ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis
Summary
קולטן germinant אשכול חלבונים ב- ‘germinosomes’ בתוך הקרומית הפנימית של Bacillus subtilis נבגים. אנו מתארים פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה סופר כתב פלורסנט חלבונים כדי להמחיש germinosomes. הפרוטוקול מזהה החולקות הממברנה הפנימית נבג מוכתמים מעדיפים לצבוע הממברנה FM4-64.
Abstract
גודל קטן של נבגים שפע נמוכה יחסית של חלבונים נביטה, לגרום קשיים שלהם ניתוח מיקרוסקופי באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. סופר רזולוציה תלת מימדי מובנים תאורה מיקרוסקופ (3D-SIM) הוא כלי מבטיח כדי להתגבר על המכשול הזה ולחשוף את הפרטים מולקולרית של תהליך הנביטה של נבגים Bacillus subtilis (B. subtilis). כאן, אנו מתארים את השימוש SIMcheck שונה (ImageJ)-תהליך ההדמיה התלת-ממד עוזר וחלבונים פלורסנט כתב על ה-SIM מיקרוסקופיה של germinosomes B. subtilis נבגים, cluster(s) של חלבונים נביטה. אנו מציגים גם שגרה הדמיה תלת-ממד (רגיל)-SIM עבור FM4-64 מכתים של B. subtilis נבג ממברנות. באמצעות הליכים אלה, אנו להשיג רזולוציה מתחרות בלוקאליזציה germinosome ולהראות כי > 80% KGB80 B. subtilis נבגים רדום שהושג לאחר הנבגה באמצעי MOPS מינימלי מוגדר יש אחד או שניים GerD-GFP, GerKB-mCherry מוקדים. מוקדים בהיר היו גם FM4 נצפתה ב- 64 צבעונית תמונות 3D-SIM של נבגים רומז כי הממברנה הפנימית השומנים תחומי סביר שונים נזילות קיימים. בהמשך לימודי המשתמשות כפול תיוג הליכים עם ממברנה צבע ו germinosome כתב חלבונים כדי להעריך משותף לשפות אחרות, ובכך לקבל סקירה אופטימלית של הארגון של חלבונים נביטה Bacillus ממברנה הנבג הפנימי נמצאים אפשרי.
Introduction
נבגים של ההוראות Bacillales ו- Clostridiales סמויה רדום ועמיד בצורה יוצאת דופן בפני משטרים טיהור קשים, אבל אלא אם כן הם לנבוט, לא יכול לגרום השפעות מזיקות של בני אדם1. מזין germinant מופעלות נביטה של נבגים Bacillus subtilis (B. subtilis), הוא האירוע חניכה germinant קשירה לקולטנים germinant (GRs) הממוקם בקרום הפנימי של הנבג, (IM). לאחר מכן, GRs מגלי אותות אל החלבון ערוץ SpoVA ממוקם גם ההודעה. התוצאה היא תחילתה של חילופי נבג הליבה פירידין-2, 6-dicarboxylic (חומצה dipicolinic; DPA; הכוללת 20% של נבג הליבה יבש wt) עבור מים דרך תעלת SpoVA. לאחר מכן, מהדורת DPA מפעילה את ההפעלה של קליפת פפטידוגליקן הידרוליזה, ספיגת מים נוספת עוקב אחר2,3,4. אירועים אלה להוביל ללחץ מכני על הרבדים המעיל, קרע העוקבים שלה, תחילתה של תוצר ו, לבסוף, גידול וגטטיבי. עם זאת, הפרטים המדויקים מולקולרית של תהליך הנביטה מזוהים עדיין רחוק.
שאלה גדולה לגבי נבג נוגע המאפיינים ביופיזיקלי של ליפידים המקיפים את החלבונים נביטה IM, כמו גם את החלבונים ערוץ IM SpoVA. זה במידה רבה משותק שכבה ליפידית אים היא המכשול העיקרי חדירות של מולקולות קטנות רבות, כולל משמרים כימיים רעילים, אשר חלקם מפעילים פעולתם במרכז נבג או תא וגטטיבית הציטופלסמה5,6. אים שכבה ליפידית סביר במצב ג’ל, למרות שיש חלק משמעותי של ליפידים ניידים ב- IM5. אים של הנבג יש גם את פוטנציאל הרחבה משמעותית5. לפיכך, פני השטח של ההודעה מגדילה 1.6-fold על נביטה ללא ממברנה נוספים סינתזה מלווה אובדן זה קרום אופייני נמוכה חדירות ו ליפיד נייחות5,6.
בעוד הפרטים מולקולרית של ההפעלה של חלבונים נביטה וארגון של ליפידים IM בנבגים הם נושאים אטרקטיביים למחקר, גודל קטן של B. subtilis נבגים והשפע נמוכה יחסית של חלבונים נביטה, להוות אתגר כדי ניתוח מיקרוסקופי. גריפיתס ואח ‘ epifluorescence מיקרוסקופ ראיות משכנעות, באמצעות עיתונאים פלורסנט התמזגו חלבונים נביטה, מרמז כי בנבגים B. subtilis החלבון לגרדום GerD מארגן שלושה גרם subunits (A, B ו- C) עבור גארה, B K GRs, ב- אשכול7. הם טבע את המונח ‘germinosome’ עבור מקבץ של חלבונים נביטה, תיאר את המבנים ~ 300 ננומטר גדול IM חלבון foci8. באתחול של נבג, germinosome פלורסנט foci בסופו של דבר הופך גדול יותר לפזר דפוסי פלורסנט, עם > 75% של אוכלוסיות ספורה מציג את הדפוס הזה בנבגים מונבטים לשעה עם-ואלין8. שימו לב כי העיתון הנ ל משמש בממוצע תמונות מתוך עשרות תמונות פלורסנט רצופים, כדי לצבור עוצמה סטטיסטית להתגבר על המשוכה של אותות פלואורסצנט נמוך ציין במהלך דימות. הדמיה זו של המבנים הללו בנבגים בקטריאלי הייתה בקצהו של מה זה אפשרי מבחינה טכנית עם כלים מיקרוסקופיים קלאסית, גם הערכה של כמות מוקדים ב נבג יחיד ולא היה שלהם לוקליזציה subcellular מפורט יותר אפשרי עם גישה זו.
. הנה, נדגים את השימוש של מובנים תאורה מיקרוסקופ (SIM) כדי להשיג פריט חזותי נתונים היסטוריים, כימות germinosome(s) בנבגים B. subtilis, כמו גם תחומים שלהם השומנים IM9. הפרוטוקול מכיל גם הוראות הנבגה, הכנת שקופית וניתוח התמונה על-ידי SIMcheck (v 1.0, תוסף imageJ) כמו גם ImageJ10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול שהוצג מכיל שגרה 3D סטנדרטי-SIM עבור ניתוח של FM4-64 צבעונית B. subtilis נבגים הכוללת הנבגה, הכנת שקופית, הדמיה תהליכים. בנוסף, הפרוטוקול מתאר ששונה SIMcheck (ImageJ)-בסיוע 3D הדמיה תהליך SIM מיקרוסקופיה של B. subtilis נבג germinosomes שכותרתו עם כתבים פלורסנט. ההליך האחרון אפשר לנו להתבונן זה בתיוג עמום…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים כריסטיאן Zeelenberg על העזרה שלו במהלך ההדמיה SIM. JW מודה המועצה מלגה סין מלגת הדוקטורט ותודה איירין Stellingwerf עזרה במהלך השלב הראשוני של הדמיה.
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
References
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
- Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
- Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
- Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
- Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
- Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
- Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
- Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
- Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
- Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
- Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
- Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
- Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
- Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
- Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
- Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
- Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
- Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
- Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
- Swarge, B. N., et al. “One-Pot” sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).
