Summary
Bu protokol, ilk kez çekal ligasyon/delinme fareleri kurarak ve onları intrananöz enfeksiyona karşı zorlayarak bağışıklık bastırma sepsis klinik olarak alakalı bir model oluşturmak.
Abstract
Sepsis, şiddetli ve karmaşık yaşam tehdit enfeksiyon, çoklu organlarda yanlısı ve anti-inflamatuar tepkiler arasında bir dengesizlik ile karakterize edilir. Tedavilerin gelişimi ile, çoğu hasta hiperinflamatuar fazda hayatta kalır, ancak ikincil enfeksiyonların ortaya çıkmasını artıran bir immünofarsif fazda ilerlemeler. Bu nedenle, sepsis sırasında bağışıklık baskılayıcı fazda ikincil hastane elde edilen enfeksiyonların temelindeki patogenezinin daha iyi anlaşılması büyük önem taşımaktadır. Burada bildirilen farelerde çift isabet enfeksiyonları oluşturarak bulaşıcı sonuçları test etmek için bir modeldir. Standart bir cerrahi prosedür çekal ligasyon ve delinme (CLP) ile polimikrobiyal peritonit teşvik etmek için kullanılır ve sık görülen bağışıklık bastırma meydana pnömoni simüle etmek için Staphylococcus aureus intranazal enfeksiyon izledi Septik hastalarda. Bu çift model, uzun süren sepsis ve nozokomiyal pnömoni sekonder enfeksiyona karşı duyarlılık olan hastalarda meydana gelen immünrepresif durumu yansıtabilir. Bu nedenle, bu model sepsis kaynaklı ikincil bakteriyel pnömoni, sepsis ve komplikasyonları için yeni tedaviler keşfetmek için kullanılabilecek Patofizyoloji araştırmak için basit bir deneysel yaklaşım sağlar.
Introduction
Sepsis, Host Pro-inflamatuar ve anti-inflamatuar süreçlerin karmaşık bir etkileşimi başlatır ve hiperinflamatuar yanıt ve sonraki bağışıklık fonksiyon bozukluğu ile karakterize edilir1,2. Sepsis, küresel bir sağlık önceliğini temsil eder ve yoğun bakım ünitelerinde (is)3' te yüksek sayıda ölümlere neden olur. Sepsis 'in insidansı yılda dünya çapında 30.000.000 vakaları aşacak, yoğun bakım yönetimi4,5' teki ilerlemelere rağmen mortalite oranlarının% 30 kadar yüksek olduğu tahmin edilmektedir. 2017 yılında Dünya Sağlık Örgütü, bu ölümcül hastalığın önlenmesi, teşhisi ve yönetimini iyileştirmek için bir çözüm kabul etti5. Ancak, son çalışmalar ölüm şiddetli septik hastalarda primer enfeksiyondan kaynaklanmaz ama yerine ikincil nozokomiyal enfeksiyon (özellikle pnömoni) bu bağışıklık bastırma neden olduğunu göstermiştir5/6 . Bu nedenle, septik hastaların ikincil enfeksiyon geliştirme ve daha etkili tedaviler keşfetmek neden mekanizmaları anlamak acilen gereklidir. Burada, çift vuruş modeli olarak da bilinen çift model, uzun süren sepsis hastalarında meydana gelen immünpresif olguyu incelemek için açıklanmıştır.
Polimikrobiyal sepsis üzerinde araştırmalarda altın standardı deneysel model olarak, çekal ligasyon ve delinme (CLP), polimikrobiyal peritonit ve sepsis için katkı sağlayan çekum ligasyon ve perforasyon ile karakterize bir cerrahidir,8,9 . Patofizyolojik süreç ve sitokin profilleri, kinetik ve büyüklüğü ile birlikte, klinik sepsis benzer. Ligasyon pozisyonu, delinme için kullanılan iğne büyüklüğü ve çekal delinmesi sayısı CLP 'nin ardından mortaliteyi etkileyen önemli faktörlerdir.
Nozokomiyal pnömoni, sepsis olan eleştirel hastalar arasında mortalite nedeninin önde gelen nedenidir. Şiddetli sepsis neden olan organizmaların ana türü stafilokok aureus (% 20,5), Pseudomonas türleri (% 19,9), Enterobacteriacae (ağırlıklı olarak E. coli,% 16,0) ve mantar (% 19) içerir. Bu arada, son çalışmalar gram-pozitif organizmaların artan bir insidansı önerdi, şimdi neredeyse gram-negatif enfeksiyonlar gibi yaygın3.
Bu protokolde açıklanan yöntem, bir bağışıklık bastırma durumu gösteren, alt ölümcül polimikrobiyal peritonit için "ilk vuruş" olarak gerçekleştirilen CLP içerir. Prosedür aynı zamanda klinik olarak ilgili bir araştırma platformu sağlamak için "ikinci hit" olarak S. aureus sonraki intranazal instıtasyon içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada anlatılan tüm yöntemler, Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Kılavuzu Enstitüsü 'ne uygun olarak yapılmıştır ve Kuzey Dakota Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıABUC) tarafından onaylanmıştır.
1. çekal ligasyon ve delinme
Not: kadın C57BL/6 fareler (ağırlık, 18-22 g; yaş, 6-8 hafta) rastgele altı gruba ayrılır: kontrol grubu (Ctrl), enfeksiyon grubu ( S. aureusiçin sa), iki sahte grup ve iki CLP grubu. CTRL hayvanlar cerrahi ve ikincil enfeksiyon yaralanmaları olmadan bırakılır. SA hayvanları ameliyat olmadan S. aureus akciğer enfeksiyonuna maruz kalırlar. Sham tarafından işletilen hayvanlar, çekumun bir fuar ile aynı laparotomi geçmesi (çekum hariç ne bağlandı ne de delinmiş). Grup başına sekiz fare, hayatta kalma analizi için kullanılır ve çeşitli zaman noktalarında inflamasyonun değerlendirilmesi için üç ila beş fare kullanılır.
- Ameliyattan önce, tüm cerrahi enstrümanları ve malzemeleri 20 dakika boyunca otoklavlama ile sterilize edin. dezenfektan mendillerle çalışma tablosunu temizleyin ve dezenfekte ediniz. Cerrahi sırasında steril koşullar kurmak için, uygun Steril Cerrahi perdeler ile tüm operatif alanları kapsayacak ve bir saç örtüsü, cerrahi maske, koruyucu gözlük, cerrahi elbise ve steril eldiven giymek.
- Tartım ve 0,1 kullanarak fare anestezize ml/ketamin fare (80 mg/kg), xylazine (10 mg/kg) karışımı intraperitoneal uygulanan. Sol el başparmak ve Dizin parmağı ile U şeklinde bir pozisyon oluşturan, fare kafası son derece kısıtlanmış böylece hemen kulakları arkasında boyun tutun, sonra düzgün ve nazikçe arkasındaki fareyi boyun yaklaşım. Fare sağ geri bacak tutmak ve vücut tutmak için orta ve halka parmaklar (sol taraftan tüm parmaklar) kullanmak için bir Pinky kullanın.
- Ekstremite hiçbir fleksiyon kadar ayak tutam ile anestezi yoğunluğu kontrol edin.
- Bir elektrikli jilet kullanarak karın alt dörtgen tıraş ve iyot ile alanı dezenfekte.
- Fareyi operatörden uzağa yönelten, fareyle steril yüzeye bir supin pozisyonunda yerleştirin. Steril alanları korumak için planlanan cerrahi kesi üzerinde delik ile steril havlu ile fareyi boşaltın.
- Sol alt karın içinde bir neşter ile uzunlamasına bir cilt kesi (yaklaşık 0,5 cm uzunluğunda) olun. Kesi genişletmek için küçük makas kullanın (1-2 cm).
Dikkat: periton boşluğa nüfuz etme konusunda dikkatli olun. - Periton boşluğa erişim elde etmek için intramusküler kesi yapın ve bitişik bağırsak ile çekumun maruz kalmasını sağlayın.
- Karın sol tarafındaki çekum izole (çoğu durumda, bu künt anatomik forseps kullanılarak yapılır) ve steril bir örtü üzerinde çıkarmak, periton boşlukta küçük ve büyük bağırsak bırakarak.
DIKKAT: mezenterik kan damarlarına zarar vermemek. - Nispeten düşük mortalite ile uzun süreli bir enfeksiyon oluşturmak için distal% 25 pozisyonunda çekum ligate.
Dikkat: ileoçekal valfi kapamak için emin olun. - En az vaskülarize alanda çekumun ucu ile ligasyon ve uç arasındaki tek-ve-Through delinme (iki delik) ile 21 G 1 1/2 iğne ile çekum perforate.
DIKKAT: kan damarlarını delmeyin emin olun. - İğneyi çıkarın. Tam kalınlıkta perforasyon sağlamak için penetrasyon deliklerinden dışkı küçük bir miktar hafifçe ekstrüzyon.
DIKKAT: prosedür sırasında bağırsak sürekliliğini engellemeye özen gösterin. - Çekumu karın boşluğuna değiştirin.
- 4-0 naylon cerrahi sütürler ile iki katmanda karın kapatın. Basit çalışan sütürler uygulayarak abdominal kas kapatın ve basit kesintiye dikiş uygulayarak cilt kapatın. Iyot ile cildi temizleyin.
- 1 mL prewarmed enjekte (37 °C) 0,9% steril normal tuzlu (NS) çözüm arka subkutan üçüncü alan kaybı yerine ve kurtarmak için sıcak bir yastık üzerine yerleştirin.
- 12 saat ışık/karanlık döngüleri ve yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile sıcaklık kontrollü bir odada (22 °C) kafeste fareler dönün. Her 0,5 saat için en az 2 h, sonra her 6 h için en az 2 d, sonra her 12 saat için 3 gün, ya da onlara ötenize zaman fareleri monitör hayatta kalma analizi için can çekişen.
Not: ameliyat öncesi ve sonrası analjezi (buprenorfik, 50 μg/kg subkutan her 12 h), ameliyattan önce 24 h, ameliyattan sonra 48 h 'ye kadar9,10için tavsiye edilir.
2. S. aureus ile ikincil akciğer enfeksiyonu
Not: Ctrl ve sa grupları dışında, 3 gün içinde kalan fareler, Sham ve CLP gruplarındaki CLP sonrası, sırasıyla 30 μL bakteriyel süspansiyon veya NS ile intranasal uygulanmalıdır. SA grubunda kalan fareler, bakteriyel süspansiyon ile intranasal aşılmalıdır.
- İntraperitoneal enjekte ederek fare anestezize 100 μL ketamin çözeltisi (45mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) ve fare yavaşça nefes kadar bekleyin. İğne ve karın duvarı arasındaki delik açısı yavaş enjeksiyon için 30 ° ' den daha azdır.
- Bir mikropipet yardımıyla, S. aureus 'un 30 μL 'sini 1 x 107 koloni şekillendirme ünitesi (CFU) ile yavaşça ve intranaslı bir şekilde aşılamak için inhalasyon üzerine aspirasyonu Fareyi dik pozisyonda kulaklarıyla tutarak, her seferinde her iki burun delikine de 2-3 μL bakteriyel süspansiyonu yavaşça bırakın. Kabarcıkları oluşturmadan ve bırakarak fare nefes vermek için serbest bırakma hızını ayarlayın.
- Fare yukarı ve aşağı, baş yukarı ve kuyruk aşağı, bakteri trakea girmek yardımcı olmak için kaldırın. Yavaşça ve yavaşça yerçekimi artırmak için aşağı hareket ederken, hızlı ve güçlü bir şekilde fareyi hareket ettirin. Her fare için 10-15 dk almalıdır tüm bakteriler, inhaled kadar 15x hakkında Tekrarlıyorum.
- Fareyi arkasına koy ve açılı yataklara (yaklaşık 35 °) gidin ve nefesini normale döndürene kadar fareyi izleyin ve anestezi ve prosedürlerden tamamen kurtarılır.
- 12 saat ışık/karanlık döngüleri ve gıda ve suya sınırsız erişim ile sıcaklık kontrollü bir odada (22 °C) fare geri kafes yerleştirin.
- Kontrol fare koşulları her 2 saat ilk gün ve her 12 saat sonra 4 ameliyat sonrası gün. Hayatta kalma analizi için can çekişen ya da inflamasyonun değerlendirilmesi için enfeksiyondan sonra 24 saat onları ötenize.
3. analiz parametreleri
- Fareler hayatta kalma
- 7 gün boyunca fareleri izleyin. Can çekişen ve Kaplan-Meier yöntemleri11kullanarak hayatta kalma eğrileri oluşturmak euthanize.
- Bakteriyel sayar
- SA enjeksiyonu sonrasında 24 h, kan, Bronkoalveoler Lavaj sıvısı (Balf) ve farelerden periton lavaj sıvısı (PLF) hasat. Daha sonra, beslenme agar plakaları için seyreltilenleri 100 μL ekleyin ve onlar için 37 °c yılında Kültür onları 24 h bakteriyel koloni sayıları belirlemek için11,12,13.
- Sitokin
Not: Il-1β, IL-6 ve TNFα ' nın serum ve BALF 'de farelerden Pro-inflamatuar sitokin konsantrasyonları üreticinin talimatlarına göre ELıSA kitleri kullanılarak değerlendirilmelidir.- Coat 96 iyi ELISA plaka ile 100 μL/Well farklı yakalama antikor çalışma çözümü standartları çalıştırmak için yinelenen ve numuneler triplicate. Plakayı mühürleyin ve 4 °C ' de gece bırakın.
- 255 μL/kuyu yıkama tamponu (1x PBS, 0,05% Tween-20) ile plakayı üç kez yıkayın.
- Nonspesifik bağlamayı engellemek için 200 μL/Well seyreltilme ekleyin. Plakayı mühürleyin ve oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca inküye yapın.
- Standart çözüm hazırlayın: 8 2-1000 pg/mL 'den gelen seri dilüsyonları katlayın.
- 100 μL/Well standartlarının veya numunelerin uygun kuyulara ve 100 μL/Well 'e boş kuyuların seyreltilme değerini ekleyin. Plakayı mühürleyin ve RT 'de 2 h veya gece 4 °C ' de Inküye yapın.
- 255 μL/Well yıkama tamponunun bulunduğu plakası 5x ile yıkayın.
- 100 ekleyin μL/Well farklı algılama antikor çalışma çözeltisi uygun kuyuları için. Plakayı mühürleyin ve RT 'de 1 saat boyunca inküye yapın.
- 255 μL/Well yıkama tamponunun bulunduğu plakası 5x ile yıkayın.
- Tüm kuyuları için seyreltilmiş HRP çözeltisi 100 μL/Well ekleyin. Plakayı mühürleyin ve 30 dakika boyunca RT 'de inküye yapın.
- 255 μL/Well yıkama tamponunun bulunduğu plakası 5x ile yıkayın.
- 100 μL/Well seyreltilmemiş TMB solüsyonu ekleyin. Plakayı RT 'de 15 dakika boyunca ışıktan uzak bir şekilde atın.
- 50 μL/Well durdurma çözümünü ekleyin (1 M H3Po4). Bir plaka okuyucusu ile 450 nm 'de emici okuyun.
- Akış sitometri
- BALF hücre toplam sayısını elde. ACK parçalanması tampon kullanarak eritrositler Lyse ve PBS kullanarak 2x yıkayın.
- Daha önce11açıklandığı gibi akış sitometri tarafından tek hücreli süspansiyonları analiz edin. Yüzey boyama, leke nötrofiller (CD11b + GR-1 +) APC Anti-fare CD11b ve anti-Mouse gr-1 (ly-6G/ly-6C) antikorlar için. Analiz için en az 3 x 104 canlı, enkaz olmayan hücreler toplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deneysel tasarıma ve prosedürlere bağlı olarak C57BL/6 fareler CLP 'ye maruz kalmıştır ve 3 gün sonra intranasal bakteri uygulanmıştır (Şekil 1). Şekil 2' de gösterildiği gibi, fareler peritonitin indüksiyonunda ~ 12 h 'de ölmeye başladı. CLP + sa grubunda iki fare ve CLP + NS grubunda üç fare intranazal S. aureus instıtasyon öncesinde öldü. Enfekte olmayan veya sahte farelerde mortalite saptanmadı. Bu nedenle, fareler pnömoni önce CLP vardı, mortalite çok daha yüksektir (p < 0,05). İntranazal bakteri zorluk (1 x 107 CFU) sonra, sekiz fareler üç SA ve Sham + sa gruplarında hayatta ve dört sekız fareler CLP + NS grubunda hayatta. Ancak, tüm sekiz fareler CLP + SA grubunda öldü. Buna karşılık, CTRL grubunda ve Sham + NS grubundaki her fare kurtuldu. CLP fareler daha sonra S. aureus ile meydan okuyan daha fazla mortalite gösterdi. CLP 'den sonra S. aureus 'un mortalite (% 100) tek başına enfekte (% 37,5) daha yüksektir veya S. aureus (37,5%; p < 0,05).
Şekil 3' te görüldüğü gibi, CLP sonrası hayvanlarda şiddetli çekum nekrozu gözlenmiştir, ancak daha çok çift isabet grubundan (CLP + sa). Ancak, kontrol içinde çekum veya bakteri grupları ile tek isabet brüt değişiklik yoktu. Kan, BALF, ve PLF S. aureus 3 gün sonrası CLP ile enfekte fareler akciğer bakteriyel boşluk değerlendirmek için Kültürlenmiş. Bu yüksek insellik, Sham fareler (p < 0,05 ile kıyaslandığında CLP farelerinin kan ve PLF 'inde S. aureus CFU 'yu önemli ölçüde artırdı; Şekil 4A,C). Kandaki S. aureus CFU ve CLP + sa FARELERININ BALF sayısı CLP + NS farelerine göre belirgin derecede büyüktür (p < 0,01; Şekil 4A,B).
Pro-enflamatuar sitokinler için, sonuçlar, serum IL-1β, IL-6 ve TNFα ' nın ifade düzeylerinin, sepsis-hayatta kalan farelerde bakteriyel itilme sonrası 24 saat içinde, tek başına CLP veya sahte çalışan Fareler S. aureus (Şekil 5A) ile meydan okudu. Ancak, Pro-inflamatuar sitokinler sekonder enfeksiyon ile septik fareler BALF biraz arttı, kontrol enfekte fareler (SA fareler) ve Sham + SA farklı. Bu arada, Çift hit fareler, hem SA hem de Sham + SA farelerine kıyasla BALF Il-1β, IL-6 ve TNFα düzeylerinde önemli ölçüde azalma sergiledi (p < 0,001; Şekil 5B).
Şekil 6' da görüldüğü gibi, enfeksiyon sonrası 24 saat içinde fareler feda EDILDI ve Balf 'deki bağıl nötrofil yüzdesi Akış sitometrisi ile tespit edildi. Çift vuruş fareler, BALF 'deki nötrofiller üzerinde önemli bir azalma sergilemiş ve tek başına S. aureus pnömoni uygulanan farelere kıyasla. Bu veriler toplu olarak CLP 'nin ana bağışıklık yanıtlarının zarar gösterdiğini gösterdi ve bu da ikincil bakteriyel pnömoni için artan duyarlılık elde etmiştir.
Şekil 1 : Deneysel tasarım. Fareler rastgele altı gruba ayrıldı. İki grup, D0 'de çekal ligasyon ve delinme (CLP) yapıldı ve diğerleri sahte olarak işletilen veya ameliyat edilmedi. Ameliyattan üç gün sonra (D3), S. aureus [SA, 1 x 107 koloni şekillendirme üniteleri (CFU)] veya normal tuz (NS) intranasally uygulandı. Kontrol grubu (Ctrl) fareler intranasal instile değildi. Kan, Bronkoalveoler Lavaj sıvısı (Balf), ve periton lavaj sıvısı (PLF) bir bakteri sayımı tahlil için sa enjeksiyon sonra 24 saat hasat edildi. Her grupta ölüm oranı 7 gün boyunca hayatta kalma analizi için gözlenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Fare hayatta kalma. C57BL/6 fareler ya CLP veya Sham ameliyatı için gönderilen S. aureus (SA) veya normal tuz (NS) ameliyattan sonraki üçüncü gün (grup başına n = 8 fare). Fareler 7 gün boyunca izleniyor ve mortalitesi, Sham + SA fareler ve SA fareler ile karşılaştırıldığında her 12 h. Kaplan-Meier hayatta kalma eğrileri, log-Rank testi (* p < 0,05) kaydedildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 : Fare çekum. İkincil enfeksiyon 3 gün CLP sonrası indüklenmiş. SA enfeksiyonu sonrası 24 saat, kolon dokularının toplanması için fareler feda edildi. Farklı yaralanma çarpması altında çekal ligasyon temsili fotoğraflar gösterilir. SA = S. aureus; NS = normal tuzlu; CLP = çekal ligasyon ve delinme. Ölçek çubuğu = 1 cm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Bakteriyel sayılar ve agar plakaları temsili görüntüler. Ameliyattan 3 gün sonra fareler intranasal S. aureus (SA) 1 x 107 CFU (grup başına n ≥ 3 fare) ile aşılıyorlardı. SA enjeksiyonu sonrasında 24 saat kan, BALF ve PLF hasat edildi ve 24 h İnkübasyon sonrasında bakteriyel koloni sayıları belirlendi. Sonuçlar ortalama ± SEM olarak ifade edilir. tek yönlü ANOVA (Tukey 's Post Hoc; * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; NS = önemli değildir). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : ELISA, sitokin salgılanmasını algılar. İkincil enfeksiyon 3 gün CLP sonrası indüklenmiş. SA enfeksiyonunun ardından farelerden Il-1β, IL-6, ve TNFα serum (A) ve Balf (B) konsantrasyonları (grup başına n ≥ 3 fare). Veriler üç deney ortalaması ± SEM olarak sunulmaktadır. Tek yönlü ANOVA (Tukey 's Post Hoc; * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * * p < 0,0001; NS = önemli değil). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6 : Nötrofil penetrasyon temsili sıklığı. intranazal enfeksiyondan sonra 24 saat, BALF (grup başına n ≥ 3 fare) elde etmek için fareler feda edildi. Nötrofiller yüzdesi (CD11b+, gr-1+) akış sitometri tarafından nicelik ve üç deney ± SEM anlamına gelir olarak gösterilir. Tek yönlü ANOVA (Tukey 's Post Hoc; * * * * p < 0,0001; NS = önemli değil). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sepsis araştırması için altın standart model olarak, CLP, laparotominin neden olduğu doku travması, çekumun bağlanması nedeniyle nekroz ve translokasyon ile peritonitin neden olduğu mikrobiyal sızıntı sonucu enfeksiyon gibi üç hakaret kombinasyonu vardır. kan içine bakteri8. Bu nedenle, CLP insan sepsis karmaşıklığı diğer birçok modellerden daha iyi taklit. Ancak, mevcut CLP modelinin büyük bir sınırlaması, yoğun bakım alanındaki hastalarda görülen sepsis 'in daha uzun süreli aşamasını yansıtamamasıdır3,4,5. Bu nedenle, klinik olarak alakalı çift model (çift isabet modeli) sepsis gecikmiş mortalite yansıtmak ve pulmoner ikincil enfeksiyon altta yatan mekanizmaları araştırmak için önerilmiştir. Bu protokolde sepsis, CLP 'ye CLP sonrası 3 gün içinde S. aureus akciğer enfeksiyonu ile birleştirilerek indüklenmiş oldu. İki hit fareler daha yüksek mortalite, şiddetli çekum hasarı, zayıflamış kan, BALF bakteri boşlukları, düşük Pro-enflamatuar sitokinler ve BALF 'de düşük nötrofiller sergiledi. Bu, kliniklerde immünzatik bastırma durumunu taklit eden şiddetli sepsis ile sonuçlandı.
Aşağıdaki açıklamalar kritik adımlara sahiptir. Ayrıntılı olarak gösterildiği gibi aynı koşullarda alt ölümcül sepsis üretmektir. İlk olarak, dişi fareler, Erkek fareler11' den daha CLP 'ye karşı daha dayanıklıdır çünkü kadın fareler kullanıldı. İkinci olarak, CLP kaynaklı mortalite, çekum bağlanması, iğne büyüklüğü ve çekal delikli9sayısı gibi çeşitli teknik parametrelere bağlıdır. Çekum yaklaşık% 75 ligasyon şiddetli sepsis indükler, çekum% 60 ligasyon orta seviye sepsis indükler ve% 25 veya daha az küçük sepsis çekum sonuçları ligasyon9. Alt öldürücü sepsis11,12' ye sebep olmak için hafif bir CLP (% 25, 21 G 1 1/2 iğne ile tek through-ve-Through delinme) gerçekleştirerek modeli standartlaştırmak etmek için seçilmiştir. Üçüncü olarak, sıvı resüsitasyon dolaşım çöküşü nedeniyle şok ve hızlı ölüm önlemek için tavsiye edilir ve daha yakından insan sepsis hemodinamik profil taklit bir Hiperdinamik hayvan sepsis modeli geliştirmek13. Ayrıca, buprenorfik gibi analjeziklerin kullanımı, deneysel ve etik açıdan10dikkate alınmalıdır.
Üç günlük CLP sonrası, sekonder enfeksiyonun sepsis bağışıklık bastırıcı aşamasını yansıtmak için bir zaman noktası olarak seçildi. Sepsis ile çoğu hasta çoğu ölüm 3 gün ötesinde meydana gelen bir uzun süren hastane kursu var, ve daha sonra ikincil hastane elde pnömoni içine girmek, sürekli olarak CLP ile birlikte yeni bir çalışmada gösterilen P. aeruginosa14 . Diğer laboratuvarlardan önceki sonuçlar aynı zamanda CLP 'den 3 gün sonra, farelerin ikincil aşırı bakterilere yüksek hassasiyet gösterdiğini ve enfeksiyondan bir gün sonra, aşırı inflamasyondan bağışıklık bastırma15' e kadar dönüm noktası olduğunu göstermektedir. 16 yaşında.
Buna ek olarak, bakteri suşları ve dozajı farklılıklar ikili modelde değişkenlik neden önemli faktörlerdir. Gerginlik ve doz düzeylerinin seçilmesi, immünosupresif durum sırasında ikincil enfeksiyonun deneysel tasarımının ihtiyaçlarına dayanır. Önceki bulgulara dayanarak, bu çalışmada 1 x 107 CFU S. aureus seçildi.
Doğrudan fare akciğerleri içine intranazal bakteriyel teslimat verimliliğini artırmak için, dikkat instıtma hacmi, zaman ve vücut konumuna ödenmesi gerekir. Denemenin sonucunu son derece etkileyebilecek diğer operasyonel konular da vardır. Bu fare dik tutarak, birden fazla düşük doz bakteri sıvı her iki burun delikleri ayrı her instılasyon sırasında yönetmek, kabarcıkları oluşturmadan sıvı inhalasyonu izlerken, inhalasyon hızını kontrol içerir; hızlı bir şekilde aşağı yavaş aşağı fare hareket, ve bir 45 ° açı fare Döşeme ınbrilasyon kurtarmak için. İntranasal bakteri yönetimi noninvaziv ve boğulma önlemeye yardımcı olur, erişilebilirlik artırmak, güvenliği artırmak, ve cerrahi yaralanmaları en aza indirmek.
Ancak, bu yöntemin sınırlamaları vardır. Bu bir metodolojik çalışma olduğu için, veri klinik belirtiler değişiklikleri tartışıldı değil; Anti-inflamatuar sitokinler; ve miktarı ve monocytes, nötrofiller ve lenfositler kan işlevi. Laboratuar fareler genellikle inbred, benzer yaş ve ağırlıkları var, belirli patojen içermeyen tesislerinde barındırılır, ve yaygın olarak önceden mevcut immünorpresyon gibi komilbidite yok. Yine de, farklı cinsiyet, yaş, bağışıklık ve beslenme durumu ve hastaların antibiyotikler gibi olası adjuvan tedavi heterojen klinik sonuçlara neden olabilir. İnsan hastalarının heterojenitesi göz önüne alındığında, yaş, ağırlık, önceden mevcut hastalıklar ve klinik destekleyici bakım gibi değişkenler dikkatle izlenmelidir.
Bu çift modelin gelişimi (çift hit modeli) zaman ve enfeksiyon ve bağışıklık araştırma topluluğu için önemli çünkü hiper-insan sepsis hipo-inflamatuar faz ilerlemesine benzer. Sepsis hastalarında ikincil nozokomiyal pnömoni genel klinik senaryosunu daha doğru şekilde yansıtır. Bu model, sepsis kaynaklı bağışıklık bastırma için yeni terapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar faiz hiçbir mali çatışmalar var.
Acknowledgments
Bu çalışma sağlık hibe R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01 ve AI097532-01A1 ulusal Enstitüleri tarafından M. W için desteklenmektedir Kuzey Dakota Üniversitesi temel tesisleri NıH hibe (ıNBRE P20GM103442 ve COBRE P20GM113123) tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma Ayrıca Çin Ulusal doğa bilimi Vakfı (81530063) Jianxin Jiang için anahtar programı tarafından desteklenmektedir. Fon ders çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayınlama kararı ya da el yazması hazırlık rolü yoktu. Biz Marvin Leier (kırsal Sağlık Merkezi, Kuzey Dakota Üniversitesi) video yapmak için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Delano, M. J., Ward, P. A. The immune system's role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome. Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).
- Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C.
- Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
- Reinhart, K., et al. Recognizing Sepsis as a Global Health Priority - A WHO Resolution. The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
- Boomer, J. S., et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure. JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).
- Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis? Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34 (3), 250-260 (2010).
- He, S., et al. Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice. PLoS Pathogens. 12 (7), 23 (2016).
- Pu, Q. Q., et al. Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis. Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).
- Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).
- Chin, W., et al. A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset. Nature Communications. 9 (1), 917 (2018).
- Nascimento, D. C., et al. IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population. Nature Communications. 8, 14919 (2017).
- Deng, D., et al. Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics. International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).
