‘Germinosomes’ 새 균의 subtilis 포자의 내부 막에서에 germinant 수용 체 단백질 클러스터. 우리는 슈퍼 해상도 현미경 및 형광 기자 단백질 germinosomes 시각화를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 또한 우선적으로 막 염료 FM4-64와 스테인드 포자 내부 막 도메인을 식별 합니다.
포자의 작은 크기와 발 아 단백질의 상대적으로 낮은 풍부한 epifluorescence 현미경 검사 법을 사용 하 여 그들의 미세한 분석에 어려움이 발생할. 슈퍼 해상도 3 차원 구조화 조명 현미경 (3D-SIM)이이 장애물을 극복 하 고 새 균의 subtilis (B. subtilis) 포자의 발 아 과정의 분자 세부 정보를 공개 하는 유망한 도구입니다. 여기, 우리는 수정 된 SIMcheck (ImageJ)를 사용 하 여 설명-보조 3D 이미징 프로세스 및 형광 기자 단백질 B. subtilis 포자 germinosomes, 발 아 단백질의 클러스터의 시뮬레이션입니다. 우리는 또한 FM4-64 B. subtilis 포자 막의 얼룩에 대 한 (표준) 3D 시뮬레이션 이미징 절차를 제시. 이 절차를 사용 하 여 우리는 germinosome 지역화에 대 한 탁월한 해상도 얻을 하 고 표시 > B. subtilis KGB80 정의 된 최소 MOPS 매체에 포자 형성 후 얻은 휴면 포자의 80%는 하나 또는 두 개의 식도 GFP와 GerKB-mCherry 포커스입니다. 밝은 foci에서 관찰된 FM4-64 스테인드 포자 3D 시뮬레이션 이미지 내부 막 지질 도메인 가능성이 다른 유동성의 존재를 제안 했다. 공동 지역화를 평가 하 고 따라서 내부 포자 막에서 균 발 아 단백질의 조직에 대 한 최적의 개요를 얻을을 더블 라벨 막 염료와 germinosome 프로시저 기자 단백질을 사용 하는 연구는 더 가능.
Bacillales 및 Clostridiales의 포자 metabolically 휴면 하 고 가혹한 오염 정권에 매우 저항력이 있지만 그들은 발 아 하지 않는 인간1해로운 효과 일으킬 수 없습니다. 새 균의 subtilis (B. subtilis) 포자의 영양소 germinant 트리거 발 아, 개시 이벤트는 germinant 수용 체 (GRs) 포자의 내부 막 (IM)에 위치한 germinant 바인딩입니다. 그 후,는 GRs transduce 메신저에 있는 또한 SpoVA 채널 단백질에 신호. 이 포자 코어 피리 딘-2, 6-dicarboxylic 산 (dipicolinic 산; 교류의 결과 DPA; 포자 코어 건조 중량의 20% 함유) SpoVA 채널을 통해 물에 대 한. 그 후, DPA 릴리스 트리거 피 peptidoglycan 가수분해의 활성화 고 추가 물 통풍 관2,,34. 이러한 이벤트 코트 레이어, 그것의 연속적인 파열, 파생물의 발병에 기계적 스트레스를 리드 하 고, 마지막으로, 식물 성장. 그러나, 발 아 과정의 정확한 분자 세부 정보는 여전히 멀리에서 해결 되었습니다.
포자 발 아에 대 한 주요 질문 임 발 아 단백질 IM SpoVA 채널 단백질 주변의 지질 생물 속성을 염려 한다. 이 크게 움직이지 IM 지질 bilayer 일부는 포자 코어 또는 식물 세포 세포질5,6에 그들의 활동을 발휘 하는 독성 화학 방부 제, 포함 하는 많은 작은 분자에 대 한 주요 침투성 방 벽 이다. 메신저5모바일 지질의 중요 한 일부분 이지만 메신저 지질 bilayer 젤 상태에서 가능성이 높습니다. 포자의 메신저는 또한 중요 한 확장5에 대 한 잠재력이 있다. 따라서, 메신저의 표면적 증가 하면 추가 막 합성 없이 발 아 시이 막의 특성 낮은 침투성 및 지질 부동5,6의 손실에 의해 동반입니다.
B. subtilis 포자의 작은 크기와 발 아 단백질의 상대적으로 낮은 풍부한 도전을 제기 발 아 단백질의 활성화 및 포자에 IM 지질 조직 분자 세부 연구를 위한 매력적인 주제는, 에 현미경 분석입니다. 그리피스 그 외 여러분 epifluorescence 현미경 증거 돋보이는, B. subtilis 포자에 비 계 단백질 식도 3 GR 소 단위 (A, B 및 C) 게 라, B 및 K GRs 구성 제안 형광 기자 발 아 단백질, 융합을 사용 하 여 클러스터7에서. 그들은 발 아 단백질의이 클러스터에 대 한 ‘germinosome’ 라는 용어를 만들어낸 고 ~ 300 nm 큰 메신저 단백질 foci8구조 설명. 포자 발 아의 시작, 시와 형광 패턴, 분산 foci 궁극적으로 변화에 더 큰 형광 germinosome > 포자에이 패턴을 표시 하는 포자 인구의 75% L valine81 h에 대 한 출 아 했다. Note 사용 위에서 언급 한 종이 이미지 사진의 연속 형광, 통계 전원 낮은 형광 신호 이미징 동안 관찰의 장애물을 극복 하기를 수십에서 평균. 세균성 포자에 이러한 구조의이 시각화 했다 이란 기술적으로 가능한 클래식 미세한 도구와 단일 포자에서 foci의 금액의 두 평가의 가장자리에도 그들의 더 상세한 subcellular 지 방화 했다 이 방법으로 가능 합니다.
여기, 우리 상세한 시각화를 구조화 조명 현미경 (SIM)의 사용 및 B. subtilis, 뿐만 아니라 그들의 IM 지질 도메인9의 포자에서 germinosome(s)의 정량화를 보여 줍니다. 프로토콜은 또한 ImageJ10,,1112뿐만 아니라 포자 형성, 슬라이드 준비와 SIMcheck (v1.0, imageJ 플러그인) 이미지 분석에 대 한 지침을 포함합니다.
제시 하는 프로토콜 FM4-64 스테인드 B. subtilis 포자 포자 형성, 슬라이드 준비와 이미징 프로세스의 분석을 위한 표준 3D-SIM 절차를 포함 합니다. 또한, 프로토콜 설명 수정된 SIMcheck (ImageJ)-3D 이미징 B. subtilis 포자 germinosomes 형광 기자 표시의 SIM 현미경 검사 법에 대 한 프로세스를 지원. 후자의 절차를 사용 하 여 향상 된 콘트라스트와 함께 희미 한이 구조를 관찰할 수 있었습니다. 두 가…
The authors have nothing to disclose.
저자는 SIM 이미징 동안 그의 도움에 대 한 크리스 쳔 Zeelenberg 감사합니다. JW 박사 화목을 위한 중국 장학금 위원회를 인정 하 고 아이 린 Stellingwerf 이미징의 기본 단계 그녀의 도움에 대 한 감사 합니다.
Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
Image J | |||
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
Nikon Eclipse Ti microscope | |||
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |