Summary
Este protocolo describe técnicas para medir los resultados infecciosos subyacentes a las infecciones secundarias adquiridas en el hospital en la condición inmunosupresora, primero estableciendo ratones de ligadura/punción cecal y luego desafiándolos con infección intranasal a crear un modelo clínicamente relevante de la sepsis de inmunosupresión.
Abstract
La sepsis, una infección grave y complicada potencialmente mortal, se caracteriza por un desequilibrio entre las respuestas pro y antiinflamatorias en múltiples órganos. Con el desarrollo de terapias, la mayoría de los pacientes sobreviven a la fase hiperinflamatoria, pero progresan a una fase inmunosupresora, lo que aumenta la aparición de infecciones secundarias. Por lo tanto, la mejora de la comprensión de la patogénesis subyacente a las infecciones hospitalarias secundarias en la fase inmunosupresora durante la sepsis es de enorme importancia. Aquí se informa un modelo para probar los resultados infecciosos mediante la creación de infecciones de doble impacto en ratones. Un procedimiento quirúrgico estándar se utiliza para inducir peritonitis polimicrobiana por ligadura y punción de cecal (CLP) y seguido de infección intranasal de Staphylococcus aureus para simular la neumonía que ocurre en la supresión inmune que se ve con frecuencia en pacientes sépticos. Este modelo dual puede reflejar el estado inmunosupresor que ocurre en pacientes con sepsis prolongada y susceptibilidad a la infección secundaria por neumonía nosocomial. Por lo tanto, este modelo proporciona un enfoque experimental simple para investigar la fisiopatología de la neumonía bacteriana secundaria inducida por sepsis, que puede ser utilizada para descubrir nuevos tratamientos para la sepsis y sus complicaciones.
Introduction
La sepsis inicia una compleja interacción de procesos proinflamatorios y antiinflamatorios delhuésped y se caracteriza por una respuesta hiperinflamatoria y disfunción inmune posterior 1,2. La sepsis representa una prioridad sanitaria mundial y causa un altonúmero de muertes en las unidades de cuidados intensivos (ICU) 3. Se estima que la incidencia de sepsis supera los 30 millones de casos en todo el mundo al año, con tasas de mortalidad de hasta el 30% a pesar de los avances en la gestión de la UCI4,5. En 2017, la Organización Mundial de la Salud adoptó una resoluciónpara mejorar la prevención, el diagnóstico y la gestión de esta enfermedad mortal 5. Sin embargo, estudios recientes han ilustrado que la muerte no es el resultado de una infección primaria en pacientes sépticos graves, sino más bien de una infección nosocomial secundaria (particularmente neumonía) causada por la inmunosupresión6,7 . Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de por qué los pacientes sépticos desarrollan infección secundaria y descubrir tratamientos más eficaces son urgentemente necesarios. En este caso, se describe un modelo dual, también conocido como modelo de doble hit, para estudiar el fenómeno inmunosupresor que se produce en pacientes con sepsis prolongada.
Como el modelo experimental estándar de oro en la investigación sobre sepsis polimicrobiana, ligadura y punción cecal (CLP) es una cirugía caracterizada por ligadura de cecum y perforación, que contribuye a la peritonitis polimicrobiana y la sepsis8,9 . El proceso fisiopatológico y los perfiles de citoquinas, junto con la cinética y la magnitud, son similares a la sepsis clínica. La posición de la ligadura, el tamaño de la aguja utilizada para la punción y el número de pinchazos de cecal son factores principales que afectan la mortalidad después de la CLP.
La neumonía nosocomial es la principal causa de mortalidad entre los pacientes en estado crítico con sepsis. El principal tipo de organismos que causan sepsis graves incluye Staphylococcus aureus (20,5%), pseudomonas (19,9%), Enterobacteriacae (principalmente E. coli, 16,0%) y hongos (19%). Mientras tanto, estudios recientes han sugerido una creciente incidencia de organismos grampositivos, que ahora son casi tan comunes como las infecciones gramnegativas3.
El método descrito en este protocolo implica CLP, realizado como el "primer golpe" para inducir peritonitis polimicrobiana subletal, que manifiesta una condición de inmunosupresión. El procedimiento también implica la posterior inslación intranasal de S. aureus como el "segundo golpe" para proporcionar una plataforma de investigación clínicamente relevante.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí fueron realizados de acuerdo con el Instituto Nacional de La Guía de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Dakota del Norte (IACUC).
1. Ligadura cecal y punción
NOTA: Los ratones hembra C57BL/6 (peso, 18-22 g; edad, 6-8 semanas) se dividen aleatoriamente en seis grupos: grupo de control (Ctrl), grupo de infección (SA para S. aureus),dos grupos falsos y dos grupos CLP. Los animales Ctrl se quedan sin cirugía y lesiones por infección secundaria. Los animales de SA son sometidos a una infección pulmonar por S. aureus sin la operación. Los animales operados por Sham se someten a la misma laparotomía con una exposición del cecum (excepto que el cecum no está ligado ni perforado). Ocho ratones por grupo se utilizan para el análisis de supervivencia, y de tres a cinco ratones se utilizan para la evaluación de la inflamación en varios momentos.
- Antes de la cirugía, esterilizar todos los instrumentos y materiales quirúrgicos mediante autoclave durante 20 min. Limpie y desinfecte la mesa de operación con toallitas desinfectantes. Para establecer condiciones estériles durante la cirugía, cubra todos los campos operativos con cortinas quirúrgicas estériles adecuadas y use una cubierta para el cabello, máscara quirúrgica, gafas protectoras, bata quirúrgica y guantes estériles.
- Pesar y anestesiar el ratón utilizando 0,1 ml/ratón de ketamina (80 mg/kg), mezcla de xilazina (10 mg/kg) administrada por vía intraperitoneal. Con el pulgar y el dedo índice de la mano izquierda formando una posición en forma de U, acércate al cuello del ratón por detrás suavemente y suavemente, luego sostén el cuello inmediatamente detrás de las orejas para que la cabeza del ratón esté muy restringida. Usa un meñique para sostener la pierna trasera derecha del ratón y usa los dedos medios y anulares (todos los dedos de la mano izquierda) para sostener el cuerpo.
- Compruebe la intensidad de la anestesia pellizcando los dedos hasta que no haya flexión de la extremidad.
- Afeitar los cuadrantes inferiores del abdomen usando una maquinilla de afeitar eléctrica y desinfectar la zona con yodo.
- Coloque el ratón sobre la superficie estéril en una posición supina, con la cabeza orientada lejos del operador. Cubra el ratón con una toalla estéril con un agujero sobre la incisión quirúrgica planificada para mantener los campos estériles.
- Hacer una incisión longitudinal de la piel (alrededor de 0,5 cm de largo) con un bisturí en la parte inferior izquierda del abdomen. Utilice tijeras pequeñas para extender la incisión (1-2 cm).
ADVERTENCIA: Tenga cuidado de no penetrar en la cavidad peritoneal. - Hacer la incisión intramuscular para obtener acceso a la cavidad peritoneal y permitir la exposición del cecum con el intestino contiguo.
- Aísle el cecum en el lado izquierdo del abdomen (en la mayoría de los casos, esto se hace mediante el uso de fórceps anatómicos contundentes) y retírelo en una cortina estéril, dejando los intestinos pequeños y grandes en la cavidad peritoneal.
ADVERTENCIA: Evite dañar los vasos sanguíneos mesentéricos. - Ligar el cecum en la posición distal del 25% para crear una infección prolongada con mortalidad relativamente baja.
ADVERTENCIA: Asegúrese de no ligar la válvula ileocecal. - Perforar el cecum con una aguja 21 G 1 1/2 por una sola punción de paso y paso (dos agujeros) a medio camino entre la ligadura y la punta del cecum en el área menos vascularizada.
ADVERTENCIA: Asegúrese de no perforar los vasos sanguíneos. - Retire la aguja. Extruya suavemente una pequeña cantidad de heces de los orificios de penetración para asegurar una perforación de espesor completo.
ADVERTENCIA: Tenga cuidado de no obstruir la continuidad intestinal durante el procedimiento. - Sustituya el cecum en la cavidad abdominal.
- Cierre el abdomen en dos capas con suturas quirúrgicas de nylon 4-0. Cierre la musculatura abdominal aplicando suturas de carrera simples y cierre la piel aplicando suturas interrumpidas simples. Limpie la piel con yodo.
- Inyectar 1 ml de solución salina normal (NS) precalentada (37 oC) al 0,9% en la parte posterior por vía subcutánea para reemplazar la pérdida del tercer espacio y colocarla en una almohadilla caliente para recuperarla.
- Devolver a los ratones en jaula en una sala de temperatura controlada (22 oC) con ciclos de luz/oscuridad de 12 h y acceso gratuito a alimentos y agua. Supervise a los ratones cada 0,5 horas durante al menos 2 horas, luego cada 6 h durante al menos 2 d, luego cada 12 h durante 3 días, o eutanasialos cuando se moribunden para el análisis de supervivencia.
NOTA: Se recomienda la analgesia pre y postoperatoria (buprenorfina, 50 g/kg por vía subcutánea cada 12 h)durante 24 horas antes de la cirugía hasta 48 h después de la cirugía 9,10.
2. Infección pulmonar secundaria con S. aureus
NOTA: A excepción de los grupos Ctrl y SA, los ratones supervivientes a los 3 días posteriores a la CLP en la farsa y los grupos CLP deben administrarse por vía intranasal con 30 oL de una suspensión bacteriana o NS, respectivamente. Los ratones supervivientes en el grupo SA deben ser inculcados por vía intranasal con la suspensión bacteriana.
- Anestetiza el ratón inyectando por vía intraperitoneal una solución de 100 ml de ketamina (45mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) y espera hasta que el ratón respire lentamente. El ángulo de punción entre la aguja y la pared abdominal es inferior a 30o para la inyección lenta.
- Con la ayuda de una micropipeta, inculcar lenta e intranasalmente con 30 l de 1 x 107 unidad formadora de colonias (CFU) de S. aureus que se aspirará al inhalación. Sosteniendo el ratón por sus orejas en posición vertical, cayendo lentamente 2-3 l de suspensión bacteriana en ambas fosas nasales cada vez. Ajuste la velocidad de liberación para permitir que el ratón inhale sin formar burbujas y decaer.
- Levante el ratón hacia arriba y hacia abajo, con la cabeza hacia arriba y hacia abajo, para ayudar a las bacterias a entrar en la tráquea. Mueva el ratón hacia arriba y con fuerza, mientras lo mueve hacia abajo suavemente y lentamente para aumentar la gravedad. Repetir la inspíación alrededor de 15x hasta que todas las bacterias son inhaladas, que debe tomar 10-15 minutos para cada ratón.
- Poner el ratón en su espalda y la cabeza hacia arriba en la ropa de cama en ángulo (alrededor de 35o) y ver el ratón hasta que su respiración vuelve a la normalidad y se recupera por completo de la anestesia y los procedimientos.
- Vuelva a colocar el ratón en la jaula en una sala de temperatura controlada (22 oC) con ciclos de luz/oscuridad de 12 h y acceso ilimitado a alimentos y agua.
- Compruebe las condiciones del ratón cada 2 h durante el primer día y cada 12 h después durante 4 días después de la cirugía. Eutanasiarlos cuando se moribunden para el análisis de supervivencia o 24 h después de la infección para la evaluación de la inflamación.
3. Parámetros analizados
- Supervivencia de ratones
- Supervise a los ratones durante 7 días. Euthanizar cuando moribundy generar curvas de supervivencia utilizando los métodos Kaplan-Meier11.
- Recuentos bacterianos
- 24 h después de la inyección de SA, cosechar la sangre, el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) y el líquido de lavado peritoneal (PLF) de los ratones. Posteriormente, añadir 100 l de diluyentes a las placas de agar nutritivo y cultivarlas a 37 oC durante 24 h para determinar el recuento de colonias bacterianas11,12,13.
- Citoquinas
NOTA: Las concentraciones proinflamatorias de citoquinas de IL-1, IL-6 y TNF en suero y BALF de ratones deben evaluarse utilizando kits ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.- Recubrir la placa ELISA de 96 pocillos con 100 l/pozo de diferente solución de trabajo de anticuerpos de captura para ejecutar los estándares en duplicado y muestras en triplicado. Sellar la placa y dejarla durante la noche a 4oC.
- Lave la placa tres veces con un tampón de lavado de 255 ol/pozo (1pbS, 0,05% de Tween-20).
- Para bloquear la unión inespecífica, agregue un diluyente de 200 l/poc. Sellar la placa e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
- Preparar solución estándar: Ocho diluciones seriales dobles a partir de 1000 pg/ml.
- Añadir 100 l/pozo de normas o muestras a los pozos apropiados y 100 l/pozo de diluyente a los pozos en blanco. Sellar la placa e incubar a RT durante 2 h o durante la noche a 4oC.
- Lave la placa 5x con un tampón de lavado de 255 ml/poc.
- Añadir 100 l/pozo de diferente solución de trabajo de anticuerpos de detección a los pozos adecuados. Sellar la placa e incubar a RT durante 1 h.
- Lave la placa 5x con un tampón de lavado de 255 ml/poc.
- Añadir 100 l/pozo de solución HRP diluida a todos los pozos. Sellar la placa e incubar a RT durante 30 min.
- Lave la placa 5x con un tampón de lavado de 255 ml/poc.
- Añadir una solución tMB diluida de 100 l/pozo. Incubar la placa lejos de la luz en RT durante 15 min.
- Añadir solución de parada de 50 l/pozo (1 M H3PO4). Lea la absorbancia a 450 nm con un lector de placas.
- Citometría de flujo
- Obtenga el número total de celdas de BALF. Lise los eritrocitos usando tampón de lisiado ACK y lavar 2x usando PBS.
- Analice entonces las suspensiones de una sola célula por citometría de flujo como se describió anteriormente11. Para la tinción superficial, tinción neutrófilos (CD11b+GR-1+) con anticuerpos APC antiratón CD11b y antiratón Gr-1 (Ly-6G/Ly-6C). Recoger un mínimo de 3 x 104 células vivas, no de escombros para el análisis.
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Representative Results
Dependiendo del diseño experimental y los procedimientos, los ratones C57BL/6 fueron sometidos a CLP, y después de 3 días, se les administró bacterias por vía intranasal (Figura1). Como se muestra en la Figura2, los ratones comenzaron a morir a 12 h después de la inducción de la peritonitis. Dos ratones del grupo CLP+SA y tres ratones del grupo CLP+NS murieron antes de la insinstación intranasal de S. aureus. No se detectó ninguna mortalidad en ratones no infectados no operados o falsos. Por lo tanto, cuando los ratones tenían CLP antes de la neumonía, la mortalidad era mucho mayor (p < 0.05). Después del desafío de bacterias intranasales (1 x 107 CFU), tres de los ocho ratones sobrevivieron en los grupos SA y Sham+SA, y cuatro de ocho ratones sobrevivieron en el grupo CLP+NS. Sin embargo, los ocho ratones murieron en el grupo CLP+SA. Por el contrario, todos los mouse del grupo Ctrl y el grupo Sham+NS sobrevivieron. Los ratones CLP mostraron más mortalidad cuando posteriormente se desafió con S. aureus. Mortalidad de S. aureus después de CLP (100%) fue mayor que el infectado solo (37,5%) o S. aureus después de una estafa operada (37,5%; p < 0,05).
Como se muestra en la Figura3, se observó necrosis de caecum grave en animales post-CLP, pero más a partir del grupo de doble golpe (CLP+SA). Sin embargo, no hubo ningún cambio bruto del cecum en el control o un solo golpe con grupos de bacterias. Se cultivaron sangre, BALF y PLF para evaluar el aclaramiento bacteriano pulmonar de ratones infectados con S. aureus 3 días después de la CLP. Esta alta letalidad se asoció con un aumento significativo de S. aureus CFU en la sangre y PLF de ratones CLP en comparación con ratones falsos (p < 0.05; Figura 4A,C). El número de S. aureus CFU en la sangre y BALF de ratones CLP+SA fue notablemente mayor que los ratones CLP+NS (p < 0.01; Figura 4A,B).
En el caso de las citoquinas proinflamatorias, los resultados mostraron que los niveles de expresión de los sueros IL-1, IL-6 y TNF aumentaron significativamente a las 24 h después de la instilación bacteriana en ratones que sobreviven a la sepsis en comparación con los ratones que se sometieron a la CLP solas o con los ratones desafiados con S. aureus (Figura5A). Sin embargo, las citoquinas proinflamatorias aumentaron ligeramente en BALF de ratones sépticos con infección secundaria, diferentes de las de los ratones infectados por el control (ratones SA) y Sham+SA. Mientras tanto, los ratones de doble impacto mostraron niveles significativamente disminuidos en los niveles de BALF IL-1, IL-6 y TNF en comparación con los ratones SA y Sham+SA (p < 0.001; Figura 5B).
Como se muestra en la Figura6, los ratones fueron sacrificados a las 24 h después de la infección, y el porcentaje relativo de neutrófilos en BALF se detectaron por citometría de flujo. Los ratones de doble impacto mostraron una reducción significativa de los neutrófilos en el BALF en comparación con los ratones que se sometieron a neumonía por S. aureus solo. En conjunto, estos datos mostraron que la CLP afecta las respuestas inmunitarias del huésped, lo que resulta en una mayor susceptibilidad a la neumonía bacteriana secundaria.
Figura 1 : Diseño experimental. Los ratones se dividieron aleatoriamente en seis grupos. Dos grupos se sometieron a ligadura y pinchazo cecal (CLP) en D0, y los otros fueron operados por farsa o no operados. Tres días después de la cirugía (D3), S. aureus [SA, 1 x 107 unidades formadoras de colonias (CFU)] o salina normal (NS) se administró por vía intranasal. Los ratones del grupo de control (Ctrl) no se inculcaron por vía intranasal. La sangre, el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) y el líquido de lavado peritoneal (PLF) se cosecharon 24 horas después de la inyección de SA para un ensayo de recuento de bacterias. La tasa de mortalidad en cada grupo se observó en el transcurso de 7 días para el análisis de supervivencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Supervivencia del ratón. Los ratones C57BL/6 sometidos a CLP o a una cirugía falsa recibieron S. aureus (SA) o salina normal (NS) al tercer día después de la cirugía (n.o 8 ratones por grupo). Los ratones fueron monitoreados durante 7 días, y la mortalidad se registró cada 12 h. Curvas de supervivencia Kaplan-Meier, prueba de rango de registro (*p < 0.05) en comparación con ratones Sham+SA y ratones SA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Cecum del ratón. Infección secundaria fue inducida 3 días después de LA CLP. 24 h después de la infección de SA, los ratones fueron sacrificados para recoger los tejidos del colon. Se muestran las fotos representativas de la ligadura de cecal bajo diferentes golpes por lesión. SA - S. aureus; NS - salina normal; CLP : ligadura y punción cecal. Barra de escala de 1 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Recuentos bacterianos e imágenes representativas de placas de agar. 3 días después de la cirugía, los ratones fueron inculcados por vía intranasal con 1 x 107 UFC de S. aureus (SA) (n 3 ratones por grupo). La sangre, el BALF y el PLF se cosecharon 24 horas después de la inyección de SA, y se determinaron recuentos de colonias bacterianas después de 24 horas de incubación. Los resultados se expresan como medias : SeM. ANOVA unidireccional (post hoc de Tukey; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ns, no es significativo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : ELISA detectando la secreción de citoquinas. Infección secundaria fue inducida 3 días después de LA CLP. Concentraciones de IL-1, IL-6 y TNF en suero (A) y BALF (B) de ratones después de la infección por SA (n 3 ratones por grupo). Los datos se presentan como la media de sem de tres experimentos. ANOVA unidireccional (post hoc de Tukey; *p < 0.05; **p < 0.01; ****p < 0.0001; ns no significativo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Frecuencia representativa de la penetración de neutrófilos. 24 h después de la infección intranasal, los ratones fueron sacrificados para obtener BALF (n 3 ratones por grupo). El porcentaje de neutrófilos (CD11b+, GR-1+) se cuantificó mediante citometría de flujo y se muestran como medios de SEM de tres experimentos. ANOVA unidireccional (post hoc de Tukey; ****p < 0.0001; ns no es significativo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Como modelo estándar de oro para la investigación de la sepsis, CLP tiene una combinación de tres insultos, incluyendo traumatismo tisular causado por la laparotomía, necrosis debido a la ligadura del cecum, y la infección como resultado de la fuga microbiana que causa peritonitis con translocación de bacterias en la sangre8. Por lo tanto, CLP imita la complejidad de la sepsis humana mejor que muchos otros modelos. Sin embargo, una limitación importante del modelo CLP actual es la incapacidad de reflejar la fase más prolongada de la sepsis que se ve en pacientes en UCI3,4,5. Por lo tanto, se propuso un modelo dual clínicamente relevante (modelo de doble impacto) para reflejar la mortalidad tardía de la sepsis e investigar los mecanismos subyacentes a la infección pulmonar secundaria. En este protocolo, la sepsis fue inducida por la combinación de CLP con S. aureus infección pulmonar en 3 días después de CLP. Los ratones de dos impactos mostraron una mayor mortalidad, daño grave de cecum, sangre debilitada, aclaramientos de bacterias BALF, citoquinas proinflamatorias más bajas y neutrófilos más bajos en BALF. Esto dio lugar a la sepsis grave, que imita el estado de inmunosupresión en las clínicas.
Las siguientes descripciones son pasos críticos. Se muestra en detalle cómo producir sepsis subletal en las mismas condiciones. En primer lugar, se utilizaron ratones hembra porque los ratones hembra son más resistentes a CLP que los ratones machos11. En segundo lugar, la mortalidad inducida por CLP depende de varios parámetros técnicos, comola longitud del cecum ligado, el tamaño de la aguja y el número de pinchazos cecales 9. La ligadura de aproximadamente el 75% del cecum induce sepsis grave, la ligadura del 60% del cecum induce sepsis de nivel medio, y la ligadura del 25% o menos del cecum da como resultado una sepsis menor9. Fue elegido para estandarizar el modelo mediante la realización de un CLP suave (25%, única punción de paso a través con una aguja 21 G 1 1/2) para inducir la sepsis subletal11,12. En tercer lugar, se recomienda la reanimación fluida para prevenir el shock y la muerte rápida debido al colapso de la circulación y desarrollar un modelo de sepsis animal hiperdinámico, que imita más de cerca el perfil hemodinámico de la sepsis humana13. Además, el uso de analgésicos, como la buprenorfina, debe considerarse desde un punto de vista experimental y ético10.
Tres días después de la CLP fue elegido como un punto de tiempo para inducir la infección secundaria para reflejar la fase inmunosupresora de la sepsis. La mayoría de los pacientes con sepsis tienen un curso hospitalario prolongado con la mayoría de las muertes que ocurren más allá de 3 días, y muchos de ellos ingresan a una neumonía secundaria adquirida en el hospital, que se demostró constantemente en un estudio reciente con CLP junto con P. aeruginosa14 . Los resultados anteriores de otros laboratorios también demuestran que 3 días después de la CLP, los ratones muestran una alta sensibilidad a las bacterias inculcadas secundarias, y un día después de la infección fue el punto de inflexión de la sobreinflamación a la inmunosupresión15, 16.
Además, las diferencias en las cepas de bacterias y la dosis inculcada son factores significativos que causan variabilidad en el modelo dual. La selección de los niveles de tensión y dosis se basa en las necesidades del diseño experimental de la infección secundaria durante el estado inmunosupresor. Sobre la base de los hallazgos anteriores, 1 x 107 CFU de S. aureus fue seleccionado para este estudio.
Para mejorar la eficiencia del suministro bacteriano intranasal directamente en los pulmones del ratón, se debe prestar atención al volumen de insitación, el tiempo y la posición del cuerpo. Hay otros asuntos operativos que pueden influir inmensamente en el resultado del experimento. Estos incluyen mantener el ratón en posición vertical, administrar líquido de bacterias de dosis múltiples bajas en ambas fosas nasales por separado durante cada instilización, observar la inhalación de líquido sin formar burbujas, controlar la velocidad de inhalación; moviendo el ratón hacia arriba rápidamente y luego hacia abajo lentamente, y colocando el ratón en un ángulo de 45o para recuperarse de la instilación. La administración de bacterias intranasales no es invasiva y ayuda a prevenir la asfixia, aumentar la accesibilidad, mejorar la seguridad y minimizar las lesiones quirúrgicas.
Sin embargo, este método tiene sus limitaciones. Como se trata de un estudio metodológico, no se han discutido datos sobre los cambios de los signos clínicos; citoquinas antiinflamatorias; y la cantidad y función de monocitos, neutrófilos y linfocitos en la sangre. Los ratones de laboratorio son a menudo endogámicos, tienen edades y pesos similares, se alojan en instalaciones específicas libres de patógenos, y comúnmente no tienen comorbilidades, como la inmunosupresión preexistente. Sin embargo, diferentes sexos, edad, estado inmune y nutricional, y posible tratamiento adyuvante como antibióticos de pacientes pueden dar lugar a resultados clínicos heterogéneos. Teniendo en cuenta la heterogeneidad de los pacientes humanos, se deben vigilar cuidadosamente variables como la edad, el peso, las enfermedades preexistentes y la atención de apoyo clínico.
El desarrollo de este modelo dual (modelo de doble golpe) es oportuno e importante para la comunidad de investigación de infecciones e inmunidad porque se asemeja a la progresión de la fase hiper- a hipoinflamatoria de la sepsis humana. Refleja el escenario clínico común de una neumonía nosocomial secundaria en pacientes con sepsis con mayor precisión. Este modelo puede ayudar a desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para la inmunosupresión inducida por sepsis.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses financieros.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Subvenciones de Salud R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01, y AI097532-01A1 a M. W. Las instalaciones principales de la Universidad de Dakota del Norte contaron con el apoyo de subvenciones de NIH (INBRE P20GM103442 y COBRE P20GM113123). Este trabajo también fue apoyado por el Programa Clave de la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (81530063) a Jianxin Jiang. Los funderos no tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito. Agradecemos a Marvin Leier (Centro de Salud Rural, Universidad de Dakota del Norte) por hacer el video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
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