كتلة بروتينات مستقبلات جيرمينانت في ‘جيرمينوسوميس’ في الغشاء الداخلي للجراثيم العصوية نجحت . يمكننا وصف بروتوكول باستخدام القرار سوبر مجهرية وفلوري البروتينات مراسل لتصور جيرمينوسوميس. ويحدد البروتوكول أيضا مجالات الغشاء الداخلي بوغ ملطخة تفضيلي مع صبغ الغشاء FM4-64.
الحجم الصغير للجراثيم ووفرة منخفضة نسبيا من البروتينات الإنبات، يسبب صعوبات في تحليلاتها مجهرية باستخدام مجهر ابيفلوريسسينسي. القرار فائقة ثلاثي الأبعاد “المركبة إضاءة مجهرية” (3D-سيم) أداة واعدة للتغلب على هذه العقبة، وتكشف عن تفاصيل الجزيئية لعملية إنبات أبواغ عصيات نجحت (نجحت باء). هنا، يمكننا وصف استخدام سيمتشيك المعدلة (إيماجيج)-مساعد عملية التصوير ثلاثي الأبعاد والبروتينات الفلورية مراسل مجهرية سيم من جيرمينوسوميس جراثيم نجحت ، cluster(s) من البروتينات الإنبات. ونقدم أيضا إجراء تصوير سيم 3D (قياسية) لتلطيخ FM4-64 باء-نجحت بوغ الأغشية. باستخدام هذه الإجراءات، ونحن الحصول على قرار غير مسبوقة للتعريب جيرمينوسومي وتبين أن > 80% KGB80 باء-نجحت جراثيم نائمة تم الحصول عليها بعد تبوغ على المعرفة المتوسطة والمماسح الحد الأدنى لها واحد أو اثنين من غيرد-التجارة والنقل وجيركب-مشري البؤر. كما كانت البؤر مشرقة الملاحظة في FM4-64 الملون سيم 3D صور جراثيم مما يوحي بوجود مجالات الدهن الغشاء الداخلي لسيولة مختلفة يحتمل. مزيد من الدراسات أن استخدام مزدوج وسم الإجراءات مع الأصباغ الغشاء وجيرمينوسومي البروتينات مراسل لتقييم التعريب المشارك وهكذا الحصول على لمحة أمثل المنظمة عصيات إنبات البروتينات في الغشاء الداخلي بوغ ممكن.
جراثيم بأوامر باسيلاليس وكلوستريدياليس أيضي نائمة ومقاومة غير عادية لأنظمة تطهير قاسية، ولكن إلا إذا كانت تنبت، لا يمكن أن يسبب آثار ضارة بالبشر1. في المغذيات جيرمينانت المشغلة إنبات أبواغ عصيات نجحت (باء-نجحت)، الحدث بدء جيرمينانت ملزم لمستقبلات جيرمينانت (الموارد الوراثية) الموجود في الغشاء الداخلي بوغ (IM). وفي وقت لاحق، ترانسدوسي الموارد الوراثية إشارات للبروتين قناة سبوفا الموجود أيضا في الدردشة. وهذا يؤدي في بداية تبادل بوغ الأساسية حمض بيريدين-2, 6-ديكاربوكسيليك (حمض ديبيكولينيك؛ اتفاق دارفور للسلام؛ تضم 20 في المائة من بوغ الأساسية بالوزن الجاف) للمياه عن طريق قناة سبوفا. في وقت لاحق، الإفراج عن اتفاق دارفور للسلام يطلق تنشيط التحلل peptidoglycan اللحاء، وامتصاص كميات إضافية من الماء يتبع2،،من34. هذه الأحداث التي تؤدي إلى الإجهاد الميكانيكي على طبقات معطف، انفصامه اللاحقة، وظهور ثمرة، وأخيراً النمو الخضري. ومع ذلك، لا تزال بعيدة عن تحل التفاصيل الدقيقة الجزيئية لعملية الإنبات.
مسألة رئيسية حول إنبات بوغ تتعلق بالخصائص الفيزيائية الحيوية من الدهون المحيطة بالبروتينات إنبات الدردشة فضلا عن البروتينات قناة “الدردشة سبوفا”. هذا بلير الدهن إيم غير متحرك إلى حد كبير هو الحاجز الرئيسي النفاذية للعديد من الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك المواد الحافظة الكيميائية السامة، التي تمارس عملها في بوغ النواة أو الخلية النباتي السيتوبلازم5،6. Bilayer الدهن إيم من المرجح في حالة جل، على الرغم من أن هناك جزءا كبيرا من الدهون المتنقلة في التراسل الفوري5. وقد إيم بوغ أيضا إمكانات التوسع الكبير5. وبالتالي، يزيد من المساحة السطحية للدردشة 1.6-fold عند الإنبات دون تركيب غشاء إضافية ومصحوبا بفقدان هذا الغشاء مميزة منخفضة النفاذية والدهن الجمود5،6.
بينما التفاصيل الجزيئية تنشيط إنبات البروتينات وتنظيم الدهون إيم في جراثيم مواضيع جذابة للدراسة، صغر حجم الجراثيم ب-نجحت ووفرة منخفضة نسبيا من البروتينات الإنبات، تشكل تحديا أن التحليل المجهري. استخدام الصحفيين الفلورسنت تنصهر فيها البروتينات الإنبات، تقترح غريفيث et al ابيفلوريسسينسي المجهر أدلة دامغة، في جراثيم نجحت بروتين سقالة غيرد تنظم ثلاث مفارز غرام (ألف وباء وجيم) لغيرا وب ك الموارد الوراثية، في مجموعة7. مصطلح ‘جيرمينوسومي’ لهذه المجموعة من البروتينات الإنبات ووصفها الهياكل ~ 300 نانومتر كبير إيم البروتين البؤر8. عند بدء الإنبات بوغ، تفريق جيرمينوسومي نيون البؤر في نهاية المطاف تغيير إلى أكبر أنماط نيون، مع > 75% سكان بوغ عرض هذا النمط في جراثيم نامي على ح 1 مع لفالين8. لاحظ أن متوسط الورقة المذكورة أعلاه يستخدم الصور من عشرات الصور الفلورسنت على التوالي، للحصول على قوة إحصائية والتغلب على عقبة إشارات الفلورية منخفضة ولاحظ أثناء التصوير. لم هذا التصور لهذه الهياكل في الجراثيم البكتيرية على حافة ما هو ممكن من الناحية التقنية مع أدوات مجهرية الكلاسيكية ولا تقييم لمقدار البؤر في بوغ واحد لم يكن التعريب سوبسيلولار بهم أكثر تفصيلاً ممكن مع هذا النهج.
هنا، نحن توضح استخدام الإضاءة تنظيماً من (SIM) للحصول على مجموعة مرئيات تفصيلية مجهرية والتحديد الكمي ل germinosome(s) في جراثيم نجحت باء، فضلا عن تلك المجالات الدهن إيم9. ويتضمن البروتوكول أيضا تعليمات تبوغ وإعداد الشرائح وتحليل الصور التي سيمتشيك (v1.0، البرنامج المساعد إيماجيج) فضلا عن10،إيماجيج،من1112.
ويتضمن البروتوكول عرضت إجراء سيم 3D قياسية لتحليل الملون جراثيم نجحت 64 FM4 يتضمن تبوغ وإعداد الشرائح وعمليات التصوير. وبالإضافة إلى ذلك، وصف البروتوكول تعديل سيمتشيك (إيماجيج)-ساعدت 3D التصوير عملية مجهرية سيم من جيرمينوسوميس بوغ نجحت المسمى مع الصحفيين الفلورسنت. الإجراء الأخير ا…
The authors have nothing to disclose.
يشكر المؤلفون كريستيان زيلينبيرج لمساعدته أثناء تصوير سيم. جي دبليو يقر “مجلس المنح الدراسية الصيني” لزمالة درجة دكتوراه وشكرا إيرين ستيلينجويرف لمساعدة لها المرحلة الأولية من التصوير.
Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
Image J | |||
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
Nikon Eclipse Ti microscope | |||
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |