Summary
קולטן germinant אשכול חלבונים ב- 'germinosomes' בתוך הקרומית הפנימית של Bacillus subtilis נבגים. אנו מתארים פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה סופר כתב פלורסנט חלבונים כדי להמחיש germinosomes. הפרוטוקול מזהה החולקות הממברנה הפנימית נבג מוכתמים מעדיפים לצבוע הממברנה FM4-64.
Abstract
גודל קטן של נבגים שפע נמוכה יחסית של חלבונים נביטה, לגרום קשיים שלהם ניתוח מיקרוסקופי באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. סופר רזולוציה תלת מימדי מובנים תאורה מיקרוסקופ (3D-SIM) הוא כלי מבטיח כדי להתגבר על המכשול הזה ולחשוף את הפרטים מולקולרית של תהליך הנביטה של נבגים Bacillus subtilis (B. subtilis). כאן, אנו מתארים את השימוש SIMcheck שונה (ImageJ)-תהליך ההדמיה התלת-ממד עוזר וחלבונים פלורסנט כתב על ה-SIM מיקרוסקופיה של germinosomes B. subtilis נבגים, cluster(s) של חלבונים נביטה. אנו מציגים גם שגרה הדמיה תלת-ממד (רגיל)-SIM עבור FM4-64 מכתים של B. subtilis נבג ממברנות. באמצעות הליכים אלה, אנו להשיג רזולוציה מתחרות בלוקאליזציה germinosome ולהראות כי > 80% KGB80 B. subtilis נבגים רדום שהושג לאחר הנבגה באמצעי MOPS מינימלי מוגדר יש אחד או שניים GerD-GFP, GerKB-mCherry מוקדים. מוקדים בהיר היו גם FM4 נצפתה ב- 64 צבעונית תמונות 3D-SIM של נבגים רומז כי הממברנה הפנימית השומנים תחומי סביר שונים נזילות קיימים. בהמשך לימודי המשתמשות כפול תיוג הליכים עם ממברנה צבע ו germinosome כתב חלבונים כדי להעריך משותף לשפות אחרות, ובכך לקבל סקירה אופטימלית של הארגון של חלבונים נביטה Bacillus ממברנה הנבג הפנימי נמצאים אפשרי.
Introduction
נבגים של ההוראות Bacillales ו- Clostridiales סמויה רדום ועמיד בצורה יוצאת דופן בפני משטרים טיהור קשים, אבל אלא אם כן הם לנבוט, לא יכול לגרום השפעות מזיקות של בני אדם1. מזין germinant מופעלות נביטה של נבגים Bacillus subtilis (B. subtilis), הוא האירוע חניכה germinant קשירה לקולטנים germinant (GRs) הממוקם בקרום הפנימי של הנבג, (IM). לאחר מכן, GRs מגלי אותות אל החלבון ערוץ SpoVA ממוקם גם ההודעה. התוצאה היא תחילתה של חילופי נבג הליבה פירידין-2, 6-dicarboxylic (חומצה dipicolinic; DPA; הכוללת 20% של נבג הליבה יבש wt) עבור מים דרך תעלת SpoVA. לאחר מכן, מהדורת DPA מפעילה את ההפעלה של קליפת פפטידוגליקן הידרוליזה, ספיגת מים נוספת עוקב אחר2,3,4. אירועים אלה להוביל ללחץ מכני על הרבדים המעיל, קרע העוקבים שלה, תחילתה של תוצר ו, לבסוף, גידול וגטטיבי. עם זאת, הפרטים המדויקים מולקולרית של תהליך הנביטה מזוהים עדיין רחוק.
שאלה גדולה לגבי נבג נוגע המאפיינים ביופיזיקלי של ליפידים המקיפים את החלבונים נביטה IM, כמו גם את החלבונים ערוץ IM SpoVA. זה במידה רבה משותק שכבה ליפידית אים היא המכשול העיקרי חדירות של מולקולות קטנות רבות, כולל משמרים כימיים רעילים, אשר חלקם מפעילים פעולתם במרכז נבג או תא וגטטיבית הציטופלסמה5,6. אים שכבה ליפידית סביר במצב ג'ל, למרות שיש חלק משמעותי של ליפידים ניידים ב- IM5. אים של הנבג יש גם את פוטנציאל הרחבה משמעותית5. לפיכך, פני השטח של ההודעה מגדילה 1.6-fold על נביטה ללא ממברנה נוספים סינתזה מלווה אובדן זה קרום אופייני נמוכה חדירות ו ליפיד נייחות5,6.
בעוד הפרטים מולקולרית של ההפעלה של חלבונים נביטה וארגון של ליפידים IM בנבגים הם נושאים אטרקטיביים למחקר, גודל קטן של B. subtilis נבגים והשפע נמוכה יחסית של חלבונים נביטה, להוות אתגר כדי ניתוח מיקרוסקופי. גריפיתס ואח ' epifluorescence מיקרוסקופ ראיות משכנעות, באמצעות עיתונאים פלורסנט התמזגו חלבונים נביטה, מרמז כי בנבגים B. subtilis החלבון לגרדום GerD מארגן שלושה גרם subunits (A, B ו- C) עבור גארה, B K GRs, ב- אשכול7. הם טבע את המונח 'germinosome' עבור מקבץ של חלבונים נביטה, תיאר את המבנים ~ 300 ננומטר גדול IM חלבון foci8. באתחול של נבג, germinosome פלורסנט foci בסופו של דבר הופך גדול יותר לפזר דפוסי פלורסנט, עם > 75% של אוכלוסיות ספורה מציג את הדפוס הזה בנבגים מונבטים לשעה עם-ואלין8. שימו לב כי העיתון הנ ל משמש בממוצע תמונות מתוך עשרות תמונות פלורסנט רצופים, כדי לצבור עוצמה סטטיסטית להתגבר על המשוכה של אותות פלואורסצנט נמוך ציין במהלך דימות. הדמיה זו של המבנים הללו בנבגים בקטריאלי הייתה בקצהו של מה זה אפשרי מבחינה טכנית עם כלים מיקרוסקופיים קלאסית, גם הערכה של כמות מוקדים ב נבג יחיד ולא היה שלהם לוקליזציה subcellular מפורט יותר אפשרי עם גישה זו.
. הנה, נדגים את השימוש של מובנים תאורה מיקרוסקופ (SIM) כדי להשיג פריט חזותי נתונים היסטוריים, כימות germinosome(s) בנבגים B. subtilis, כמו גם תחומים שלהם השומנים IM9. הפרוטוקול מכיל גם הוראות הנבגה, הכנת שקופית וניתוח התמונה על-ידי SIMcheck (v 1.0, תוסף imageJ) כמו גם ImageJ10,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. subtillis דרב הנבגה (תזמון: 7 ימים לפני תצפית מיקרוסקופית)
-
יום 1
- פסים של התרבות חיידקי על צלחת (1% טריפטון תמצית שמרים 0.5%, 1% NaCl, 1% אגר) אגר לוריא-Bertani מרק (LB)13 , דגירה בין לילה ב 37 ° C כדי להשיג אחת המושבות. המתח (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry החתול, גרד-gfp קאן) KGB80 B. subtilis ולהשתמש שלה האב רקע זן B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) כפי שתואר לעיל7.
הערה: השימוש של נבגים עם רקע ΔcotEΔgerE חיוני ב- germinosome ויזואליזציה, על מנת לצמצם את autofluorescence של שכבות המעיל7נבג. - לעקר את כל אמצעי התקשורת, צינורות, pipets וחומרים נוספים תרבות כדי לשמש שיטות המתאימות.
- פסים של התרבות חיידקי על צלחת (1% טריפטון תמצית שמרים 0.5%, 1% NaCl, 1% אגר) אגר לוריא-Bertani מרק (LB)13 , דגירה בין לילה ב 37 ° C כדי להשיג אחת המושבות. המתח (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry החתול, גרד-gfp קאן) KGB80 B. subtilis ולהשתמש שלה האב רקע זן B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) כפי שתואר לעיל7.
-
יום 2
- לחסן שמושבה בודדת לתוך מ ל LB בינוני בשעות הבוקר המוקדמות, דגירה התרבות תחת עצבנות מתמדת בשפופרת פקקי בורג ב 200 סל"ד/min ו- 37 ° C עד ה OD600 מגיע 0.3-0.4 (כ- 7 שעות).
- להפוך 500 מ"ל של המגבים בינוני (pH 7.5) המכיל 3 ננומטר (NH4)6מו7O24·4H2O, 0.4 μM H3בו3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 ננומטר ZnSO4·7H2O, מ מ 1.32 K2HPO4, MgCl 0.4 מ מ2·6H2O, 0.276 מ מ K2אז4, 0.01 מ מ מכל4·7H2O, מ"מ 0.14 CaCl2·2H2O, 80 מ מ מגבים, מכשירי, 4 מ מ Tricine, MnCl 0.1 מ מ2·2H2O, 10 מ מ D-גלוקוז-monohydrate, ו 10 מ מ NH4Cl.
- להכין בתוך צינורות 10 פקקי בורג-1- 10-7 דילולים טורי של התרבות LB ב 5 מ ל MOPS בינוני, דגירה התרבויות בין לילה תחת עצבנות רציפה ב 200 סל"ד/min ו- 37 מעלות צלזיוס.
הערה: דילולים טורי שהוכנו כאן שואפים להשיג לדילול בשלב מעריכי מוקדם בבוקר הבא. שלב זה, השלב הבא נחוצים לאפשר את התאים להסתגל מדיום הגידול במאגר המגבים.
-
יום 3
- בחר באחת המגבים דילולים עם יתר600 של 0.3-0.4. לחסן 0.2 מ"ל של התרבות ומחוממת מראש (37 מעלות) 20 מ של המגבים בינוני בבקבוקון חרוט 250 מ ל, דגירה תחת עצבנות מתמדת עד ה OD600 מגיע 0.3-0.4 (~ 7 h).
- לחסן המדיום המבוססת על הנבגה מגבים (250 מ"ל) עם 1% (v/v) תרבות טרום מהשלב 1.3.1, תקופת דגירה של 3 ימים ב- 37 מעלות צלזיוס בבקבוקון ליטר חרוט תחת עצבנות מתמדת. עבור FM4-64 מכתים PS4150 נבגים, להוסיף 2 µg/mL FM4-64 בדיקה (ראה טבלה של חומרים) ש בינוני 1 או 2 הנבגה לאחר שהגיע לשיא OD ערך600 של גידול וגטטיבי (בדרך כלל כ 2) ולאפשר את תרבות לאחר מכן sporulate תוך כדי להגן עליה מפני אור5.
-
יום 7: קציר של נבגים
- לקבוע את התשואה הנבגה (נבגים vs וגטטיבי תאים) באמצעות מיקרוסקופ לעומת זאת שלב בהגדלה X 100 כדי להבחין בין שלב הנבגים בהיר מתאי כהה שלב, כנראה שאינו בוגר נבגים. תשואה נבג בהיר 90% שלב צפוי.
- גלולה הנבגים ב x 4,270 g למשך 15 דקות ב 4 ° C התחתון עגול צנטריפוגה צינורות. רחץ בגדר נבג 2 - 3 פעמים עם 40 מיליליטר מים סטריליים סוג 1 demineralized אולטרה טהור צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מ ל (ראה טבלה של חומרים). ספין-מטה ברחיצת כל ב x 4,270 g למשך 15 דקות (4 ° C).
-
יום 7: נבג טיהור
- נבג כלים להשתמש טיהור: להשעות את צניפה נבג ב 750 µL של 20% nonionic צפיפות בינונית הדרגתי (ראה טבלה של חומרים) ולא להעמיס על 800 µL של 50% nonionic צפיפות בינונית הדרגתיות צינורות microcentrifuge מעוקר. צנטריפוגה עבור 60 דקות ב 21,500 x g. בגדר שהושג מכיל את הנבגים חינם. להשעות בגדר נבג ב 200 µL של 20% nonionic צפיפות בינונית הדרגתיות, להעמיס על 1 מ"ל של 50% nonionic צפיפות בינונית הדרגתיות microcentrifuge tube, ולאחר צנטריפוגה למשך 15 דקות ב 21,500 x g.
- לשטוף את אחסון והכנה נבג הסופי: בגדר שהושג מכיל את הנבגים רדום מטוהרים. שטיפת בגדר נבג 2 - 3 פעמים עם 1.5 מיליליטר סטרילי-אולטרה טהור סוג 1 מים (ראה טבלה של חומרים) ולמטה ספין-בין ב 9,560 x g למשך 15 דקות ב 4 º C. לבסוף, להשעות את צניפה ב סטרילי מים סוג 1 אולטרה טהור OD סופית600 של 30. Aliquots של הנבגים שניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס במשך 8 שבועות14.
2. decoating
- לטפל PS4150 נבגים עם 0.1 M NaCl/0.1 M NaOH/1% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) / dithiothreitol M 0.1 (DTT) ב 70 ° C עבור ה 1 לשטוף את הנבגים 10 פעמים עם סטיריליים אולטרה טהור סוג 1 מים15,16. בעשותם כך, כל הספוחה המכשיר FM4-64 הממברנה החיצונית של נבג, שכבות חיצוניות יוסרו.
3. Coverslip והכנות שקופית11 (תזמון: H 1 לפני תצפית)
- דיוק גבוהה מראש נקי coverslips (ראה טבלה של חומרים) עם HCl M 1 למשך 30 דקות באמבט מים חזק בעדינות. לשטוף את coverslips פעמיים במים סוג 1 אולטרא טהורים ואחסן אותם ב-100% (vol/כרך) EtOH. תני להם להתייבש, לאמת שלהם בהירות לפני השימוש. מראש לנקות בשקופיות זכוכית 70% EtOH. תני להם להתייבש, לאמת שלהם בהירות לפני השימוש.
4. דגימה Microspheres פלורסנט או נבגי במסגרת הגן שקופית10 (עיתוי 15 דקות)
- לחמם שני 70% EtOH ניקה, אוויר שקופיות זכוכית מיובשים (ראה טבלה של חומרים) למשך מספר שניות על בלוק חימום 70 מעלות צלזיוס, ירידה μL 65 של agarose 2% סטיריליים שנערך ב- 70 מעלות צלזיוס מעל כוס אחת השקופיות, למקם את השקופית זכוכית אחרים למעלה כדי להפיץ את b agarose etween השקופיות. התיקון agarose יתייבש כ 5 דקות.
- חותכים את התיקון agarose מקטע 1 x 1 ס מ לאחר הסרת אחת מהשקופיות זכוכית, להוסיף μL 0.4 מדגם (microspheres פלורסנט או נבגים של ~ 108/mL), ולהעביר את התיקון על גבי coverslip ברמת דיוק גבוהה על-ידי הצבת את coverslip על התיקון, . להתקלף.
- לתקן את מסגרת הגן (1.5 x 1.6 ס מ2, 65 µL) על גבי השקופית מיובשים, שעליו מונחת על coverslip לסגור את כל הפינות של המסגרת, ובכך להשלים את השקופית עבור שימוש במיקרוסקופ.
5. הדמיה11,17(תזמון: 1 H)
- לכידת תמונות שידור, זריחה של נבגים, כמו גם תערובת של אדום, צהוב, ירוק carboxylate שונה פלורסנט microspheres על מיקרוסקופ תאורה מובנית (ראה טבלה של חומרים) מצוידים 100 x (אובייקטיבית שמן מפתח נומרי = 1.49), CCD מצלמה ותמונה ניתוח תוכנה (ראה טבלה של חומרים). ליצור כל התמונות בטמפרטורת החדר ללא ההפרעה של אור מקיף. הקפד תמיד מנקה את 100 x אובייקטיבית, השקופית עם 75% אתנול לפני הדמיה.
- להתמקד 100 ננומטר (קוטר) microspheres פלורסנט ולמטב את הפונקציה הליין (psf) על-ידי התאמת הטבעת תיקון על המטרה 100 x עד psf סימטרי מתקבל, ובכך לחסוך טשטוש התמונה. Psf הוא את תגובת הלם או התגובה של מערכת הדמיה המקור או אובייקט נקודה.
- בחר תצוגה של שדה כ 10 עגול microspheres פלורסנט. להחיל על פומפיה למקד את ההתאמה עבור שניהם 561 nm ו 488 ננומטר, עירור גל אורכי כמדריך עבור תוכנת ניתוח התמונה.
- למקד את הנבגים עם האור שידור, לכידת תמונת אור שידור במצב 16 × ממוצע עם 200 ms חשיפות עבור כל תמונה.
- לכידת תלת-ממד-SIM בתמונות פלורסנט raw של הנבגים עם מצב תאורה "3D-SIM", הגדרות המצלמה למצב readout הכפלת אלקטרון (EM) רווח 10 מגה-הרץ ב- 14-bit, ורווח EM-175. לרגש החללית FM4-64 בנבגים PS4150 עם 561 אור לייזר nm ב 20% עוצמת הלייזר ולאחר תקופה תאורה של 400 אלפיות שניה.
- לרגש את GerKB-mCherry, גרד-GFP ב KGB80 נבגים עם, בהתאמה, 561 ננומטר לייזר אור עוצמת הלייזר 30% 1 s, ואור 488 ננומטר לייזר של 60% לייזר כוח עבור הגדרות Z-מחסנית ס' 3 הם החלק העליון לחלק התחתון מצב, 0.2 µm / צעד, 7 השלבים, השלבים 20 עבור germinosome ו ניתוח IM, בהתאמה.
הערה: פרמטרים אלה לייזר הוחלו על מנת להבטיח ערך בהירות מרבית של החלון היסטוגרמה של סביב 4,000.
6. לשחזר תמונות Raw 3D-SIM של FM4-64 צבעונית PS4150 נבגים
- לבצע את השחזור פרוסה N-SIM עבור FM4-64 צבעונית הנתונים הגולמיים של PS4150 נבגים. לחץ על לחצן Param עבור לשחזר פרוסה על הסדין tab pad N-SIM כדי לפתוח את החלון N-SIM שחזור פרוסה.
- להגדיר את הפרמטרים שחזור בחלון N-SIM שחזור פרוסה . כדי לקבל תמונות המשוחזרת מושלם, בעקבות הצעתו של ההוראות N-SIM ולחץ על הפקדים המתאימים בחלון N-SIM פרוסה שחזור כדי להגדיר את תאורה אפנון ניגודיות (מל י) אוטומטי, גבוהה דיכוי רעש רזולוציה (HRNS) 1.00, מתוך מוקד טשטוש דיכוי (OFBS) עד 0.05 כנקודות התחלה.
- לחץ על הלחצן בנייה מחדש פרוסה בחלון N-SIM פרוסה שחזור כדי לשחזר את התמונה. הערכת האיכות של תמונות שוחזר על ידי תמונות מהר פורייה טרנספורמציה (FFT) תוצאת שחזור, אשר להציג לאחר שחזור12.
- להתאים את HRNS מ- 0.10 5.00 ו OFBS מ 0.01 עד 0.50 על ידי לחיצה על הפקדים המתאימים בחלון N-SIM שחזור פרוסה עד ההגדרות פרמטר מתקבלים.
- לחץ על הלחצן ' החל ' בחלון Reconstuction פרוסה N-SIM כדי להחיל פרמטרים שהשתנו. לחץ על סגור כדי לסגור את החלון.
- להפוך FM4-64 צבעונית PS4150 נבגים raw התמונה הפעילה, לחץ על לחצן לשחזר פרוסה על הסדין tab N-SIM Pad לבצע שחזור פרוסה. לשמור את התמונה המשוחזרת.
7. ניתוח תמונות
-
המרת תמונות פסאודו-Widefield של germinosome KGB80
- להמיר תמונות raw 3D-SIM של KGB80 פסאודו-Widefield תמונות על ידי הפעלת באמצעות לחיצה שמאלה התוסף ImageJ SIMcheck כלי סי נתונים גולמיים פסאודו-Widefield12. פסאודו-Widefield הממוצע של תמונות מ- SIM נתונים גולמיים, מרכיב, לשם השוואה, תמונה שווה ערך ל widefield המקובלת תאורה12. ראו ImageJ עצמו https://imagej.net/Welcome. בחר באופן אקראי ~ 25 נבגים כל תמונה הפוכה שידור לניתוח germinosome בשלב מאוחר יותר של תמונות פסאודו-Widefield פלורסנט.
- בחר סה כ- 350 (בדוגמה זו, 346) נבגים KGB80 ב- 14 שדות ראייה בין שתי שקופיות. המספרים foci פלורסנט GerD-GFP, GerKB-mCherry בנבגים KGB80 הנבחרת צריכה להיחשב באופן עצמאי על ידי שני חוקרים. החוקר יכול להתייחס בחזרה תמונות raw 3D-SIM בכל פעם בספק נוכחות של מוקדים נפרדים germinosome פלורסנט בנבגים.
- להעריך את עוצמות המרבי של כל מוקד GerD-GFP, GerKB-mCherry לבין עוצמת משולב של תמונה תלת-ממדית של כל נבג KGB80 עם ImageJ.
-
לנתח פסאודו-Widefield תמונות של germinosome KGB80
- להשתמש בערך כלומר העוצמה משולב של 7 ערימות עוצמת האות משולב של הנבג KGB80. לקבוע רקע עוצמות על ידי הדמיה המתח רקע PS4150 באמצעות הגדרות זהות. רואים כתמים פלורסנט בנבגים KGB80 בודדים מוקדים germinosome כאשר הם ניתן להבחנה ברורה מהרקע.
- החל חד-כיווני אנובה-בדיקות לקביעת המשמעות עם תוכנת מקור 9.0. בהתחשב P ערכים < 0.05 כמו סטטיסטית משמעותית. השתמש מקדם המתאם דרגה של ספירמן18 כדי להעריך הקורלציה של GerD-GFP ומספר מוקדים GerKB-mCherry, את המידות של עוצמת האות משולב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול הנוכחי מציג SIM מיקרוסקופ הדמיה הליך של נבגים של חיידקים. ההליכים הכנה הנבגה והחלק בוצעו כפי שמוצג באיור 1 לפני הדמיה. מאוחר יותר, ההליכים הדמיה וניתוח הוחלו הן עבור עמעם (חלבון פלואורסצנטי שכותרתו נביטה חלבונים) ובהיר נבג (lipophilic העצמית צבעונית IM) דוגמאות כפי שמוצג בטקסט הבא.
לוקליזציה של germinosomes ב- B. subtilis נבגים
רמות של GerD GerKB מדווחים להיות מולקולות ~ 3,500 ו ~ 700 לכל נבג, בהתאמה, בהתבסס על ניתוחים תספיג של תמציות מנבגים המבושלות הנבגה עשיר בינוני19. גנים gerD-gfp וגם gerKB-mCherry המתח KGB80 נמצאים תחת השליטה של promotor מקורי שלהם. שפע נמוך יחסית של פיוז'ן חלבונים הובילה אות ניאון נמוכים במהלך הדימות, אז זה היה קשה לשחזר תמונות SIM raw עמום כזה על ידי האלגוריתם שחזור סים. עם זאת, המיקרוסקופ SIM הוחל עדיין עבור רכישת התמונה germinosome, למרות הדימויים SIM raw הומרו פסאודו-Widefield תמונות על-ידי SIMcheck (תוסף ImageJ). בנוסף, הדמיה תלת-ממדית מחסנית שבע יושמה כדי לקבל סקירה טובה יותר של התמקדות אים זו. כפי שמוצג בחלונית השמאלית של איור 2, שני מוקדים של GerD-GFP הופיע בערימות שונות. בסך הכל, שלושה מוקדים GerD-GFP מסומנים באמצעות החצים הלבנים בערימה של העמודה compositive Z3. החלונית הימנית של איור 2 מציג נבג עם GerD-תוצר אחד בלבד מוקד הנבג כפי שמעידים על החץ הלבן בערימה Z4 של העמודה ללא הפרדות צבע. בסך הכל, כ 40% ל- 50% של נבגים, גם לי היו אשכול אחד GerD-GFP, GerKB-mCherry, בהתאמה (טבלה 1). בין הנבגים 346 בחן, שניים 4 מוקדים GerD-GFP, והיו נבג אחד אפילו 5 מוקדים GerD-GFP. במידה ניכרת, בידיים שלנו, מספר מוקדים GerD-GFP, GerKB-mCherry של הנבג אותו לא תמיד היו באותו18. מיקרוסקופ ה-SIM היה אין אפשרות הניגודיות שלב, השתמשנו מיקרוסקופ אור שידור עבור נבג לוקליזציה. לפיכך, נבגים מופיעות עם גרעין כהה וצפוף מוקפת הילה בהיר יותר.
עוצמת קרינה פלואורסצנטית משולב KGB80 נבגים נמדדה על ידי ImageJ. . נבגים, אשר היה 0, 4 או 5 מוקדים לא נכללו לתוך שלנו ניתוח סטטיסטי עקב תדירות נמוכה שלהם. היה מתאם חיובי גבוה בין GerD-GFP עוצמות GerKB-mCherry משולב (מקדם המתאם דרגה ספירמן = 0.73). בעוד עוצמת משולב של החלבון לגרדום GerD-GFP היה שונה בין אוכלוסיות שונות (איור 3C), האינטנסיביות משולבת של GerKB-mCherry היה כמעט זהה בקרב אוכלוסיות שונות (דמות תלת-ממד). עוצמת קרינה פלואורסצנטית המרבי foci GerD-GFP, GerKB-mCherry נטו כדי להקטין, כשהייתה הנבג מוקדים מרובים (איור 3 א, ב'). קרינה פלואורסצנטית המרבי של כל נקודות האור, נחשב germinosome מוקדים, היה גבוה יותר מאשר המירבי האוטומטית-קרינה פלואורסצנטית PS4150 נבגים (נבגים של המתח רקע KGB80; איור 3 א ב').
הארגון של קרום פנימי
כאמור במבוא, חלבונים germinosome ממוקמים IM של הנבג. עם זאת, פרטים מעטים ידועים על מאפייני זה קרום במידה רבה משותק ביופיזיקלי. חוקרים פרטים נוספים, כגון ארגון מקומי ההודעה, תקדם את ההבנה של הארגון של חלבונים IM, GRs מסוים, ערוץ חלבונים. B. subtilis הנבגים יש מבנה הכוללת מספר שכבות קונצנטריות ולאחר בדיקה lipophilic אינם יכולים בקלות לעבור אלה שכבות מרובות כדי להכתים את IM שסביבו נבג. המעבר של הגששים כזה היא קרוב לוודאי הקשו על ידי השכבות המעיל עשירים בחלבון, ואולי גם את הממברנה החיצונית20,21. כדי להתגבר על בעיה זו, לצבוע ממברנה lipophilic FM4-64 נוספה לתרבות PS4150 במהלך הנבגה. בעשותם כך, קרום התא PS4150 וגטטיבי הוכתם FM4-64, ובכך ממברנות forespores המתקבל תרבות זו חלוקת התא הנבגה אסימטרי, forespore הבאים היבלעות טוב מוכתמים5. כתוצאה מכך, הממברנות של הנבג בוגרת ניתן לאבחן. מחקר קודם הראה כי רוב אם לא כל FM4-64 היא אים הנבגים נקי5. במהלך תקופת שבוע כ- 2 של דגירה וטיפולים טיהור נבג, ההליכים כביסה חלה להסיר כל FM4-64 של הממברנה החיצונית האחרון ביעילות הוסר בעקבות הטיפול decoating, מקיף שטיפת מדרגות 5. עם זאת, ההליך decoating מסיר אין FM4-64 IM, ולא השפעה כלשהי על germinosome מוקדים5,6. מה ריגש אותנו הוא בהיר יותר FM4-64 נקודות הדומה germinosome מוקדים הופיעו שני שלמים (איור 4A, B), decoated נבגים (איור 4C, יח) PS4150 נבגים. אלה כתמים FM4-64 בהיר יכול להיות מעורב של קיבוץ באשכולות של חלבונים germinosome אים.
איור 1: סקירה של הכנה הנבגה והחלק. מבט כולל הצגת השלבים הראשונים הדרושים לפני הדמיה. מידע מפורט ניתן בפרוטוקול. (א) הסכמה של ההליך הנבגה ב MOPS מינימלי מוגדר בינוני. PS4150 B. subtilis (Δ PS832גיר::spc Δקוט::ט) או KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry חתול gerD-gfp קאן) שמושבה בודדת היה תרבותי ב 5 מ ל LB עשיר בינוני, ומותאמים ב 5 מ ל ו 20 מ של המגבים בינוני בתורו, ולבסוף sporulated ב 250 מ של המגבים בינוני. תרבות בשלב מוקדם מעריכית (OD600, 0.3-0.4) משמש בכל התרבויות ביניים. FM4-64 (2 µg/mL) נוספו אמצעי הנבגה PS4150 עבור ממברנה נבג מכתים 1 או 2 h כשמגיעים הערך600 שיא OD. (B) שיטת קציר נבגים מתרבות הנבגה MOPS וטיהור נבגים על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות. (ג) הליך של ייצוב נבגים על 1% משטח agarose בחדר מסגרת הגן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: נציג פסאודו-Widefield (PWF) 3D תמונות של מוקדים GerD-GFP, GerKB-mCherry בתמונות raw שני KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry חתול gerD-gfp קאן) רדום נבגים של 3D-SIM צולמו עם ערוץ כפול עירור (561nm, עוצמת הלייזר 30%, 1 s. 488nm, 60% לייזר כוח, 3 s) באמצעות 7 השלבים מלמעלה למטה Z-במחסן. לאחר מכן, הדימויים SIM raw הומרו תמונות 3D מדומה-Widefield על ידי תוסף ImageJ SIMcheck. משמאל נכון, 3D תמונות (Z2-Z5) של GerD-GFP (ירוק), GerKB-mCherry (אדום) ותמונות ללא הפרדות צבע המתאים של נבגים KGB80 שני (i ו- ii) מוצגים בחלונית ' '. תמונות אור שידור (שקף) של שני נבגים (i ו- ii) ציין את המיקום של נבגים מופיעות כתמונות צפופה כהה, מוקפת הילה בהיר יותר. סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר כל לוחות הם ההגדלה אותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: עוצמת קרינה פלואורסצנטית המרבי GerD-GFP בנבגים KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry חתול gerD-gfp קאן) רדום, לבין עוצמת המירבי אוטומטית-זריחה PS4150 נבגים ביחידות שרירותי. כל הנבגים היה מואר על ידי ההגדרות שצוינו בפרוטוקול. פאנלים (A) ו- (B) להציג עוצמת קרינה פלואורסצנטית המרבי foci GerD-GFP, GerKB-mCherry, בהתאמה, KGB80 נבגים רדום כמו גם כמו בשני המקרים עוצמת המירבי אוטומטית-קרינה פלואורסצנטית הנבגים האב PS4150. פאנלים (ג) ו- (ד) הצג את עוצמת קרינה פלואורסצנטית משולב של מוקדים GerD-GFP ואת עוצמת קרינה פלואורסצנטית משולב מוקדים GerKB-mCherry, בהתאמה, ב- B. subtilis KGB80 נבגים רדום. השתמשנו חד-כיווני אנובה-בדיקות לקביעת משמעותם של הבדלים בעוצמה מקסימלית מוקד ועוצמות קרינה פלואורסצנטית נבג משולב עם תוכנת מקור 9.0 בהתחשב P ערכים < 0.05 כמו משמעותית. נבגים עם 4 או 5 מוקדים נכללו בניתוח בשל שפע נמוכה שלהם. הנתונים מיוצג boxplots מחורץ. החריצים של החלקות הן סביב הערכים החציוני שנמדדו שלהם ברוחב פרופורציונלי טווח בין רבעוני (IQR). נכון המוצגים מייצגים מספר מרבי של 1.5 IQR. כוכביות להצביע על הבדל משמעותי של ערכים. גרד-GFP ועוצמות קרינה פלואורסצנטית GerKB-mCherry משולב יש מתאם חיובי חזק (מקדם מתאם ספירמן = 0.73)18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: נציג פסאודו-Widefield (PWF) תמונות (A ו- C) ותמונות המשוחזרת SIM (B ו- D) של FM4-64 צבעונית IM של B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) נבגים. FM-464 סופחה נבגים במהלך הנבגה. 3D-SIM בתמונות raw של נבגים שלם (A ו- B), decoated נבגים (C ו- D) שצולמו עם ערוץ אחד עירור (561 ננומטר לייזר, לייזר 20% כוח, 400 ms) באמצעות שלב 25 מלמעלה למטה Z-מחסנית. כתוצאה מכך, הנתונים הגולמיים SIM שוחזר על ידי המיקרוסקופ imaging התוכנה (ראה טבלה של חומרים) לתמונות תלת-ממד-SIM, או להמיר אותו PWF על ידי SIMcheck (תוסף ImageJ). החיצים ציאן הצבע FM4-64 מוקדים אים בחלונית B ו- D. סרגל קנה מידה = 1 μm כל לוחות הם ההגדלה אותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| זן | נבגים ספרתי | מוקדים | מוקדים לכל נבג (%) | |||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||||
| KGB80 | 346 | גרד-GFP | 2 | 46 | 40 | 11 | 1 | 0 | ||
| GerKB-mCherry | 2 | 53 | 40 | 5 | 0 | 0 | ||||
טבלה 1: נוכחות של מוקדים בנבגים KGB80. מספר מוקדים germinosome לכל נבג אוכלוסיה של כפול שכותרתו B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry החתול gerD-gfp קאן) נבגים רדום. קרינה פלואורסצנטית בנבגים נספר כמו germinosome מוקדים כאשר העוצמה המקסימלית של מוקד היה גבוה יותר מאשר העוצמה אוטומטי-זריחה, אשר היה העוצמה המקסימלית של PS4150 (Δ PS832גיר::spc Δקוט::ט) . נבגים רדום נרגש באותן הגדרות תאורה כמו הנבגים KGB80
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול שהוצג מכיל שגרה 3D סטנדרטי-SIM עבור ניתוח של FM4-64 צבעונית B. subtilis נבגים הכוללת הנבגה, הכנת שקופית, הדמיה תהליכים. בנוסף, הפרוטוקול מתאר ששונה SIMcheck (ImageJ)-בסיוע 3D הדמיה תהליך SIM מיקרוסקופיה של B. subtilis נבג germinosomes שכותרתו עם כתבים פלורסנט. ההליך האחרון אפשר לנו להתבונן זה בתיוג עמום עם חדות משופרת. על ידי צימוד משתי השגרות הדמיה, זה אפשר לדמיין דיסקרטית מבנים תת הנבג אותו עם המיקרוסקופ SIM אותו, ובכך שיפור שלנו בסיס להבנה מכניסטית של תהליך הנביטה. שימו לב: ההליך פועל ברזולוציה לרוחב של ~ 100 ננומטר והרזולוציה צירית של ~ 200-250 ננומטר. . זה יותר חדות התערבות דיפרנציאלית (DIC) לגישת מיקרוסקופיית שדה רחב על ידי גריפית7. זמן לפתור ניתוח של germinosome מראה באתחול של נביטה יהיה צעד הבא הרצוי. למרבה הצער, למרות SIM מיקרוסקופ הוא עקרוני תואם הדמיה לחיות, בגלל אופי עמום germinosome אותות כאלה SIM זמן לפתור, ניתוחים הם לא אפשרית בגלל הלבנת מהירה של הדגימות במהלך ייבוא תמונות. על מנת לקבל מספיק נבגים לניתוח, חשוב לוודא שאת הנבגה ביעילות מתקיים. חוקרים ולכן יש לבדוק את יעילות הנבגה בקפידה עם 90% יעילות כיעד. בתוצאות נציג, בנבגים רדום, בהתאמה ~ 50% ו- 40% של כל הנבגים יש אחד או שניים GerD-GFP מוקדים GerKB-mCherry (טבלה 1). אחוז נבגים עם שני מוקדים הוא הרבה יותר גבוה מזה שדווח על ידי גריפיתס בעבר7. ישנן מספר סיבות שיכול להסביר את התוצאה שונה בשנת העבודה הנוכחית. ראשית, 3D הדמיה תהליך יכול להקל על זיהוי מוקדים יותר. מוקדים שונים של הנבג באותו ממוקמים במקומות שונים בכיוון אנכי, כמוצג באיור1. שנית, מצלמת CCD (טבלה של חומרים) ואחדות הלייזר מצויד המיקרוסקופ SIM לתרום באופן משמעותי תוצאות הדמיה. השלישי, דומה לגישה של גריפיתס7 ממוצע עשרות תמונות רצופות לניתוח תמונה טובה יותר, דמות מדומה-Widefield germinosome היה גם תמונה ממוצעת מתמונות SIM raw (שלבים 5 ו- 3 כיוונים תמונות). לבסוף, בינוני הנבגה ומצבים הנבגה, משתנה חשוב לקביעת מאפייני נבג, שונים בעבודתנו ששימש בעבר. גריפיתס ואח7 בשימוש עשיר 2 x של שפר-גלוקוז (2 x ס ג) בינוני על הנבגה, בזמן המגבים מינימלי מוגדר בינוני במאגר הועסק כאן. בכמה עיתונים הדגימו כי הנבגה בינוני ותנאים יש השפעות משמעותיות על הרכב החלבון, התנגדות, וכי נביטה של B. subtilis נבגים22,23,24 , 25. אכן, הוכח כי רמות של GR subunits נמצאים 3 - ל 8 פי נמוך נבגים שהושג על מדיום עניים לעומת אלה שהושגו באמצעי-עשיר. גרד רמות היו גם בסביבות 3.5-fold התחתון בנבגים בינוני המסכן, הנבגים האלו. לקח יותר זמן להתחיל נבג נביטה26. עם זאת, זה לא ברור אם התנאים הנבגה גם להשפיע על מספר מוקדים germinosome נצפתה.
רמירז-פרלטה ואח.' s תוצאות26 הצביעו על המחירים של נביטה התזונתי של נבגים ברמות אוכלוסייה מושפעים באופן משמעותי הרמות של חלבונים נביטה, גרד. אם עוצמות פלורסנט משולב לכל נבג כלים להשתמש מן הכתבים פלורסנט ביחס ישר רמות החלבונים פיוז'ן GerD, GerKB, רמות של שני חלבונים פיוז'ן נבדלים באופן נרחב KGB80 נבגים, שהוא מסכים עם העבודות הקודמות 7. הזה הטרוגניות רמת חלבון קשורות נבג נביטה הטרוגניות נצפתה רמה נבג יחיד ולאחר מספר מוקדים germinosome יכול להיות גורם נוסף לתרום נבג נביטה הטרוגניות. לניסויים נוספים יתמקדו ניתוח של השפעה אפשרית למספר מוקדים הזה germinosome, מוקדים נביטה חלבון הרכב (לא כל germinosomes עשוי להיות שווה בהרכב חלבון נביטה) עלולה להיות על נביטה הטרוגניות. הנתונים הולידה מספר שאלות המחקר הנוכחי כולל: אני) מהו תפקידה של GerD בקיבוץ באשכולות של GRs אים; ו- ii) איך הם השני אחרים GRs, גרא, GerB, המסודרות הנבג IM?
פרוטוקול הציג נבג עמום, וקטן הדגימות מקל אפשר לדמיין דיסקרטית מבנים תת הנבג אותו על ידי מיקרוסקופ ה-SIM. נקודות האור FM4-64 אשר נצפו בנבגים ייתכן שהגורם קיפול נרחב של IM27. לחילופין, אנו משערים כי אזורים אלה הם אזורים של ההודעה איפה לצבוע יכול בקלות רבה יותר לקבל גישה עקב נזילות מוגברת אים המקומית. כזה אזורים של גדל נזילות (RIFs) עשוי להיות מאורגן על ידי אקטין cytoskeletal homologue MreB, הידוע בשל הריכוז שלו נוזל ליפיד קצר שרשרת ליפידים28,29. במידה ניכרת, החלת את ההליך פראי-סוג B. subtilis נבגים מוביל גם דפוס דומה של נקודות האור FM4-64 (התצפיות שלא פורסמו). בתאי צמח B. subtilis ,, תוצאות פוטנציאל ממברנה מכווצת קיבוץ באשכולות של MreB ו- RIFs29. קרום פנימי סביר רדום נבגים יש ממברנה נמוך יחסית20,פוטנציאליים21 והיא מכילה רמות לגילוי של MreB30 אשר עלול להוביל קיבוץ באשכולות של RIFs לתחומים גדול יותר של נזילות גבוהה29 . אם תחומים כאלה יכול לחפוף עם הנוכחות של germinosomes נמצא כעת תחת חקירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
שאין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מודים כריסטיאן Zeelenberg על העזרה שלו במהלך ההדמיה SIM. JW מודה המועצה מלגה סין מלגת הדוקטורט ותודה איירין Stellingwerf עזרה במהלך השלב הראשוני של הדמיה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| ImageJ | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
References
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
- Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
- Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
- Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
- Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
- Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
- Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
- Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
- Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
- Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
- Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
- Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
- Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
- Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
- Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
- Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
- Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
- Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
- Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
- Swarge, B. N., et al. "One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).
