यु दर को प्रतिबिंबित करने और फुफ्फुसीय माध्यमिक संक्रमण अंतर्निहित तंत्र की जांच करने का प्रस्ताव किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, सेप्सिस को सीएलपी के बाद 3 दिनों में एस ऑरियस फेफड़ों के संक्रमण के साथ सीएलपी के संयोजन से प्रेरित किया गया था। दो हिट चूहों उच्च मृत्यु दर का प्रदर्शन किया, गंभीर cecum क्षति, कमजोर रक्त, BALF बैक्टीरिया मंजूरी, कम समर्थक भड़काऊ cytokines, और BALF में कम न्यूट्रोफिल. इसके परिणामस्वरूप गंभीर सेप्सिस हुआ, जो क्लीनिक में इम्यूनोसुप्रेशन स्थिति की नकल करता है।
निम्न वर्णन महत्वपूर्ण चरण हैं. विस्तार से दिखाया गया है कि एक ही परिस्थितियों में सबथैल सेप्सिस का उत्पादन कैसे करें। सबसे पहले, मादा चूहों का उपयोग किया गया क्योंकि मादा चूहों को पुरुष चूहों की तुलना में सीएलपी के लिए अधिक प्रतिरोधी हैं11. दूसरा, सीएलपी-प्रेरित मृत्यु दर कई तकनीकी पैरामीटरों पर निर्भर करती है, जैसे सीकम लिगेटेड की लंबाई, सुई का आकार, और सीकल पंचर की संख्या9। सीकम के लगभग 75% का लिगेशन गंभीर सेप्सिस को प्रेरित करता है, सीकम के 60% का लिगेशन मध्यम स्तर के सेप्सिस को प्रेरित करता है, और छोटे सेप्सिस में सीकम के 25% या उससे कम का लिगेशन9होता है। यह एक हल्के सीएलपी प्रदर्शन करके मॉडल का मानकीकरण करने के लिए चुना गया था (25%, एकल के माध्यमसे और के माध्यम से पंचर एक 21 जी 1 1 / तीसरा, तरल पदार्थ पुनर्जीवन परिसंचरण पतन के कारण सदमे और तेजी से मौत को रोकने के लिए और एक अतिगतिक पशु सेप्सिस मॉडल है, जो और अधिक बारीकी से मानव सेप्सिस13के hemodynamic प्रोफ़ाइल नकल विकसित करने के लिए सिफारिश की है. इसके अतिरिक्त, इस तरह के buprenorphine के रूप में एनाल्जेसिक, के उपयोग के एक प्रयोगात्मक और नैतिक दृष्टिकोण से विचार किया जाना चाहिए10.
तीन दिन के बाद सीएलपी सेप्सिस के इम्यूनोसप्रेसिव चरण को प्रतिबिंबित करने के लिए माध्यमिक संक्रमण को प्रेरित करने के लिए एक समय बिंदु के रूप में चुना गया था। सेप्सिस के साथ अधिकांश रोगियों को 3 दिनों से परे होने वाली सबसे अधिक मौतों के साथ एक लंबी अस्पताल पाठ्यक्रम है, और कई तो माध्यमिक अस्पताल में प्रवेश प्राप्त निमोनिया, जो लगातार पी aeruginosa14 के साथ सीएलपी के साथ हाल ही में एक अध्ययन में दिखाया गया था . अन्य प्रयोगशालाओं से पिछले परिणाम भी प्रदर्शित करता है कि 3 दिन CLP के बाद, चूहों माध्यमिक पैदाबैक्टीरिया के लिए उच्च संवेदनशीलता दिखाने के लिए, और एक दिन के बाद संक्रमण से अधिक सूजन से इम्यूनोसुप्रेशन 15 के लिए मोड़ था, 16.
इसके अलावा, बैक्टीरिया उपभेदों और खुराक में मतभेद पैदा दोहरी मॉडल में परिवर्तनशीलता के कारण महत्वपूर्ण कारक हैं. तनाव और खुराक के स्तर का चयन इम्यूनोसप्रेसिव स्थिति के दौरान माध्यमिक संक्रमण के प्रयोगात्मक डिजाइन की जरूरतों पर आधारित हैं। पिछले निष्कर्षों के आधार पर, 1 x 107 S. aureus के CFU इस अध्ययन के लिए चुना गया था.
सीधे माउस फेफड़ों में intranasal जीवाणु वितरण की दक्षता में सुधार करने के लिए, ध्यान पैदा करने की मात्रा, समय, और शरीर की स्थिति के लिए भुगतान किया जाना चाहिए। वहाँ अन्य परिचालन मामलों है कि बेहद प्रयोग के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. इनमें माउस को सीधा रखना, प्रत्येक आस-पास के दौरान अलग-अलग दोनों नथुनों में कई-कम खुराक बैक्टीरिया तरल का प्रबंध करना, बुलबुले बनाने के बिना तरल के साँस लेना देखना, साँस लेना की गति को नियंत्रित करना; माउस को जल्दी से ऊपर ले जाना तो धीरे धीरे नीचे, और एक 45 डिग्री कोण पर माउस बिछाने के लिए पैदा से उबरने के लिए. Intranasal बैक्टीरिया प्रशासन noninvasive है और घुट को रोकने में मदद करता है, पहुंच बढ़ाने, सुरक्षा में सुधार, और शल्य चिकित्सा चोटों को कम से कम.
हालांकि, इस विधि की अपनी सीमाएँ हैं। चूंकि यह एक पद्धतिविज्ञानीय अध्ययन है, नैदानिक संकेतों के परिवर्तनों पर डेटा पर चर्चा नहीं की गई है; विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स; और मात्रा और रक्त में monocytes, न्यूट्रोफिल, और लिम्फोसाइटों के समारोह. प्रयोगशाला चूहों अक्सर inbred हैं, समान उम्र और वजन है, विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त सुविधाओं में रखे जाते हैं, और आमतौर पर comorbidities नहीं है, इस तरह के पूर्व मौजूदा इम्यूनोसुप्रेशन के रूप में. फिर भी, अलग लिंग, उम्र, प्रतिरक्षा और पोषण की स्थिति, और संभव सहायक उपचार जैसे रोगियों की एंटीबायोटिक दवाओं विषम नैदानिक परिणामों में परिणाम हो सकता है. मानव रोगियों की विषमता को ध्यान में रखते हुए, उम्र, वजन, पूर्व-मौजूदा रोगों, और नैदानिक सहायक देखभाल जैसे चरों को ध्यान से देखा जाना चाहिए।
इस दोहरी मॉडल (डबल-हिट मॉडल) का विकास संक्रमण और प्रतिरक्षा अनुसंधान समुदाय के लिए समय पर और महत्वपूर्ण है क्योंकि यह मानव सेप्सिस के हाइपर-टू-डिप-भड़काऊ चरण की प्रगति जैसा दिखता है। यह सेप्सिस के साथ रोगियों में एक माध्यमिक nosocomial निमोनिया के आम नैदानिक परिदृश्य को दर्शाता है और अधिक सही. यह मॉडल सेप्सिस प्रेरित इम्यूनोसुप्रेशन के लिए नई चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने में मदद कर सकता है।
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Disclosures
लेखकों के हितों का कोई वित्तीय संघर्ष नहीं है.
Acknowledgments
यह कार्य राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01, और AI097532-01A1 से एम डब्ल्यू के लिए समर्थित किया गया था। नॉर्थ डकोटा कोर सुविधाओं के विश्वविद्यालय NIH अनुदान (INBRE P20GM103442 और COBRE P20GM113123) द्वारा समर्थित थे. यह काम भी चीन के राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन के मुख्य कार्यक्रम (81530063) Jianxin जियांग के द्वारा समर्थित किया गया था. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी. हम वीडियो बनाने के लिए मारविन Leier (ग्रामीण स्वास्थ्य के लिए केंद्र, उत्तरी डकोटा विश्वविद्यालय) धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
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