Summary
Ce protocole décrit des techniques pour mesurer les résultats infectieux sous-jacents aux infections secondaires nosocomiales dans l'état immunosuppresseur, d'abord en établissant des souris de ligature de cecal/perforation, puis en les défiant avec l'infection intranasale à créer un modèle cliniquement pertinent de septicémie d'immunosuppression.
Abstract
La septicémie, une infection grave et compliquée représentant un danger pour la vie, se caractérise par un déséquilibre entre les réponses pro et anti-inflammatoires dans plusieurs organes. Avec le développement de thérapies, la plupart des patients survivent à la phase hyperinflammatoire mais progressent vers une phase immunosuppressive, qui augmente l'émergence d'infections secondaires. Par conséquent, une meilleure compréhension de la pathogénie sous-jacente aux infections secondaires nosocomiales dans la phase immunosuppressive pendant le septicémie est d'une importance énorme. Rapporté ici est un modèle pour tester les résultats infectieux en créant des infections à double coup chez les souris. Une procédure chirurgicale standard est utilisée pour induire la péritonite polymicrobienne par ligature et perforation célérique (CLP) et suivie d'une infection intranasale de Staphylococcus aureus pour simuler la pneumonie se produisant dans la suppression immunitaire qui est fréquemment vu chez les patients septiques. Ce modèle double peut refléter l'état immunosuppresseur se produisant dans les patients présentant le sepsis prolongé et la susceptibilité à l'infection secondaire de la pneumonie nosocomial. Par conséquent, ce modèle fournit une approche expérimentale simple pour étudier la pathophysiologie de la pneumonie bactérienne secondaire induite par la septicémie, qui peut être utilisée pour découvrir de nouveaux traitements pour la septicémie et ses complications.
Introduction
La septicémie initie un jeu complexe des processus pro-inflammatoires et anti-inflammatoires de l'hôte et se caractérise par une réponse hyperinflammatoire et un dysfonctionnement immunitaire subséquent1,2. La septicémie représente une priorité mondiale en matière de santé et cause un nombre élevé de décès dans les unités de soins intensifs (USI)3. L'incidence de la septicémie est estimée à plus de 30 millions de cas dans le monde par an, avec des taux de mortalité aussi élevés que 30% malgré les progrès dans la gestion des soins intensifs4,5. En 2017, l'Organisation mondiale de la Santé a adopté une résolution visant à améliorer la prévention, le diagnostic et la prise en charge de cette maladie mortelle5. Cependant, des études récentes ont montré que la mort ne résulte pas d'une infection primaire chez les patients septiques graves, mais plutôt d'une infection nosocomiale secondaire (en particulier la pneumonie) causée par l'immunosuppression6,7 . Par conséquent, la compréhension des mécanismes de pourquoi les patients septiques développent l'infection secondaire et découvrant des traitements plus efficaces sont urgentes. Ici, un modèle double, également connu sous le nom d'un modèle à double coup, pour étudier le phénomène immunosuppresseur se produisant dans les patients présentant le sepsis prolongé est décrit.
Comme modèle expérimental de référence dans la recherche sur la septicémie polymicrobienne, la ligature et la ponction célérique (CLP) est une chirurgie caractérisée par la ligature et la perforation du cœur, qui contribue à la péritoite polymicrobienne et à la septicémie8,9 . Le processus pathophysiologique et les profils de cytokine, ainsi que la cinétique et l'ampleur, sont semblables à la septicémie clinique. La position de la ligature, la taille de l'aiguille utilisée pour la ponction et le nombre de cils sont des facteurs majeurs qui influent sur la mortalité après le PCL.
La pneumonie nosocomiale est la principale cause de mortalité parmi les patients gravement malades présentant le sepsis. Le principal type d'organismes à l'origine d'une septicémie sévère comprend Staphylococcus aureus (20,5 %), les espèces de Pseudomonas (19,9 %), les entérobactéries (principalement E. coli, 16,0 %) et les champignons (19 %). Pendant ce temps, des études récentes ont suggéré une incidence croissante d'organismes gram-positifs, qui sont maintenant presque aussi fréquents que les infections gram-négatives3.
La méthode décrite dans ce protocole implique CLP, exécuté comme « premier coup » pour induire la péritonisite polymicrobienne sublétale, qui manifeste une condition d'immunosuppression. La procédure implique également l'instillation intranasale ultérieure de S. aureus comme « deuxième coup » pour fournir une plate-forme de recherche médicalement pertinente.
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Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été exécutées conformément au National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux des animaux de l'Université du Dakota du Nord (IACUC).
1. Ligature et perforation de cecal
REMARQUE : Les souris femelles C57BL/6 (poids, 18-22 g ; âge, 6-8 semaines) sont aléatoirement divisées en six groupes : groupe témoin (Ctrl), groupe d'infection (SA pour S. aureus),deux groupes de faux, et deux groupes de CLP. Les animaux de Ctrl sont laissés sans chirurgie et dommages secondaires d'infection. Les animaux SA sont soumis à l'infection pulmonaire De S. aureus sans l'opération. Les animaux opérés par Faux subissent la même laparotomie avec une exposition du cecum (sauf que le cecum n'est ni ligaté ni perforé). Huit souris par groupe sont utilisées pour l'analyse de survie, et trois à cinq souris sont utilisées pour l'évaluation de l'inflammation à divers points de temps.
- Avant la chirurgie, stériliser tous les instruments et matériaux chirurgicaux en autocliquant pendant 20 min. Nettoyer et désinfecter la table d'opération avec des lingettes désinfectantes. Pour établir des conditions stériles pendant la chirurgie, couvrez les champs opératoires entiers avec les rideaux chirurgicaux stériles appropriés, et portez une couverture de cheveux, un masque chirurgical, des lunettes protectrices, la robe chirurgicale, et les gants stériles.
- Peser et anesthésier la souris à l'aide de 0,1 mL/souris de kétamine (80 mg/kg), de xylazine (10 mg/kg) de mélange administré par voie intrapéritontion. Avec le pouce et l'index de la main gauche formant une position en U, approchez le cou de la souris par derrière en douceur et doucement, puis maintenez le cou immédiatement derrière les oreilles de sorte que la tête de souris est très retenue. Utilisez un pinky pour tenir la jambe arrière droite de la souris et utiliser les doigts du milieu et de l'anneau (tous les doigts de la main gauche) pour tenir le corps.
- Vérifier l'intensité de l'anesthésie par pincement d'orteil jusqu'à ce qu'il n'y ait pas de flexion de l'extrémité.
- Raser les quadrants inférieurs de l'abdomen à l'aide d'un rasoir électrique et désinfecter la zone avec de l'iode.
- Placez la souris sur la surface stérile en position supinée, la tête s'éloignant de l'opérateur. Drapez la souris avec la serviette stérile avec le trou au-dessus de l'incision chirurgicale prévue pour maintenir des champs stériles.
- Faire une incision longitudinale de la peau (environ 0,5 cm de long) avec un scalpel dans le bas-ventre gauche. Utilisez de petits ciseaux pour prolonger l'incision (1-2 cm).
CAUTION: Veillez à ne pas pénétrer dans la cavité péritonéale. - Faire l'incision intramusculaire pour accéder à la cavité péritonéale et permettre l'exposition du cecum avec l'intestin adjacent.
- Isoler le cecum sur le côté gauche de l'abdomen (dans la plupart des cas, cela se fait en utilisant des forceps anatomiques émoussés) et l'enlever sur un drapé stérile, laissant les petits et grands intestins dans la cavité péritonéale.
CAUTION : Évitez d'endommager les vaisseaux sanguins mésentériques. - Ligate le cecum à la position distale 25% pour créer une infection prolongée avec une mortalité relativement faible.
CAUTION: Assurez-vous de ne pas liguer la valve iléocecal. - Perforer le cecum avec une aiguille de 21 G 1 1/2 par perforation simple à travers et à travers (deux trous) à mi-chemin entre la ligature et la pointe du cecum à la zone la moins vascularisée.
CAUTION : Assurez-vous de ne pas perforer les vaisseaux sanguins. - Retirez l'aiguille. Extrudez délicatement une petite quantité d'excréments des trous de pénétration pour assurer la perforation de pleine épaisseur.
CAUTION: Veillez à ne pas obstruer la continuité intestinale pendant la procédure. - Remplacer le cecum dans la cavité abdominale.
- Fermez l'abdomen en deux couches avec 4-0 sutures chirurgicales en nylon. Fermez la musculature abdominale en appliquant de simples sutures en cours d'exécution et fermez la peau en appliquant de simples sutures interrompues. Nettoyer la peau avec de l'iode.
- Injecter 1 ml de solution saline normale (NS) pré-chauffée (37 oC) et de 0,9 % stérile sur le dos sous-cutanée pour remplacer la troisième perte d'espace et la placer sur un coussinet chaud pour récupérer.
- Remettre les souris en cage dans une pièce à température contrôlée (22 oC) avec des cycles clair/obscurité de 12 h et un accès gratuit à la nourriture et à l'eau. Surveillez les souris toutes les 0,5 heures pendant au moins 2 h, puis toutes les 6 heures pendant au moins 2 d, puis toutes les 12 heures pendant 3 jours, ou euthanasiez-les lorsqu'elles sont moribondes pour une analyse de survie.
REMARQUE : L'analgésie pré- et postopératoire (buprénorphine, 50 g/kg sous-cutanée toutes les 12 h) est recommandée pendant 24 h avant la chirurgie jusqu'à 48 h après la chirurgie9,10.
2. Infection pulmonaire secondaire avec S. aureus
REMARQUE : À l'exception des groupes Ctrl et SA, les souris survivantes à 3 jours après CLP dans les groupes de faux et de CLP devraient être administrées intranasally avec 30 l d'une suspension bactérienne ou NS, respectivement. Les souris survivantes dans le groupe de SA devraient être instillées intranasally avec la suspension bactérienne.
- Anesthésiez la souris en injectant par voie intrapéritontone de 100 L solution de kétamine (45mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) et attendez que la souris respire lentement. L'angle de perforation entre l'aiguille et la paroi abdominale est inférieur à 30 degrés pour une injection lente.
- À l'aide d'une micropipette, instiller lentement et intranasalement avec 30 L de 1 x 107 unité de formation de colonie (CFU) de S. aureus à aspirer sur l'inhalation. Tenir la souris par les oreilles en position verticale, déposer lentement 2-3 L de suspension bactérienne dans les deux narines à chaque fois. Ajuster le taux de libération pour permettre à la souris d'inhaler sans former de bulles et de tomber.
- Levez la souris de haut en bas, la tête en haut et la queue vers le bas, pour aider les bactéries à entrer dans la trachée. Déplacez la souris vers le haut rapidement et fortement, tout en la déplaçant vers le bas doucement et lentement pour augmenter la gravité. Répéter l'instillation environ 15x jusqu'à ce que toutes les bactéries sont inhalées, ce qui devrait prendre 10-15 min pour chaque souris.
- Poser la souris sur le dos et la tête vers le haut sur la literie inclinée (environ 35 degrés) et regarder la souris jusqu'à ce que sa respiration revient à la normale et il est complètement récupéré de l'anesthésie et les procédures.
- Remettre la souris dans la cage dans une pièce à température contrôlée (22 oC) avec des cycles de lumière/obscurité de 12 h et un accès illimité à la nourriture et à l'eau.
- Vérifiez les conditions de la souris toutes les 2 heures pour le premier jour et toutes les 12 heures après pendant 4 jours après la chirurgie. Euthanasez-les lorsqu'ils sont moribonds pour une analyse de survie ou 24 h après l'infection pour l'évaluation de l'inflammation.
3. Paramètres analysés
- Survie des souris
- Surveillez les souris pendant 7 jours. Euthanasier quand moribond et générer des courbes de survie en utilisant les méthodes Kaplan-Meier11.
- Nombres de bactéries
- 24 h après injection de SA, récolter le sang, le liquide de lavage bronchoalveolar (BALF), et le liquide de lavage péritonéal (PLF) des souris. Par la suite, ajoutez 100 L des diluants aux plaques d'agar nutritifs et les culturez à 37 oC pendant 24 h pour déterminer les comptes de la colonie bactérienne11,12,13.
- Cytokines
REMARQUE : Les concentrations pro-inflammatoires de cytokine d'IL-1, d'IL-6 et de TNFMD chez les souris et le sérum devraient être évaluées à l'aide de kits ELISA selon les instructions du fabricant.- Enrober la plaque ELISA 96 bien avec 100 L/puits de différentes solutions de travail d'anticorps de capture pour exécuter les normes en double et des échantillons en triple. Scellez la plaque et laissez-la toute la nuit à 4 oC.
- Laver la plaque trois fois avec 255 l/tampon de lavage de puits (1x PBS, 0,05% Tween-20).
- Pour bloquer la liaison non spécifique, ajoutez 200 Diluants l/puits. Sceller la plaque et l'incuber à température ambiante (RT) pendant 1 h.
- Préparer la solution standard : Huit dilutions en série doubles à partir de 1000 pg/mL.
- Ajouter 100 l/puits de normes ou d'échantillons aux puits appropriés et 100 l/puits de diluant aux puits vierges. Scellez la plaque et incuber à RT pendant 2 h ou toute la nuit à 4 oC.
- Laver la plaque 5x avec 255 l /bien tampon de lavage.
- Ajoutez à 100 L/puits une solution de travail d'anticorps de détection différente aux puits appropriés. Sceller la plaque et l'incubation à RT pendant 1 h.
- Laver la plaque 5x avec 255 l /bien tampon de lavage.
- Ajoutez à tous les puits une solution HRP diluée de 100 L/puits. Sceller la plaque et l'incubation à RT pendant 30 min.
- Laver la plaque 5x avec 255 l /bien tampon de lavage.
- Ajouter une solution TMB diluée de 100 L/l. Incuber la plaque loin de la lumière à RT pendant 15 min.
- Ajouter 50 L/bien solution d'arrêt (1 M H3PO4). Lire absorbance à 450 nm avec un lecteur de plaque.
- Cytométrie de flux
- Obtenir le nombre total de cellules de BALF. Lyse les érythrocytes à l'aide de tampon de lysing ACK et laver 2x à l'aide de PBS.
- Analyser ensuite les suspensions unicellulaires par cytométrie de flux comme décrit précédemment11. Pour la coloration de surface, tacher les neutrophiles (CD11b-GR-1MD) avec des anticorps Anti-souris APC CD11b et anti-souris Gr-1 (Ly-6G/Ly-6C). Recueillir un minimum de 3 x 104 cellules vivantes, non-débris pour l'analyse.
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Representative Results
Selon la conception et les procédures expérimentales, les souris C57BL/6 ont été soumises au CLP, et après 3 jours, elles ont été administrées des bactéries intranasally (figure 1). Comme le montre la figure 2, les souris ont commencé à mourir à 12 h après l'induction de la péritoyte. Deux souris dans le groupe de CLP-SA et trois souris dans le groupe de CLP-NS sont mortes avant l'instillation intranasale de S. aureus. Aucune mortalité n'a été détectée chez les souris non infectées non ou simulées. Par conséquent, lorsque les souris avaient CLP avant la pneumonie, la mortalité était beaucoup plus élevée (p'lt; 0.05). Après défi de bactéries intranasales (1 x 107 CFU), trois des huit souris ont survécu dans les groupes de SA et de Sham-SA, et quatre de huit souris ont survécu dans le groupe de CLP-NS. Cependant, chacun des huit souris est morte dans le groupe de CLP-SA. En revanche, chaque souris du groupe Ctrl et du groupe Sham-NS ont survécu. Les souris de CLP ont montré plus de mortalité une fois plus défiées avec S. aureus. Mortalité de S. aureus après CLP (100%) était plus élevé que le seul infecté (37,5 %) ou S. aureus après une imposture (37,5%; p et lt; 0,05).
Comme le montre la figure 3, on a observé une nécrose grave du caecum chez les animaux post-CLP, mais plus encore dans le groupe à double coup (CLP-SA). Cependant, il n'y a eu aucun changement brut du cecum dans le contrôle ou un seul coup avec des groupes de bactéries. Le sang, le BALF, et le PLF ont été cultivés pour évaluer le dégagement bactérien de poumon des souris infectées par S. aureus 3 jours après CLP. Cette létalité élevée a été associée à l'augmentation significative de S. aureus CFU dans le sang et le PLF des souris de CLP comparés aux souris de faux (p'lt ; 0.05 ; Figure 4A,C). Le nombre de S. aureus CFU dans le sang et de BALF des souris CLP-SA était nettement plus grand que les souris CLP-NS (p-lt; 0.01 ; Figure 4A,B).
Pour les cytokines pro-inflammatoires, les résultats ont montré que les niveaux d'expression du sérum IL-1, IL-6 et TNF ont augmenté de manière significative à 24 h après instillation bactérienne chez les souris survivantes à la septicémie par rapport aux souris qui ont subi le CLP seul ou à la fausse souris défiées avec S. aureus (Figure 5A). Cependant, les cytokines pro-inflammatoires ont augmenté légèrement dans BALF des souris septiques avec l'infection secondaire, différent de ceux dans les souris contrôlées -infectées (souris de SA) et Sham-SA. Pendant ce temps, les souris à double coup présentaient des niveaux significativement diminués dans les niveaux de BALF IL-1, IL-6 et TNFMD par rapport aux souris SA et Sham-SA (p et lt; 0,001; Figure 5B).
Comme indiqué dans la figure 6, les souris ont été sacrifiées à 24 h après l'infection, et le pourcentage relatif de neutrophiles dans BALF ont été détectés par cytométrie d'écoulement. Les souris à double coup ont montré une réduction significative des neutrophiles dans le BALF comparé aux souris qui ont subi la pneumonie de S. aureus seule. Collectivement, ces données ont prouvé que CLP altère les réponses immunitaires d'hôte, ayant pour résultat la susceptibilité accrue à la pneumonie bactérienne secondaire.
Figure 1 : Conception expérimentale. Les souris ont été divisées au hasard en six groupes. Deux groupes ont subi la ligature et la ponction de cecal (CLP) à D0, et les autres ont été immulables ou n'ont pas fonctionné. Trois jours après chirurgie (D3), S. aureus [SA, 1 x 107 unités formant la colonie (CFU)] ou saline normale (NS) a été administrée intranasalement. Les souris du groupe témoin (Ctrl) n'ont pas été inculquées intranasalement. Le sang, le liquide de lavage bronchoalveolar (BALF), et le fluide péritonéal de lavage (PLF) ont été moissonnés 24 h après injection de SA pour un test de compte de bactéries. Le taux de mortalité dans chaque groupe a été observé au cours de 7 jours pour l'analyse de survie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Survie de la souris. Les souris de C57BL/6 soumises à la chirurgie de CLP ou de faux ont reçu S. aureus (SA) ou salin normal (NS) le troisième jour après chirurgie (n - 8 souris par groupe). Les souris ont été surveillées pendant 7 jours, et la mortalité a été enregistrée tous les 12 h. Courbes de survie Kaplan-Meier, test de rang de journal (p et lt; 0,05) par rapport aux souris Sham-SA et souris SA. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Cecum de souris. L'infection secondaire a été induite 3 jours après CLP. 24 h après infection de SA, les souris ont été sacrifiées pour recueillir des tissus de deux points. Les photos représentatives de la ligature des cécalsous par différents coups de blessure sont montrées. SA et S. aureus; NS - salin normal; Ligature et perforation de CLP et de cecal. Barre d'échelle de 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Nombres bactériens et images représentatives de plaques d'agar. 3 jours après chirurgie, les souris ont été instillées intranasalement avec 1 x 107 CFU de S. aureus (SA) (n - 3 souris par groupe). Le sang, le BALF et le PLF ont été récoltés 24 h après l'injection de SA, et le nombre de colonies bactériennes a été déterminé après 24 h d'incubation. Les résultats sont exprimés en moyenne - SEM. ANOVA à sens unique (le post hoc de Tukey; 'p'lt; 0.05; 'p 'lt; 0.01; ''p'lt; 0.001; ns '' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : ELISA détection de la sécrétion de cytokine. L'infection secondaire a été induite 3 jours après CLP. Concentrations d'IL-1, il-6 et De TNF mD dans le sérum (A) et BALF (B) chez des souris après l'infection à SA (n - 3 souris par groupe). Les données sont présentées comme la moyenne et le SEM de trois expériences. ANOVA à sens unique (le post hoc de Tukey; 'p'lt; 0.05; 'p 'lt; 0.01; ''p'lt; 0.0001; ns 'pas significatif). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Fréquence représentative de pénétration des neutrophiles. 24 h après infection intranasale, des souris ont été sacrifiées pour obtenir BALF (n - 3 souris par groupe). Le pourcentage de neutrophiles (CD11b,GR-1)a été quantifié par la cytométrie d'écoulement et sont présentés comme des moyens - SEM de trois expériences. ANOVA à sens unique (le post hoc de Tukey; 'p'lt; 0.0001; ns 'pas significatif). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Comme modèle d'étalon-or pour la recherche sur la septicémie, CLP a une combinaison de trois insultes, y compris les traumatismes tissulaires causés par la laparotomie, la nécrose due à la ligature du cècum, et l'infection à la suite de fuites microbiennes qui provoque la péritoyite avec translocation de bactéries dans le sang8. Par conséquent, CLP imite la complexité de la septicémie humaine mieux que beaucoup d'autres modèles. Cependant, une limitation majeure du modèle actuel de CLP est l'incapacité de refléter la phase plus prolongée de sepsis vue dans les patients dans l'USI3,4,5. Par conséquent, un modèle double cliniquement pertinent (modèle à double coup) a été proposé pour refléter la mortalité retardée de sepsis et d'étudier les mécanismes sous-jacents à l'infection secondaire pulmonaire. Dans ce protocole, le sepsis a été induit en combinant CLP avec l'infection de poumon de S. aureus à 3 jours après CLP. Les souris à deux coups ont montré la mortalité plus élevée, les dommages graves de cecum, le sang affaibli, les dégagements de bactéries de BALF, les cytokines pro-inflammatoires inférieurs, et les neutrophiles inférieurs dans BALF. Ceci a eu comme conséquence le sepsis grave, qui imite le statut d'immunosuppression dans les cliniques.
Les descriptions suivantes sont des étapes critiques. Montré en détail est de savoir comment produire une septicémie sublétale dans les mêmes conditions. Tout d'abord, les souris femelles ont été utilisées parce que les souris femelles sont plus résistantes au CLP que les souris mâles11. Deuxièmement, la mortalité induite par le CLP dépend de plusieurs paramètres techniques, tels que la longueur du cecum ligaté, la taille de l'aiguille et le nombre de cils perforés9. La ligature d'environ 75 % du cœur induit une septicémie sévère, la ligature de 60 % du cecum induit une septicémie de niveau moyen et la ligature de 25 % ou moins du cecum entraîne une septicémie mineure9. Il a été choisi pour normaliser le modèle en effectuant un CLP doux (25%, seule perforation à travers et à travers avec une aiguille de 21 G 1 1/2) pour induire une septicémie sublétale11,12. Troisièmement, la réanimation fluide est recommandée pour empêcher le choc et la mort rapide dues à l'effondrement de circulation et pour développer un modèle hyperdynamique de sepsis animal, qui imite plus étroitement le profil hémodynamique de la sepsis humaine13. En outre, l'utilisation d'analgésiques, tels que la buprénorphine, devrait être considérée d'un point de vue expérimental et éthique10.
Trois jours post-CLP ont été choisis comme point de temps pour induire l'infection secondaire pour refléter la phase immunosuppressive du sepsis. La plupart des patients présentant le sepsis ont un cours prolongé d'hôpital avec la plupart des décès se produisant au-delà de 3 jours, et beaucoup entrent alors dans la pneumonie hôpital-acquise secondaire, qui a été uniformément montrée dans une étude récente avec CLP avec P. aeruginosa14 . Les résultats précédents d'autres laboratoires démontrent également que 3 jours après CLP, les souris montrent une sensibilité élevée aux bactéries instillées secondaires, et un jour après l'infection a été le point tournant de la surinflammation à l'immunosuppression15, 16.
En outre, les différences dans les souches bactériennes et la posologie inculquées sont des facteurs importants qui causent la variabilité du double modèle. La sélection des niveaux de tension et de dose est basée sur les besoins de la conception expérimentale de l'infection secondaire pendant l'état immunosuppresseur. Sur la base des résultats précédents, 1 x 107 CFU de S. aureus a été sélectionné pour cette étude.
Pour améliorer l'efficacité de la livraison bactérienne intranasale directement dans les poumons de la souris, une attention doit être accordée au volume d'instillation, le temps et la position du corps. Il y a d'autres questions opérationnelles qui peuvent influencer énormément le résultat de l'expérience. Il s'agit notamment de tenir la souris debout, d'administrer des bactéries à plusieurs doses liquides dans les deux narines séparément pendant chaque instillation, de regarder l'inhalation de liquide sans former de bulles, de contrôler la vitesse d'inhalation; déplacer la souris vers le haut rapidement, puis vers le bas lentement, et la pose de la souris à un angle de 45 degrés pour récupérer de l'instillation. L'administration de bactéries intranasales est non invasive et aide à prévenir l'étouffement, à accroître l'accessibilité, à améliorer la sécurité et à minimiser les blessures chirurgicales.
Cependant, cette méthode a ses limites. Comme il s'agit d'une étude méthodologique, les données n'ont pas été discutées sur les changements des signes cliniques; cytokines anti-inflammatoires; et la quantité et la fonction des monocytes, des neutrophiles, et des lymphocytes dans le sang. Les souris de laboratoire sont souvent consanguines, ont des âges et des poids similaires, sont logées dans des installations spécifiques exemptes d'agents pathogènes et n'ont généralement pas de comorbidités, comme l'immunosuppression préexistante. Néanmoins, le sexe, l'âge, l'état immunitaire et nutritionnel différents, et le traitement adjuvant possible tel que des antibiotiques des patients peuvent avoir comme conséquence des résultats cliniques hétérogènes. Compte tenu de l'hétérogénéité des patients humains, des variables telles que l'âge, le poids, les maladies préexistantes et les soins cliniques de soutien devraient être surveillées attentivement.
Le développement de ce modèle double (modèle à double coup) est opportun et important pour la communauté de recherche sur l'infection et l'immunité, car il ressemble à la progression de la phase hyper-inflammatoire de la septicémie humaine. Il reflète le scénario clinique commun d'une pneumonie nosocomiale secondaire dans les patients présentant le sepsis plus exactement. Ce modèle peut aider à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour l'immunosuppression induite par la septicémie.
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Disclosures
Les auteurs n'ont pas de conflits d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par les National Institutes of Health Grants R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01 et AI097532-01A1 à M. W. Les installations de base de l'Université du Dakota du Nord ont été financées par des subventions des NIH (INBRE P20GM103442 et COBRE P20GM113123). Ce travail a également été soutenu par le programme clé de la National Nature Science Foundation of China (81530063) à Jianxin Jiang. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Nous remercions Marvin Leier (Center for Rural Health, Université du Dakota du Nord) d'avoir fait la vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
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