Summary
Dit protocol beschrijft technieken om besmettelijke resultaten te meten aan de onderliggende secundaire ziekenhuisinfecties in de immunosuppressieve voorwaarde, eerst door de oprichting van cecal afbinding/punctie muizen dan uitdagend hen met intranasal infectie Maak een klinisch relevant model van immunosuppressie sepsis.
Abstract
Sepsis, een ernstige en ingewikkelde levensbedreigende infectie, wordt gekenmerkt door een onbalans tussen Pro-en anti-inflammatoire reacties in meerdere organen. Met de ontwikkeling van therapieën, overleven de meeste patiënten de hyperinflammatory fase maar vorderen aan een immunosuppressieve fase, die de totstandkoming van secundaire besmettingen verhoogt. Daarom is een beter begrip van de pathogenese onderliggende secundaire ziekenhuis-verworven infecties in de immunosuppressieve fase tijdens sepsis is van enorm belang. Gemeld hier is een model om besmettelijke resultaten te testen door het creëren van Double-hit infecties bij muizen. Een standaard chirurgische ingreep wordt gebruikt om te induceren polymicrobiële peritonitis door cecal afbinding en punctie (CLP) en gevolgd door intranasal infectie van Staphylococcus aureus te simuleren longontsteking die zich in het immuunsysteem onderdrukking die vaak wordt gezien bij septische patiënten. Dit dubbele model kan weerspiegelen de immunosuppressieve toestand die zich voordoet bij patiënten met langdurige sepsis en de gevoeligheid voor secundaire infectie van ziekenhuis ontsteking. Vandaar, dit model biedt een eenvoudige experimentele benadering van de pathofysiologie van sepsis-geïnduceerde secundaire bacteriële longontsteking, die kunnen worden gebruikt voor het ontdekken van nieuwe behandelingen voor sepsis en de complicaties te onderzoeken.
Introduction
Sepsis initieert een complex samenspel van gastheer pro-inflammatoire en anti-inflammatoire processen en wordt gekenmerkt door een hyperinflammatory reactie en de daaropvolgende immuun dysfunctie1,2. Sepsis vertegenwoordigt een globale gezondheids prioriteit en veroorzaakt een hoog aantal sterfgevallen in intensieve zorgeenheden (Ic's)3. De incidentie van sepsis wordt geschat op meer dan 30.000.000 gevallen wereldwijd per jaar, met sterftecijfers zo hoog als 30%, ondanks de vooruitgang in de ICU Management4,5. In 2017, de Wereldgezondheidsorganisatie een resolutie aangenomen ter verbetering van de preventie, diagnose en het beheer van deze dodelijke ziekte5. Recente studies hebben echter geïllustreerd dat de dood niet het gevolg is van primaire infectie bij ernstige septische patiënten, maar eerder van secundaire ziekenhuis infectie (met name longontsteking) die veroorzaakt door immunosuppressie6,7 . Daarom, het begrijpen van de mechanismen van waarom septische patiënten ontwikkelen secundaire infectie en het ontdekken van effectievere behandelingen zijn dringend vereist. Hierin, een tweevoudig model, ook wel bekend als een double-hit model, om de immunosuppressieve verschijnsel dat zich voordoet bij patiënten met langdurige sepsis studie wordt beschreven.
Als de gouden standaard experimentele model in onderzoek naar polymicrobiële sepsis, cecal afbinding en punctie (CLP) is een operatie gekenmerkt door blindedarm afbinding en perforatie, die bijdraagt aan polymicrobiële peritonitis en sepsis8,9 . De pathofysiologische proces en cytokine profielen, samen met de kinetiek en de omvang, zijn vergelijkbaar met klinische sepsis. De positie van de afbinding, de naald grootte die voor de punctie wordt gebruikt, en het aantal cecal puncties zijn belangrijke factoren die de mortaliteit na CLP beïnvloeden.
De ziekenhuis ontsteking is de belangrijkste oorzaak van sterfte bij kritisch zieke patiënten met sepsis. Het belangrijkste type van organismen veroorzakend strenge sepsis omvat Staphylococcus aureus (20,5%), Pseudomonas soorten (19,9%), Enterobacteriacae (hoofdzakelijk E. coli, 16,0%), en paddestoelen (19%). Ondertussen, hebben de recente studies een stijgende weerslag van gram-positieve organismen voorgesteld, die nu bijna net zo gemeenschappelijk zoals gram-negatieve besmettingen3zijn.
De methode beschreven in dit protocol omvat CLP, uitgevoerd als de "eerste hit" te induceren subdodelijke polymicrobiële peritonitis, die een immunosuppressie voorwaarde manifesteert. De procedure impliceert ook verdere intranasal instillatie van S. aureus als "tweede klap" om een klinisch relevant onderzoek platform te verstrekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier beschreven werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institute of Health Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door de Universiteit van North Dakota Institutional Animal Care en use Comite (DEC).
1. Cecal afbinding en punctie
Opmerking: vrouwelijke C57BL/6 muizen (gewicht, 18-22 g; leeftijd, 6-8 weken) zijn willekeurig verdeeld in zes groepen: controlegroep (CTRL), infectie groep (SA voor S. aureus), twee Sham groepen, en twee CLP-groepen. CTRL dieren worden achtergelaten zonder chirurgie en secundaire infectie verwondingen. SA dieren worden onderworpen aan S. aureus longinfectie zonder de operatie. Sham-Operated dieren ondergaan dezelfde laparotomie met een expositie van de blindedarm (met uitzondering van de blindedarm is noch afgebonden noch geperforeerd). Acht muizen per groep worden gebruikt voor overlevings analyse, en drie tot vijf muizen worden gebruikt voor de beoordeling van de ontsteking op verschillende Timepoints.
- Voorafgaand aan de operatie, steriliseren alle chirurgische instrumenten en materialen door autoclaaf voor 20 min. Reinig en Desinfecteer de operatietafel met Desinfecterende doekjes. Voor het vaststellen van steriele omstandigheden tijdens de operatie, bedek de gehele operatieve velden met een goede steriele chirurgische gordijnen, en draag een haar cover, chirurgisch masker, beschermende brillen, chirurgische toga, en steriele handschoenen.
- Weeg en verdoven de muis met behulp van 0,1 mL/muis van ketamine (80 mg/kg), xylazine (10 mg/kg) mengsel ze intraperitoneaal toegediend. Met de duim en wijsvinger van de linkerhand die een U-vormige positie, de aanpak van de hals van de muis van achter soepel en voorzichtig, dan houd de nek onmiddellijk achter de oren, zodat de muis hoofd is zeer terughoudend. Gebruik een Pinky te houden van de muis het recht achter been en gebruik de middelste en ring vingers (alle vingers van de linkerhand) om het lichaam te houden.
- Controleer de intensiteit van de anesthesie door teen knijpen totdat er geen flexie van het uiteinde.
- Scheer de onderste kwadranten van de buik met behulp van een elektrisch scheerapparaat en Desinfecteer het gebied met jodium.
- Plaats de muis op het steriele oppervlak in een liggende positie, met het hoofd georiënteerd uit de buurt van de exploitant. Draperen de muis met steriele handdoek met gat over de geplande chirurgische incisie te handhaven steriele velden.
- Maak een longitudinale huid incisie (ongeveer 0,5 cm lang) met een scalpel in de linker onderbuik. Gebruik kleine scharen om de incisie (1-2 cm) uit te breiden.
Let op: Zorg ervoor dat u de buikholte niet doordringt. - Maak de intramusculaire incisie om toegang te krijgen tot de buikholte en laat de blootstelling van de blindedarm met de aangrenzende darm.
- Isoleer de blindedarm aan de linkerkant van de buik (in de meeste gevallen wordt dit gedaan met behulp van botte anatomische Tang) en verwijder het op een steriele Laken, waardoor de kleine en dikke darmen in de buikholte.
Let op: Vermijd beschadiging van de mesenterica bloedvaten. - Binden de blindedarm op de distale 25% positie om een langdurige infectie met relatief lage sterfte te creëren.
Let op: Zorg ervoor dat u de Ileocecal afsluiter niet binden. - Geperforeerde de blindedarm met een 21 G 1 ½ naald door een enkele door-en-door punctie (twee gaten) halverwege tussen de afbinding en punt van de blindedarm op de minst-vasculaire gebied.
Let op: Zorg ervoor dat de bloedvaten niet doorprikken. - Verwijder de naald. Zachtjes extruderen een kleine hoeveelheid uitwerpselen van de penetratie gaten om de volledige dikte perforatie te garanderen.
Let op: Zorg ervoor dat de darm continuïteit tijdens de procedure niet wordt belemmerd. - Vervang de blindedarm in de buikholte.
- Sluit de buik in twee lagen met 4-0 nylon chirurgische hechtingen. Sluit de buikspieren door het toepassen van eenvoudige lopende hechtingen en sluit de huid door het toepassen van eenvoudige onderbroken hechtingen. Reinig de huid met jodium.
- Injecteren 1 mL van de voorverwarmde (37 ° c) 0,9% steriele normale Saline (NS) oplossing op de rug onderhuids ter vervanging van de derde ruimte verlies en plaats deze op een warme pad om te herstellen.
- Breng de muizen in kooi in een temperatuur-gecontroleerde ruimte (22 °C) met 12 h lichte/donkere cycli en vrije toegang tot voedsel en water terug. Monitor de muizen elke 0,5 uur voor ten minste 2 h, dan elke 6 h voor ten minste 2 d, dan elke 12 uur voor 3 dagen, of euthanaseren ze wanneer stervende voor overleving analyse.
Opmerking: pre-en post-operatieve analgesie (buprenorfine, 50 µ g/kg onderhuids elke 12 h) worden aanbevolen voor 24 uur voor de operatie tot 48 uur na de operatie9,10.
2. secundaire longinfectie met S. aureus
Opmerking: behalve voor de CTRL en SA groepen, overlevende muizen op 3 dagen na de CLP in de Sham en CLP groepen moeten worden toegediend intranasaal met 30 µ L van een bacteriële schorsing of NS, respectievelijk. De overlevende muizen in de SA-groep moet worden bijgebracht intranasaal met de bacteriële schorsing.
- Verdoven de muis door ze intraperitoneaal injecteren 100 µ L oplossing van ketamine (45 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) en wacht tot de muis langzaam ademt. De prikken hoek tussen de naald en de buikmuur is minder dan 30 ° voor langzame injectie.
- Met behulp van een micropipet, langzaam en intranasaal inboezemen met 30 µ L van 1 x 107 kolonie vorm eenheid (CFU) van S. aureus te worden aanzuiging bij inademing. Houd de muis door zijn oren in een rechtopstaande positie, langzaam drop 2-3 µ L van bacteriële schorsing in beide neusgaten elke keer. Pas de snelheid van de release om de muis te inhaleren zonder de vorming van bubbels en afhaken.
- Verhoog de muis op en neer, met zijn hoofd omhoog en staart naar beneden, om te helpen de bacteriën in de luchtpijp. Beweeg de muis omhoog snel en sterk, terwijl het bewegen van het zachtjes en langzaam om de ernst te verhogen. Herhaal restillatie ongeveer 15x totdat alle bacteriën worden ingeademd, die moet 10-15 min voor elke muis.
- Leg de muis op zijn rug en hoofd omhoog op het schuine beddegoed (ongeveer 35 °) en Let op de muis tot zijn ademhaling aan normaal terugkeert en het volledig van de anesthesie en de procedures wordt teruggekregen.
- Plaats de muis terug in de kooi in een kamer met temperatuurregeling (22 °C) met 12 h licht/donker cycli en onbeperkte toegang tot voedsel en water.
- Controleer de muis voorwaarden elke 2 uur voor de eerste dag en elke 12 uur daarna gedurende 4 dagen na de operatie. Euthanaseren hen wanneer stervende voor overlevings analyse of 24 h na besmetting voor beoordeling van ontsteking.
3. geanalyseerde parameters
- Muizen overleven
- Monitor de muizen voor 7 dagen. Euthanaseren wanneer stervende en Genereer overlevings krommen gebruikend Kaplan-Meier methodes11.
- Bacteriële telt
- 24 h na SA injectie, oogst het bloed, bronchoalveolaire lavage vloeistof (BALF), en buikvlies lavage vloeistof (PLF) van de muizen. Later, voeg 100 µ l van de verdunningsmiddelen aan voedende agar-platen en cultuur hen bij 37 °c voor 24 h toe om de bacteriële kolonie te bepalen telt11,12,13.
- Cytokines
Opmerking: pro-inflammatoire cytokine concentraties van IL-1β, IL-6, en TNFα in serum en BALF van muizen moeten worden beoordeeld met behulp van ELISA kits volgens de instructies van de fabrikant.- Bedek de 96 goed ELISA plaat met 100 µ L/well van verschillende Capture antilichaam werkende oplossing voor het uitvoeren van de normen in tweevoud en monsters in drievoud. Seal de plaat en laat het 's nachts bij 4 ° c.
- Was de plaat drie keer met 255 µ L/well Wash buffer (1x PBS, 0,05% Tween-20).
- Te blokkeren niet-specifieke binding, voeg 200 µ L/goed verdunningsmiddel. Sluit de plaat en Incubeer bij kamertemperatuur (RT) voor 1 uur.
- Bereid standaardoplossing: 8 2-voudige seriële verdunningen van 1000 PG/mL.
- Voeg 100 µ L/well van normen of monsters om de juiste putten en 100 µ L/put van verdunningsmiddel aan de blanco putten. Sluit de plaat af en Incubeer bij RT voor 2 uur of overnachting bij 4 °C.
- Was de plaat 5x met 255 µ L/well Wash buffer.
- Voeg 100 µ L/well van verschillende detectie antilichaam werkende oplossing om de juiste putten. Sluit de plaat af en Incubeer bij RT voor 1 h.
- Was de plaat 5x met 255 µ L/well Wash buffer.
- Voeg 100 µ L/put van verdunde HRP oplossing toe aan alle putten. Seal de plaat en Incubeer bij RT voor 30 min.
- Was de plaat 5x met 255 µ L/well Wash buffer.
- Voeg 100 µ L/well verdunde TMB oplossing toe. Incubeer de plaat uit de buurt van licht bij RT voor 15 min.
- Voeg 50 µ L/well stop oplossing (1 M H3po4). Lees absorptie op 450 nm met een plaat lezer.
- Stroom Cytometry
- Verkrijg het totale aantal cellen van BALF. Lyse de rodelen met behulp van ACK Lysing buffer en wassen 2x met behulp van PBS.
- Analyseer dan de single-cel schorsingen doorstroming Cytometry zoals eerder beschreven11. Voor oppervlakte vlekken, vlek neutrofielen (CD11b + GR-1 +) met APC anti-muis CD11b en anti-muis GR-1 (ly-6G/ly-6C) antilichamen. Verzamel een minimum van 3 x 104 Live, niet-puin cellen voor analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Afhankelijk van het experimentele ontwerp en de procedures, C57BL/6 muizen werden onderworpen aan CLP, en na 3 dagen, werden ze toegediend bacteriën intranasaal (Figuur 1). Zoals weergegeven in Figuur 2, de muizen begon te sterven op ~ 12 h na de inductie van peritonitis. Twee muizen in de CLP + SA-groep en drie muizen in de CLP + NS-groep stierven vóór intranasal S. aureus -instillatie. Geen mortaliteit werd ontdekt in niet-geïnfecteerde niet-of Sham-Operated muizen. Daarom, toen muizen CLP had vóór longontsteking, sterfte was veel hoger (p < 0,05). Na intranasal bacterie Challenge (1 x 107 CFU), drie van de acht muizen overleefd in zowel de SA en Sham + sa groepen, en vier van de acht muizen overleefd in de CLP + NS-groep. Alle acht muizen stierven echter in de CLP + SA-groep. In tegenstelling, elke muis in de CTRL-groep en Sham + NS groep overleefd. CLP muizen toonden meer sterfte toen later uitgedaagd met S. aureus. Mortaliteit van S. aureus na CLP (100%) was hoger dan alleen besmet (37,5%) of S. aureus na Sham-Operated (37,5%; p < 0,05).
Zoals weergegeven in Figuur 3, werd ernstige blindedarm necrose waargenomen bij post-CLP-dieren, maar meer nog uit de dubbel treffer groep (CLP + SA). Echter, er was geen grove verandering van de blindedarm in controle of single-hit met bacteriën groepen. Bloed, BALF, en PLF werden gekweekt om de Long bacteriële klaring van muizen geïnfecteerd met S. aureus 3 dagen post-CLP te beoordelen. Deze hoge dodelijkheid werd geassocieerd met significant toegenomen S. aureus CFU in het bloed en PLF van CLP muizen in vergelijking met Sham muizen (p < 0,05; Figuur 4a,C). Het aantal S. aureus CFU in het bloed en de BALF van de CLP + sa muizen was aanzienlijk groter dan de CLP + NS muizen (p < 0,01; Figuur 4a,B).
Voor pro-inflammatoire cytokines, de resultaten toonden aan dat de expressie niveaus van serum IL-1β, IL-6, en TNFα aanzienlijk verhoogd op 24 uur na bacteriële instillatie in sepsis-overlevende muizen in vergelijking met de muizen die onderging CLP alleen of aan de Sham-Operated muizen uitgedaagd met S. aureus (figuur 5a). Echter, de pro-inflammatoire cytokines steeg licht in BALF van septische muizen met secundaire infectie, anders dan die in de controle-geïnfecteerde muizen (SA muizen) en Sham + SA. Ondertussen, Double-hit muizen tentoongesteld significant verminderde niveaus in BALF IL-1β, IL-6, en TNFα niveaus ten opzichte van zowel SA en Sham + SA muizen (p < 0,001; Figuur 5b).
Zoals weergegeven in Figuur 6, muizen werden opgeofferd op 24 uur na infectie, en relatieve neutrofiele percentage in BALF werden gedetecteerd doorstroming Cytometry. De dubbel-klap muizen vertoonden een significante vermindering van neutrofielen in BALF in vergelijking met muizen die S. aureus longontsteking alleen onderging. Collectief, deze gegevens bleek dat CLP schaadt de gastheer immuunrespons, wat resulteert in een verhoogde gevoeligheid voor secundaire bacteriële longontsteking.
Figuur 1 : Experimenteel ontwerp. Muizen werden willekeurig verdeeld in zes groepen. Twee groepen onderging cecal afbinding en punctie (CLP) op D0, en de anderen waren Sham-Operated of niet bediend. Drie dagen na de operatie (D3), S. aureus [SA, 1 x 107 kolonie vormen eenheden (CFU)] of normale zoutoplossing (NS) werd toegediend intranasaal. De controlegroep (CTRL) muizen waren niet intranasaal bijblijven. Bloed, bronchoalveolaire lavage vloeistof (BALF), en buikvlies lavage vloeistof (PLF) werden geoogst 24 uur na SA injectie voor een bacterie graaf assay. Het sterftecijfer in elke groep werd waargenomen in de loop van 7 dagen voor overlevings analyse. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2 : Muis te overleven. C57BL/6 muizen voorgelegd aan een CLP of Sham chirurgie ontvangen S. aureus (SA) of normale zoutoplossing (NS) op de derde dag na de operatie (n = 8 muizen per groep). De muizen werden bewaakt voor 7 dagen, en mortaliteit werd geregistreerd om de 12 h. Kaplan-Meier Survival curves, log-Rank test (* p < 0,05) in vergelijking met Sham + SA muizen en muizen SA. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3 : Muis blindedarm. Secundaire infectie werd geïnduceerd 3 dagen na de CLP. 24 uur na SA-infectie, muizen werden opgeofferd om Colon weefsels te verzamelen. De representatieve foto's van cecal afbinding onder verschillende verwondings klap worden getoond. SA = S. aureus; NS = normale zoutoplossing; CLP = cecal afbinding en punctie. Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4 : Bacteriële tellingen en representatieve beelden van agar-platen. 3 dagen na de operatie werden muizen intranasaal met 1 x 107 CFU van S. aureus (SA) (n ≥ 3 muizen per groep). Het bloed, BALF, en PLF werden geoogst 24 h na SA injectie, en de bacteriële kolonie tellingen werden bepaald na 24 h van incubatie. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. one-way ANOVA (Tukey post hoc; * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; NS = niet significant). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5 : Elisa die cytokine secretie opspoort. Secundaire infectie werd geïnduceerd 3 dagen na de CLP. Concentraties van IL-1β, IL-6, en TNFα in serum (A) en BALF (B) van muizen na sa-infectie (n ≥ 3 muizen per groep). Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM van drie experimenten. One-way ANOVA (Tukey post hoc; * p < 0,05; * * p < 0,01; * * * * p < 0,0001; NS = niet significant). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6 : Representatieve frequentie van neutrofiele penetratie. 24 uur na intranasal infectie werden muizen geofferd om BALF (n ≥ 3 muizen per groep) te verkrijgen. Het percentage neutrofielen (CD11b+, GR-1+) werd gekwantificeerd door stromings Cytometry en wordt als middel ± SEM van drie experimenten getoond. One-way ANOVA (Tukey post hoc; * * * * p < 0,0001; NS = niet significant). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Als het goudstandaard model voor sepsis onderzoek, CLP heeft een combinatie van drie beledigingen, met inbegrip van weefseltrauma veroorzaakt door de laparotomie, necrose als gevolg van afbinding van de blindedarm, en infectie als gevolg van microbiële lekkage die peritonitis veroorzaakt met translocatie van bacteriën in bloed8. Daarom, CLP bootst de complexiteit van de menselijke sepsis beter dan vele andere modellen. Echter, een grote beperking van de huidige CLP-model is het onvermogen om de meer langdurige fase van sepsis gezien bij patiënten in ICU3,4,5weerspiegelen. Vandaar, werd een klinisch relevant dubbel model (dubbel-klapmodel) voorgesteld om vertraagde mortaliteit van sepsis weer te geven en de mechanismen te onderzoeken die onderliggende Long secundaire besmetting zijn. In dit protocol, sepsis werd geïnduceerd door het combineren van CLP met S. aureus longinfectie op 3 dagen na de CLP. Twee-hit muizen tentoongesteld hogere sterfte, ernstige blindedarm schade, verzwakt bloed, BALF bacteriën klaring, lagere pro-inflammatoire cytokines, en lagere neutrofielen in BALF. Dit resulteerde in de ernstige sepsis, die de immunosuppressie status in de klinieken nabootst.
De volgende beschrijvingen zijn kritieke stappen. Weergegeven in detail is hoe sublethale sepsis produceren onder dezelfde omstandigheden. Eerste, vrouwelijke muizen werden gebruikt omdat vrouwelijke muizen zijn beter bestand tegen CLP dan mannelijke muizen11. Ten tweede is het CLP-geïnduceerde sterfte afhankelijk van verschillende technische parameters, zoals de lengte van de blindedarm afgebonden, naald grootte, en het aantal cecal puncties9. Afbinding van ongeveer 75% van de blindedarm induceert ernstige sepsis, Afbinding van 60% van de blindedarm induceert midden-niveau sepsis, en Afbinding van 25% of minder van de blindedarm resultaten in kleine sepsis9. Het werd gekozen om het model te standaardiseren door het uitvoeren van een milde CLP (25%, een door-en-door punctie met een 21 G 1 ½ naald) te induceren sublethal sepsis11,12. Ten derde, wordt de vloeibare reanimatie geadviseerd om schok en snelle dood toe te schrijven aan omloop instorting te verhinderen en een hyperdynamic dierlijk sepsis model te ontwikkelen, dat dichter hemodynamische Profiel van menselijke sepsis13nabootst. Bovendien, het gebruik van pijnstillers, zoals buprenorfine, moet worden beschouwd vanuit een experimentele en ethische oogpunt10.
Drie dagen post-CLP werd gekozen als timepoint om secundaire besmetting te veroorzaken om op de immunosuppressieve fase van sepsis te wijzen. De meeste patiënten met sepsis hebben een langdurige ziekenhuiscursus met de meeste sterfgevallen die zich na 3 dagen, en velen dan treedt in het secundair ziekenhuis-acquired pneumonie, die consequent werd getoond in een recente studie met CLP, samen met P. aeruginosa14 . Eerdere resultaten van andere laboratoria tonen ook aan dat 3 dagen na CLP, muizen tonen hoge gevoeligheid voor secundaire bijgeleverde bacteriën, en een dag na infectie was het keerpunt van over-ontsteking tot immunosuppressie15, 16.
Bovendien verschillen in bacteriestammen en de dosering bijgesteld zijn significante factoren waardoor variabiliteit in de Dual model. De selectie van spanning en dosisniveaus is gebaseerd op de behoeften van het experimentele ontwerp van secundaire besmetting tijdens immunosuppressieve status. Op basis van eerdere bevindingen werd voor deze studie 1 x 107 CFU van S. aureus geselecteerd.
Ter verbetering van de efficiëntie van intranasal bacteriële levering rechtstreeks in de muis longen, aandacht moet worden besteed aan de instillatie volume, tijd, en het lichaam positie. Er zijn nog andere operationele zaken die de uitkomst van het experiment enorm kunnen beïnvloeden. Deze omvatten het houden van de muis rechtop, het beheer van meerdere-lage dosis bacteriën vloeistof in beide neusgaten afzonderlijk tijdens elke instillatie, kijken naar de inhalatie van vloeistof zonder bubbels, het regelen van de snelheid van inhalatie; het verplaatsen van de muis omhoog snel dan naar beneden langzaam, en het leggen van de muis op een 45 ° hoek om te herstellen van de instillatie. Intranasal bacterie toediening is niet-invasief en helpt bij het voorkomen van verstikking, verhoging van de toegankelijkheid, verbetering van de veiligheid, en minimaliseren chirurgische verwondingen.
Echter, deze methode heeft zijn beperkingen. Aangezien dit een methodologische studie is, zijn de gegevens niet besproken op de veranderingen van klinische tekens; anti-inflammatoire cytokinen; en de hoeveelheid en de functie van monocyten, neutrofielen, en lymfocyten in het bloed. Laboratoriummuizen zijn vaak ingeteeld, hebben vergelijkbare leeftijden en gewichten, zijn ondergebracht in specifieke pathogeen-vrije faciliteiten, en hebben vaak geen comorbiditeit, zoals reeds bestaande immunosuppressie. Niettemin, verschillende geslacht, leeftijd, immuun en nutritionele status, en mogelijke adjuvante behandeling, zoals antibiotica van patiënten kan leiden tot heterogene klinische resultaten. Gezien de heterogeniteit van menselijke patiënten, moeten variabelen zoals leeftijd, gewicht, reeds bestaande ziekten en klinische ondersteunende zorg zorgvuldig worden bekeken.
De ontwikkeling van deze dubbele model (Double-hit model) is tijdig en belangrijk voor de infectie en immuniteit onderzoekgemeenschap, omdat het lijkt op de progressie van de Hyper-tot hypo-inflammatoire fase van de menselijke sepsis. Het weerspiegelt de gemeenschappelijke klinische scenario van een secundaire ziekenhuis ontsteking bij patiënten met sepsis nauwkeuriger. Dit model kan helpen om nieuwe therapeutische strategieën voor sepsis-geïnduceerde immunosuppressie te ontwikkelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door nationale instituten van gezondheids subsidies R01 AI138203-01, AI109317-04, AI101973-01, en AI097532-01A1 aan M. W. De Universiteit van de kernfaciliteiten van de Noord-van Dakota werd gesteund door toekenning NIH (INBRE P20GM103442 en COBRE P20GM113123). Dit werk werd ook gesteund door het belangrijkste programma van de nationale stichting van de wetenschap van de aard van China (81530063) aan Jianxin Jiang. De financiers hadden geen rol in studie ontwerp, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript. Wij danken Marvin leier (centrum voor landelijke gezondheid, Universiteit van Noord-Dakota) voor het maken van de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 21 G 1 ½ Needle | BD | BD305167 | |
| ACK lysing buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Anti-mouse CD11b antibody | Biolegend | 101201 | |
| Anti-mouse Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) antibody | Biolegend | 108401 | |
| C57BL/6 mice | Harlan (Indianapolis) | C57BL/6NHsd | |
| Desk light | General Supply | General Supply | |
| Disinfecting wipes | Clorox | B07NV5JMCS | |
| Electric razor | General Supply | General Supply | |
| ELISA kits (mouse IL-1β, IL-6 and TNFα) | Invitrogen | 88-7013, 88-7064, and 88-7324 | |
| Iodine | Dynarex | B003U463PY | PVP Iodine Wipes |
| Ketamine | FORT DODGE | NDC 0856-2013-01 | Amine hydrochloride injection |
| Laboratory scale | General Supply | General Supply | |
| LB Agar, Miller | Fisher Scientific | BP1425-500 | Molecular genetics, powder |
| Micropipette | ErgoOne | 7100-1100 | |
| Normal saline | General Supply | General Supply | |
| Polylined towel | CardinalHealth, Convertors | 3520 | Surgical drape, sterile, for single use only |
| Silk suture, 4-0 | DAVIS & GECK | 1123-31 | |
| Small animal needle holder | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgery scissors | General Supply | General Supply | |
| Small animal surgical forceps | General Supply | General Supply | |
| Staphylococcus aureus | ATCC | 13301 | |
| Warm pad | General Supply | General Supply | |
| Xylazine | Alfa Aesar | 7361-61-7 |
References
- Singer, M., et al. The Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Delano, M. J., Ward, P. A. The immune system's role in sepsis progression, resolution, and long-term outcome. Immunological Reviews. 274 (1), 330-353 (2016).
- Mayr, F. B., Yende, S., Angus, D. C.
- Fleischmann, C., et al. Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).
- Reinhart, K., et al. Recognizing Sepsis as a Global Health Priority - A WHO Resolution. The New England Journal of Medicine. 377 (5), 414-417 (2017).
- Boomer, J. S., et al. Immunosuppression in patients who die of sepsis and multiple organ failure. JAMA. 306 (23), 2594-2605 (2011).
- Hotchkiss, R. S., Monneret, G., Payen, D. Sepsis-induced immunosuppression: from cellular dysfunctions to immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 13 (12), 862-874 (2013).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis? Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M. S., Flierl, M. A., Ward, P. A. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Hugunin, K. M. S., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34 (3), 250-260 (2010).
- He, S., et al. Annexin A2 Modulates ROS and Impacts Inflammatory Response via IL-17 Signaling in Polymicrobial Sepsis Mice. PLoS Pathogens. 12 (7), 23 (2016).
- Pu, Q. Q., et al. Atg7 Deficiency Intensifies Inflammasome Activation and Pyroptosis in Pseudomonas Sepsis. Journal of Immunology. 198 (8), 3205-3213 (2017).
- Zanotti-Cavazzoni, S. L., et al. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Medicine. 35 (4), 748-754 (2009).
- Chin, W., et al. A macromolecular approach to eradicate multidrug resistant bacterial infections while mitigating drug resistance onset. Nature Communications. 9 (1), 917 (2018).
- Nascimento, D. C., et al. IL-33 contributes to sepsis-induced long-term immunosuppression by expanding the regulatory T cell population. Nature Communications. 8, 14919 (2017).
- Deng, D., et al. Systematic investigation on the turning point of over-inflammation to immunosuppression in CLP mice model and their characteristics. International Immunopharmacology. 42, 49-58 (2017).
