Summary
משמש לכמת את תבנית. הנשימה בעכברים ערים אנו מראים כי מקטעים של 15 מתחת לפרוטוקול מתוקננת מציגים ערכים דומים למשך זמן ממושך של נשימה שקטה. מתודולוגיה זו מאפשרת גם הכמת של דום נשימה ונשימות מוגבר במהלך השעה הראשונה בחדר.
Abstract
(UBP) הוא שיטה לכמת את תבנית הנשימה בעכברים, היכן שתדר הנשימה, נפח הגאות והאוורור של הדקה מדווחים באופן שגרתי. כמו-כן, ניתן לאסוף מידע לגבי התפוקה העצבית של הנשימה, כולל קיומה של מרכז apneas ונשימה מורחבת. שיקול חשוב של UBP הוא להשיג קטע נשימה עם השפעה מינימלית של התנהגויות להוט או פעיל, כדי להבהיר את התגובה לאתגרים נשימה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר בסיסיות קצרות, שקטות להתקבל בעכברים מיושנים, הדומה להמתנה לתקופות ארוכות יותר של נשימה שקטה. השימוש במקטעי זמן קצרים יותר הוא יקר ערך, כמו כמה זנים של עכברים עשויים להיות יותר ויותר מתרגש או חרד, ותקופות ארוכות יותר של נשימה שקטה לא ניתן להשיג בתוך פרק זמן סביר. הונחו 22 חודשים בן עכברים בחדר UBP והשוו 4 15 s שקטים נשימה מקטעים בין דקות 60 – 120 למשך זמן ארוך יותר 10 דקות נשימה שקטה כי לקח 2 – 3 h כדי לרכוש. כמו כן הצלחנו להשיג ספירות מרכזיות של apneas ונשימות מרושמות לפני מקטעי הנשימה השקטים, לאחר תקופת ההכרות של 30 דקות. אנו מראים כי 10 דקות של נשימה שקטה דומה לשימוש קצר הרבה יותר 15 s משך. בנוסף, את הזמן המוביל של אלה 15 שקטים מגזרי נשימה ניתן להשתמש כדי לאסוף נתונים לגבי apneas של המקור המרכזי. פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לאסוף נתונים של תבנית של נשימה בפרק זמן מוגדר ועושה אמצעים שקטים בסיסיים ריאלי עבור עכברים שעשויים להפגין כמויות מוגברת של התנהגות להתרגש. מתודולוגיית UBP עצמה מספקת דרך שימושית ולא פולשנית לאסוף נתונים של דפוס-of-נשימה ומאפשר לעכברים להיבדק על מספר נקודות זמן.
Introduction
Ubp היא טכניקה נפוצה להערכת דפוסי נשימה1,2,3,4. בשיטה זו, עכברים ממוקמים בתא סגור שבו הבדלים בלחץ בין החדר הראשי (שבו החיה שוכנת) וחדר התייחסות מסוננים באמצעות הינע פנאומטי כדי להשיג ערכים. ההתקנה של UBP וכתוצאה מכך הוא פולשני ולא מרסן ומאפשר אמצעים הנשימה להיות מוערך ללא דרישה של הרדמה או ניתוח. בנוסף, טכניקה זו מתאימה למחקרים המצריכים מדידות מרובות באותו עכבר לאורך זמן. משתנים כגון תדר נשימה, נפח גאות, ואוורור דקה ניתן לכמת עם שיטה זו, במהלך ניסוי אחד או על פני מספר מבחנים. הגוף השלם UBP גם מספק מדדים של זרמי השיא משך מחזור הנשימה. ביחד, הפרמטרים הללו. מכמת את תבנית הנשימה סימני הנשימה המוקלט גם מאפשרים לסקור את הנתונים ולספור את מספר האפניאס המרכזי המוצג בפרק זמן נתון. ניתן להשתמש בספירה זו לצד ניתוח של עוצמת הגאות והinspiratory פעמים כדי לאמוד שינויים אחרים בתבנית הנשימה.
בעוד כמה טכניקות plethysmography לא פולשני קיימים עבור הערכה ישירה של פרמטרים פיזיולוגיים ריאתי, הגוף השלם UBP מאפשר דרך המסך עבור פונקציית הנשימה עם מתח מינימלי מזערי לעכבר. הראש החוצה החוצה, אשר משתמשת באמצעים זרימת הגזים הגאות והוא גם לא פולשני, מסתמך על איפוק, כמו סוגים רבים אחרים של הפלתיגרפיה (למשל, השני הקאמרית בחדר). בעוד שיטות אלה נעשה שימוש במודלים מכרסמים למדוד תגובתיות דרכי הנשימה5, השימוש קולרים צוואר או שפופרות ריסון קטן עלול לקחת עכברים (לעומת מינים אחרים) יותר כדי התאקלם ולהחזיר את הנשימה שלהם כדי לנוח רמות.
השגת קטע אוויר אופטימלי הוא שיקול חשוב עבור השוואות בסיסיות. השימוש המוגבר במערכות הפלתיגרפיה הפנויות מסחרית מאפשר איסוף נתונים של תבנית הנשימה האפשרית במעבדות רבות. וחשוב מכך, דפוס הנשימה משתנה לאורך כל תקופת האיסוף, במיוחד לעכברים. עם זאת, יש צורך לתקנן את הניתוח הבסיסי כאמצעי להבטיח שרמת האימון של הניסויים לא מרמה תוצאות. ישנן דרכים רבות לאיסוף מקטע נושם אוויר, המשמש כתחום אחד של וריאציה בין עיצובים ניסיוניים. דוגמה אחת כוללת חישוב ממוצע של 10 – 30 דקות של נתונים לאחר מערכת זמן שהוגדרה בעבר בתוך חדר1, בעוד ששיטה אחרת כרוכה בהמתנה עד שהעכבר יהיה רגוע בעליל עבור 5 – 10 מינימום6. האחרון יכול לקחת 2 – 3 h כדי להשיג במקרים מסוימים, המשפט עשוי להיות צריך להיות נטוש אם העכבר אינו רגוע מספיק זמן. חשש זה הוא שיקול חשוב במיוחד עבור זנים של עכברים שבהם התנהגויות נצפו הם להוטים יותר ולהתרגש7. עכברים אלה עלולים להימשך זמן רב יותר כדי להסתגל לסביבה הקאמרית ולהישאר רגועים רק להתפרצויות קצרות של זמן. מגביל את הזמן המוקדש האוסף הבסיסי מתקן את הזמן החדר עבור כל עכבר.
זה חיוני כי ניסויים לקבל בסיס מתאים המקיף ערכי התנהגות מנוחה בעכבר, אך גם מתרחשת בזמן. מכאן, המטרה של דו ח זה היא לספק תיאור של שיטות המשמשות להשגת ערכים בסיסיים שקטים קצרים עבור פרמטרים נשימה בעכברים. כמו-כן, אנו מדווחים כי האפנאס והנשימות הרבודה ניתן לכמת בשעה הראשונה בחדר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים במכללת לה ממוין. כל שימוש בבעלי חיים היה בהסכמה עם המדיניות המתוארת במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה8.
הערה: (קריטי) לפני ניסויים, השג את כל האישורים וההדרכה הדרושים לשימוש בעלי חיים. חשוב שהנסחנים מוכרים עם התנהגויות העכבר ורמות הפעילות, כולל סימנים של שינה, מצוקה ו/או חפץ התנועה לעומת הריח והנשימה הרגילים.
1. לשכת החלל הפלמטריים השלמה
- קראו את מדריכי המשתמשים המתאימים לחדר הסטנדרט הברומטרי, כולל מחברים, טבעות O, וכו ', וצרו קובץ פרוטוקול סטנדרטי להגדרת אנלייזרים (לדוגמה, חילוף חומרים) ופרמטרים ספציפיים לתוכנה.
- ודא שכל הזרנוקים והצינורות מחוברים לחדר. חברו צינור גז (זרימה פנימה) ושפופרת ואקום (זרימה-out) ישירות לחדר החריץ הברומטרי.
הערה: יש לצרף את הזרימה הנכנס לפתח המסומן בזרם הטיה. - הצמד CO2, O2, ו N2 מיכלי גז למיקסר גז. ודא שכל מיכלי הגז נמצאים במצב פתוח לפני הניסויים.
2. כיול החדר הפלמטריים הברומטרי
- כיילו את זרימת הגז הגבוהה והנמוכה על-ידי בחירה בתוכנית ההתקנה של 7700-מגבר , תחת הכרטיסייה חומרה של תוכנת הרנטגן הברומטריים.
- הגדר ואקום (זרימה מתוך התא) המתאים לעיצוב ניסיוני ומנתחי גז (~ 0.1 L/min).
הערה: קצב הזרימה חייב להישאר זהה לאורך כל הכיול ולהתנסות בהקלטות מטבולית מדויקות. - הגדר זרימת אוויר נמוכה על-ידי הסרת צינור הזרימה מהתא וכיבוי הוואקום.
- הקלט את זרימת האפס על-ידי הזנת 0 לתא היחידה הנמוכה עבור התא המתאים. לחץ פעמיים על התא Cal הנמוך , שנה את השעה ל-3 s והיכה מדידה.
- חברו את צינור הזרימה ואפשר גז (20.93% O2, מאוזנת N2) כדי לזרום דרך החדר החריץ הברומטרי ממערבל הגז.
- המר את הזרימה הנכנסת מפני ליטר/דקות לתוך מילימטר/שניה. לחץ על תא היחידה הגבוהה עבור התא המתאים והזן את הערך במילי-ליטר/שניה. לחץ פעמיים על Cal גבוהה, שנה את השעה עד 3 s ולחץ על מדידה.
- השאר את כרטיסיית ההתקנה של 7700-מגבר פתוחה כדי לכייל את מנתחי החילוף המטוליים לתוכנת הפלתיגרפיה הברומטריים.
3. כיול מנתח מטבולית
- בתוכנית מערבל הגז, להגדיר את מערבל הגז כדי לשחרר את זרימת הגז המכיל 20.93% O2 ו 79.07% N2.
- על מאבחנים חילוף החומרים, להגדיר את רמת כיול O2 כדי 20.93% ו-CO2 לקרוא 0%. הפעל את החיוג חזרה למדגם לאחר הזנת הערכים המתאימים.
- הגדר את האחוז הגבוה או2 . לחץ על הכרטיסייה Abcd-4 של תוכנת הרנטגן הברומטריים ולאחר מכן הזן 20.93 תחת היחידה הגבוהה של קו c2. תחת Cal גבוה, לשנות את הזמן כדי 3 s ולהכות מדידה.
- הגדר את האחוז הנמוך של CO2 . הזן 0 תחת cal נמוך של הקו C3 ולאחר מכן שנה את השעה ל-3 ולחץ על מדידה תחת Cal נמוך.
- בתוכנית מערבל הגז, לשנות את הערך O2 ל 10% ואת ערך CO2 ל 5%. המתן מספר דקות עד שזרימת הגז תתאים לערכים אלה. על מאבחנים חילוף החומרים, להפוך את ידיות הכוונון כדי לכייל CO2 שווה ל 5%. הקפד להפוך את החיוג חזרה לדגימה לאחר שהערכים מכוילים.
- הגדר את האחוז הגבוה של CO2 . ודא שקריאות המנתח יציבות לפני הכנסת הערכים המתאימים לתוך O2 ו-CO2 על התוכנה הפלנוגרפיה ברומטריים. לחץ על יחידה גבוהה תחת C3 והזן 5. לשנות את ה- Cal הגבוה ל -3 ולהכות מדידה.
- הגדר את האחוז הנמוך O2 . לחץ על יחידה נמוכה תחת האפשרות C2 והזן 10. לחץ על Cal נמוכה, קלט 3 s ולחץ על מדידה.
- לשנות את ערכי הגז על מערבל הגז חזרה 20.93% O2 ו 79.07% N2. המתן מספר דקות עד שהתא יתאים לערכים אלה. חזור על השלבים 3.1 \ u 20123.7 אם מנתחי חילוף החומרים לא לקרוא באופן אוטומטי 20.93% O2 ו -0% CO2, כדי להבטיח כיול ראוי. מאשרים באופן שגרתי כיול. מתאים עם מיכלי גז מוסמכים
- בדיקה חוזרת של מוני הזרימה. המחוברים לחדר הפלתיגרפיה הברומטרי כוונן את זרימת האוויר לתוך ומחוץ לחדר לתעריפים המתאימים לניסוי (בדרך כלל, 0.1 – 0.3 L/דקות).
- לאחר שהחלת כל ההגדרות על התוכנה הרונוגרפיה ברומטריים, לחץ על אישור כדי להתחיל בהקלטה.
4. הפלתיגרפיה ברומטריים
- הקלט את משקל העכבר וטמפרטורת הגוף הראשונית. לחכות 10 דקות לפני הצבת העכבר בחדר, כדי לאסוף O2 ו-CO2 נתונים מתא ריק. עבוד באזור שקט המוכר לעכברים כך שרעש וריחות לא יפריעו לאיסוף הנתונים. הימנע מהפרעות אפשריות, כולל הפתיחה והסגירה של דלתות או אנשי צוות העוברים פנימה/החוצה מחדר איסוף הנתונים.
הערה: פרוטוקול ספציפי זה המועסקים 22 C57BL בן זכר/בעכבר 6J. - במהלך השעה הראשונה, תעד את התנהגויות העכבר ורשום הערות מפורטות, כולל ערכים ספציפיים של הזרימה מהתא.
- לאחר 60 דקות של הרגלה קאמרית, לצפות קטעים של נשימה שקטה עבור הבאים 60 min. List כל מקטעים שנמשכים לפחות 15 s באורך מבלי לרחרח ולטפח. קחו את טמפרטורת הגוף כל 10 דקות כאשר משתמשים במכשיר להשתלות.
- בסוף הניסוי, להסיר את העכבר מן התא ולמקם אותו חזרה בכלוב שלו. יש לנקות את כל הציוד ולהימחק ביסודיות. אם נותרו טיפות מים, השתמשו באוויר לחצים כדי להסירם.
5. ניתוח תבנית הנשימה וחילוף החומרים
- והתייעץ עם ההערות המוקלטות. של בעל החיים המעניין
- פתח את לוח מטבולית בתוכנה ולקחת את הממוצע של 10 הדקות הראשונות של O2 ו-CO2, כאשר החדר היה ריק. הקלט ערכים אלה כ-FiO2 ו-fico2.
- לצפיה בלוח הזרימה של תוכנת הפלתיגרפיה הברומטריים. לחץ לחיצה ימנית על ' ניתוח תכונות ' והגדר פרמטרים מתאימים. תחת הכרטיסייה Meta 1 , הזן את fio2 ו-fico2 משלב 5.2, כמו גם את הזרימה לתוך התא תחת Meta 2, כדי לחשב VO2 ו-vco2.
- לדפוס של ניתוח נשימות, לאשר את הזמנים עבור 15 שניות של נשימה שקטה באמצעות הערות על התנהגות בעלי חיים, כמו גם את מעקב לוח הזרימה. הזן את המועדים עבור מרווחי ה-15 של הנשימה השקטה תחת דו-שיח מנתח נתונים פתוח מהכרטיסיה מנתח נתונים . לחץ על מצב תצוגת מנתח כדי להציג רק את מקטעי הריבית הספציפיים של 15.
- לחץ על שמור נתונים נגזרים שנותחה. פתח את קובץ הנתונים בגיליון אלקטרוני כדי לקבל את נתוני ה-נופה.
6. ניתוח אפיאס ונשימות רבודה
- בקובץ הסקירה הפתוחה, צא מ'מצב תצוגה של מנתח'. עבור אל האפשרות הגדרת גרף תחת ההתקנה > P3 ההתקנה ובחר תצוגת עמוד תחת סוג. בחר 5 עבור מספר החלוניות. הזן -2 לתוך התיבה המסומנת כ- Low ו- 2 לתוך התיבה המסומנת כגבוהה עבור אמצעי זרימה במילי-ליטר/שנייה. החל את השינויים.
- גלול לסימן 30 דקות בלוח הבקרה של הזרימה.
- הרוזן apneas ואת מגבירה נשימות עבור 30-60 דקות לאחר העכבר הוצב בחדר. תקופות מכמת של נשימה מושהה נמשך זמן רב יותר או שווה ל 0.5 s, מעיד על דום נשימה. נשימות רבודה מסומנות על ידי עלייה חדה בעקבות נשימה מעל 1.25 mL/s ואחריו ירידה חדה מתחת-0.75 mL/s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות של UBP כהערכה של דפוס של נשימה בגיל 16 (בן 22 חודשים) עכברים שבוצעו תחת גז האוויר הרגיל (20.93% O2 עם מאוזנת N2) מדווחים. הניתוח כלל השוואה של מקטע נשימה ארוך יותר של 10 דקות (שלקח למעלה מ -2 שעות להשיג) לעומת הממוצע של ארבעה מגזרים קצרים של 15 דקות (כימות בתוך מספר שניות 60 – 120). מעקב אחר זרימה מייצגת של נשימה שקטה, כאשר הנשימה מתאימה ללא התנהגויות נשימה פעילות, מסופקת באיור 1א. כאשר אוספים דומים נאספים מבעלי חיים, 100% מהנשימות צריכים להתקבל על ידי התוכנה. עם זאת, איור 1ב מייצג את הנשימה מקטע פעיל יותר, בו העכברים חוקרים את החדר, מרחרח, ו/או מטפח. הוראות דומות לאלה המוצגות באיור 1ב' סבירות פחות שיתקבלו על-ידי התוכנה ואינן אידיאליות עבור סוג אוסף הנשימות המשמש והמוסברים על-ידי מתודולוגיה זו. הפרמטרים שנבחרו להערכת הבדלים אפשריים של תבנית הנשימה בין שתי נקודות הזמן היו שכיחות הנשימה (איור 2א), נפח הגאות (VT, איור 2ב), דקות אוורור (VE, איור 2ג), הגאות נפח/יחס הזמן inspiratory (VT/Ti, איור 2ד), ודקה אוורור/שגורשו יחס פחמן דו חמצני (VE/vco2/g, איור 2E), שהיו כל מחושבים באמצעות תוכנת הפלתיגרפיה ברומטריים ו fenn משוואה. ערכים שדווחו עבור מדדים אלה נמצאים בטווח של מה שדווחו בעבר על מודל העכבר6,9. בין הקבוצות לא הובהר הבדלים משמעותיים. תיקוני אד הוק עבור השוואות מרובות של תדר נשימה ו-VT נתונים נספרו עם Bonferroni (p < 0.025 נחשב משמעותי). תוצאות אלה מראות שהשימוש בפרוטוקול מפושט באמצעות בסיסי בסיס של 15 מספק תוצאות דומות לזו של פרוטוקול בסיסי ארוך יותר.
ניתוח נוסף בוצע עם כל אחד 4 15 s מקטעי בסיס עבור תדירות, VT, VE, VT/Ti, ו-VE/VCO2/g (איור 3). אין הבדלים משמעותיים (p > 0.05) בין כל אחת מנקודות הזמן שנמצאו. כמו כן, לא היו הבדלים בין כל אחד מארבעת מקטעי הזמן עבור כל מדידה של דפוס נשימה. בנוסף, בדקנו את השונות של הקטע של קבוצת 15 s לעומת הקבוצה 10 דקות ולא מצאו הבדלים משמעותיים באמצעות הבדיקה של לוינסון בעת השוואת נתוני הקבוצה הממוצע.
מספר הנשימות והנשימה הרבודה שנצפו עבור כל חיה במהלך הדקות 30 – 60 של פרוטוקול UBP מוצגים באיור 4. תוצאות אלה מראות כי בעלי חיים בגילאי להציג מספר גבוה של apneas ואת הנוכחות של נשימות מוגבר בטווח 30 דקות (מעקב המוצג באיור 1ג). הנתונים מצביעים על שינויים במהלך תהליך ההזדקנות, כפי שהממצאים הללו נצפו בעכברים בני 22 חודשים. כדי לאשר אמינות משולבת לדום נשימה וניתוחי נשימה מוגבר, מתאם פירסון היה מחושב עבור שני חוקרים שונים. מידה גבוהה של הסכם בין הרסרס נמצאה, כפי שמצוין בערך r =. 99 עבור apneas ו- r =. 86 לנשימות מוגבר. במחקרים עתידיים, מספר גדל של apneas לעומת קבוצת שליטה יהיה לספר על תפקוד לקוי של נשימה הנובעת מרכיב עצבי.
איור 1:מעקבאחר זרימה ייצוגית. (א) הזרמת זרימה מתוכנית בסיסית שקטה, כאשר העכבר אינו מציג התנהגויות פעילות כגון רחרוח או טיפוח. (ב) זרימת מעקב מתקופת נשימה פעילה שאינה כלולה בניתוח שלנו, כאשר עכברים נעים על החדר ונשימות רבות אינן מתקבלות באופן שגרתי. (C) מעקב אחר זרימה המציגה נשימה מורחבת ואחריו תקופה של דום נשימה. חלון של 5 מוצג עבור כל העקבות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הפרמטרים לנשימה דומים לקטעי נשימה רגועה של 10 דקות ו -15 בעכברים בני 22 חודשים. שימש לאיסוף מידע נושם בעכברים מבוגרים (n = 16, 22 חודשים). נתוני נשימה חושבו עבור עכברים במהלך שתי נקודות זמן שונות, כלומר הממוצע של 4 15 s מרווחי השקט בתוך 60-120 דקות סימן של העכבר להיות בחדר ו עבור 10 דקות של נשימה רגועה עקבית. (א) תדירות נשימה (נשימות/דקה). (ב) נפח הגאות (VT; מילי ליטר/נשימה). (ג) דקות אוורור (VE; מיליליטר/דקה). (ד) היחס בין נפח הגאות לזמן ההשראה (VT/Ti; מילי ליטר/שנייה). (ה) יחס של אוורור דקה כדי לגורש פחמן דו חמצני, מנורמל למשקל (VE/vco2/g). אין הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית בין הקבוצות לאחר תיקוני post (p > 0.025). ערכים של > 3 SD מעל הממוצע נחשבו החוצה והוסרו מערכת הנתונים. נתונים מוצגים כממוצע ± SD. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השוואה בין מרווחי 4 15 s. נתוני נשימה חושבו בעכברים לנשימה רגועה (n = 16, 22 חודשים) עבור ארבעה מרווחי 15 s נפרדים בתוך 60 – 120 מינימום של הצבה קאמרית. (א) תדירות נשימה (נשימות/דקה). (ב) נפח הגאות (VT; מילי ליטר/נשימה). (ג) דקות אוורור (VE; מיליליטר/דקה). (ד) היחס בין נפח הגאות לזמן ההשראה (VT/Ti; מילי ליטר/שנייה). (ה) יחס של אוורור דקה כדי לגורש פחמן דו חמצני, מנורמל למשקל (VE/vco2/g). אין הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית בין מקטעי הזמן (p > 0.05). מיירס מוגדרים כ> 3 SD מעל הממוצע והוסרו. נתונים מוצגים כממוצע ± SD. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: דום נשימה וספירות נשימה רבודה בעכברים. Apneas (≥ 0.5 s ללא נשימה) ונשימות מוגבר (ABs; עלייה חדה באינהלציה מעל 1.25 mL/s ואחריו נשיפה חדה מתחת-0.75 mL/s) נספרו עכברים ישנים (n = 16, 22 חודשים בן) בין 30 – 60 דקות. הספירות נותחו למעלה מ-30 דקות והסכום הכולל עבור פרק זמן זה מדווח. נתונים מוצגים כממוצע ± SD. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: סכמטית של ההתקנה הברומטריים ברומטרי (ubp). ההתקנה הכוללת של UBP צריכה להיות דומה לזו המתוארת באיור. יש למדוד את מדידות הזרימה עבור הגזים הנכנסים ועוזבים את החדר, והרכב הגז חייב להיות ידוע בפענוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הפרוטוקול מספק מידע לגבי בסיס נשימה שקט בעכברים, כמו גם איסוף נתונים על מרכזי apneas ונשימות מוגבר. תוצאות הנציג מראים כי 10 דקות הבסיסית שקט יש דפוס דומה של נשימה בהשוואה לממוצע של 4 15 s התקפי עבור קבוצה של עכברים ישנים. וחשוב מכך, התקפי ה-15 אינם שונים מבחינה סטטיסטית, וגם לקבוצות אלה אין הבדלים בין השינויים השונים באמצעות המבחן של לוונאי. נתונים אלה מדגימים כי אפילו התקף קצר אחד מספיק לניטור נשימה שקטה. עם זאת, זה אפשרי לחלוטין כי ניתוח וריאציה בודדת בתוך עכבר ב 15 s לעומת 10 דקות עלול לגרום ממצאים שונים, כמו 10 דקות הקרב יכול להקיף מינימלי לרחרח פעילויות הטיפוח. עם זאת, השימוש במבחן של לוינסון להשוואת מקטעי הבסיס האישיים של העכבר מספק ניתוח שונה מזו המתוארת בפרוטוקול זה. באופן כללי, העיצוב של מתודולוגיה זו משתמש במקטעי נשימה של 15 שניתן לרכוש במהלך הדקות 60 – 120 בחדר, לעומת הצורך להמתין לכל עכבר כדי להשיג משכים ארוכים יותר של קו בסיס שקט.
משך הזמן הקצר הנדרש עבור הבסיס מאפשר זנים להוטים/נסער יותר של עכברים להיבדק לנשימה שקטה. השימוש במקטע נשימה ארוך יותר (כלומר, 10 או 2 דקות) מאריך את משך הפרוטוקול, עד לנקודה שבה ייתכן שיהיה צורך לנטוש את העכבר אם העכברים אינם מציגים סימן נשימה שקט בתוך 3 שעות. מאז עיצובים ניסיוניים רבים גם לשלב אתגרי הנשימה (כלומר, היפוקסיה), הזמן המורחבת המוקצב לגזים אחרים מדגיש את הצורך זמן איסוף בסיסית להיות סטנדרטית. השימוש של אחד 15 s התחרות של נשימה שקטה מסייעת להקל על הדאגה של העבודה עם עכברים (וזנים של עכברים) כי יכול להיות להתרגש במיוחד בתא. בזמן העבודה עם הפלטוגרפיה ברומטריים, מצאנו כי ~ 10% של עכברים למחקר צריך להיות נשלל בגלל חוסר היכולת שלהם לבצע קצת כמו 2 דקות של נשימה שקטה רציפה בתוך החדר. היישום של משפטי ההיכרות הקודמת נכשל בקבלת עכברים כדי להירגע מהר יותר כאשר מניחים בחדר ביום של ניסויים. עם זאת, מכיוון זנים שונים, המינים, וגילאים של עכברים עלולים להגיב באופן שונה לסביבה הקאמרית10,11, ייתכן כי טכניקות הרגלה יכול להיות מועיל12,13 עבור כנופיית מסוימים. משפטי ההיכרות שלנו כללו את הצבת העכברים בחדר UBP שבחדר הבדיקות של 1 – 2 h במשך מספר ימים לפני ניסויים. בעוד לא הבחנו שינויים בהתנהגות בעלי חיים בעקבות הליך זה, המחקר הקודם הראה כי 24 h של הרגלה היה צורך לחסל את ההשפעות החדשנות וכתוצאה מכך פעילות גופנית ספונטנית בעכברים12. בנוסף, כביר ואח ' נמצא כי הצבת צילינדרים פלסטיק דומה בגודל לחדר החריץ הברומטרי בכלוב בבית היה יתרון בקבלת חולדות להכיר את הגדרות לפני ניסויים13.
פרוטוקול זה גם חושף בעיות הנשימה אפשרי בעכברים באמצעות כימות של apneas המרכזי, מעיד על בעיות בקרת עצבים. שלושים דקות של התבוננות לפני הקולקציה הבסיסית של נשימה הראה כי כל 16 העכברים הישנים הציגו מספר גבוה של פרקים apneic ונשימות מוגבר (מיוצג באיור 1ג). Apneas רבים בקבוצה זו בגיל העכבר להדגיש את היכולת של פרוטוקול זה כדי לכמת את האמצעי נשימה אחרת מבלי להוסיף זמן נוסף לניסויים. יש לציין כי התקדמות גיל ומחלות (אם רלוונטי) יכול להשפיע על נוכחות ומספר של פרקים apneic.
על מנת לאפיין את הנשימה השקטה, חשוב להתבונן ללא הרף בחדר ובעכבר הינם ברומטריים לאורך כל תקופת הפרוטוקול. עבור כימות הנשימה השקטה, על העכברים להיות ערים אך לא להשתתף בהתנהגויות פעילות כגון רחרוח, טיפוח או סיור (מיוצגים באיור 1א). מאז דפוסי הנשימה במהלך השינה יכולים להיות שונים מאלה בחיה ערה14,15, אוסף של נשימה רגועה במהלך המדינה ער הוא קריטי. ייתכן כי מקטעים ארוכים יותר של נשימה שקטה יכולים לכלול תקופות של שינה, אשר עשוי לא להיות רצוי בהתאם לעיצוב ניסיוני. במקרה זה, מקטעים קצרים יותר של נשימה שקטה יהיה אידיאלי למסמך, כמו הסבירות של איסוף נתונים במהלך השינה מופחת כאשר מגזרים פעילים לאגף קצר (15 s) מקטעי נשימה שקטים. הבחנו כי מקטעים ארוכים יותר של נשימה שקטה יכול להיות מאתגר לרכוש במודל העכבר, כמו התנהגות העכבר בחדר נראה שונה מאוד לעומת זה של חולדות. חשוב גם להתבונן באופן אנוש בזרימת הנשימה של העכבר למקטעי נשימה מתאימים ולתעד התנהגות בעלי חיים. במקרים של אוורור מופחת או נשימה לא יציבה, שיטה זו עדיין יכולה להיות מנוצל. במקרים אלה, הכרחי שהניסויים מעוור את הקבוצה בעת בחירת מקטעי ה -15. תוכנית התוכנה צריכה להבחין בין הנשימות, עם שיעור הקבלה של 100% במהלך התקופה ה -15. אנו מייעצים לשים לב לעקבות הנשימה בנוסף כדי להבטיח כי בעלי החיים עומדים בקריטריונים התנהגותיים עבור הבסיסית, שכן ייתכן כי עכברים נייחים עדיין לחרדה. מחקר קודם דיווח כי למרות חולדות הציגו התנהגות רגועה, הם עדיין הראו דפוסי נשימה שונה (כלומר, מוגברת תדירות) בתגובה גירויים מבוקרת בחדר הבדיקה13.
מדדים של תדר, VT, VE, inspiratory והזמן הצפוי, ו-VE/VCO2 כולם כימות באמצעות אנלייזרים ותוכנות ubp ומדווחים לעתים קרובות בספרות. במיוחד, VT ו-VE חישובים להשתמש משוואת Drorbaugh ו Fenn16, אשר דורש ערכים ידועים עבור טמפרטורת הגוף, טמפרטורת החדר הסביבתי, לחות, ולחץ ברומטרי. מומלץ לאסוף צעדים אלה לאורך הניסוי עבור ערכי VT ו-VE מדויקים ביותר. יש להשתמש במשתנים אחרים המחושבים על-ידי המערכת בזהירות. UBP הוא לא מדד ישיר של מכניקת הריאות; כך, משתנים הקשורים עמידות דרכי הנשימה (למשל, הפוגה משופרת [פן]) יש לפרש עם אזהרה זו בראש5. רכיבים נוספים של הגדרת UBP שיכולים להשפיע על משתנים המחושבים על-ידי התוכנה כוללים קצבי זרימה וכיול כללי של המערכת. אישור חותמות ואטמים עובדים כראוי (אין דליפות) ולהבטיח חיבור נאות של כל הציוד לחדר הפלתיגרפיה הברומטריים (איור 5). יש לשמור על עקביות בקצבי הזרימה והיציאה מהחדר. תעריפי הזרימה הנדרשים יכולים להיות שונים בין הגדרות UBP, לכן חשוב לבדוק ערכים אלה לפני ניסויים. שיעור הזרימה בחדר צריך להספיק כדי לספק אתגרים של אוויר צח או גז בזמן מסוים. קצב הזרימה צריך גם להיות מספיק עבור מאבחנים מטבולית למדוד O2 ו-co2 מבלי co2 לבנות בתוך הסביבה קאמרית, אשר מהווה את הסיכון של דפוס משתנה של נשימה. באופן דומה, מערבל גז/מנתח כיול צריך להיות מיושם באופן סדיר כדי להבטיח כי הפרמטרים מטבולית נמדד במדויק.
שיקולים אחרים עבור UBP מודע כוללים הפחתת הסחות דעת בתוך החדר ניסיוני בעוד בעלי חיים נבדקים. רעשים חזקים, ריחות שונים, ונוכחות של אנשים לא חיוניים בחדר יכולים להוסיף להתנהגויות מחרדות שהוצגו על ידי עכברים. השימוש בחדרים קטנים יותר כאזורי בדיקה עשוי לעזור, אך אם אין זה אפשרי, קירות קרטון (עם חלון צפייה קטן) יכולים להיות מוגדרים מסביב לחדר כדי להפחית הסחות דעת עבור העכברים. יש לשמור על פעילות חשמלית בתוך החדר למינימום כדי למנוע רעש נוסף בתוך העקבות הברומטריים. לכן, חשוב לרשום את מעקב הזרימה במהלך 10 דקות כאשר התוכנה אוספת נתונים מתא ריק. העקבות האלה צריכות להישאר שטוחות, וכל ההפרעות או הגלים הקלים הם סימנים של רעש ויש להתייחס אליהם. שינויי הלחץ מדלתות פתיחה וסגירה או מתפקוד HVAC יכולים גם להוסיף לתנודות שגויות, ולהבטיח שפעולות אלה יתרחשו מינימלית (ולציין אותן כאשר יתרחשו) היא קריטית. לחות יכולה גם להשפיע על נפח הגאות המחושב ואוורור הדקות, מה שהופך אותו לחשוב מאוד לאשר את החדר ואת הצינורות המחוברים יבשים לפני השימוש. במקרה הצורך, השימוש בחרוזי דריריט ברצף עם צינורות הזרימה יכול לעזור להסיר את כל העיבוי באוויר לפני הכניסה הקאמרית. צעד זה היה מונהג במקרים שבהם הלחות הייתה באופן שגרתי גבוה יותר מאשר רמות המפורטות במדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים8 (30% – 70%, באופן אידיאלי בתוך 10% של setpoint). לחות יכולה גם להצטבר בחדר בשל נוכחותו של בעל החיים. למרות שלחות מסוימת היא נורמלית, היא עשויה להמשיך לבנות אם בעל החיים פעיל באופן מוגזם או מוצב בחדר למשך זמן ארוך יותר. אם רמות הלחות מגיעות לרמות מרביות (99.99%), ייתכן שיהיה צורך לפתוח את החדר ולהימחק במהלך הניסויים כדי לשמור על אמצעי נשימה דומים. התוכנה מהווה שינויים בלחץ ברומטרי, בטמפרטורת הסביבה, בטמפרטורת החיים ובלחות. השיטה הטובה ביותר היא לשמור על הערכים בטווח סביר, כך שיושוו "תפוחים לתפוחים" על פני גילאים, זנים ומינים. יתר על כן, מחזור האחראי של עכברים ואת טווח הזמן של בדיקות, כמו גם תנאי תאורה ספציפיים של החדר, הם פרטים חשובים כדי לשקול13,17. למשל, אנחנו בדרך כלל בודקים עכברים בתאורה דומה לחדר המגורים שלהם (או מחזור אור או כהה) ובתוך טווח 3 h18. על הניסויים להישאר עיוורים גם לקבוצות החיות במהלך איסוף נתונים וניתוחים כדי למנוע הבדלים בבחירת תוכנית הבסיס. במידת האפשר, אותו ניסוי צריך לאסוף את כל הנתונים ו/או לנתח את כל העקבות בניסוי נתון. צעדים כדי לשמור על הניסויים מעוור את קבוצות החיות, כמו גם אקראיות ובדיקות בזמנים דומים של היום, הם חיוניים לקשיחות החקירה. בסופו של דבר, ישנם גורמים זרים שעשויים לשנות את מקדמי הזרימה, וחששות אלה יש לשקול בעת ביצוע UBP.
שיטת ה-UBP היא טכניקה המשמשת לאפיון תבנית הנשימה בעכברים. מדדים בסיסיים ניתן לאסוף בתוך 2 h כאשר משתמש מקטע נשימה של 15. כאן אנו מדווחים על שיטה אשר ניתן לבצע עם עכברים מיושן, אשר לעתים קרובות מוטרד יותר בחדר מאשר עכברים צעירים, הרומז כי זנים אחרים להוטים או פעיל העכבר יכול גם להיבדק עם פרוטוקול זה. הנתונים שנאספו UBP הוא לא פולשני ומאפשר בדיקות על נקודות זמן מרובות, אשר שימושי עבור מחקרים על הזדקנות, טיפול בסמים, התקדמות המחלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לאנג לה, שרה רובי, ומריסה מיקי על עבודתם בשמירה על מושבות החיות. עבודה זו ממומנת על ידי 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. לתמוך CNR), ואת מלגת מחקר לתואר ראשון McDevitt במדעי הטבע (BEE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
- DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
- Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
- Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
- van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
- Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
- Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , Bethesda, MD. (2018).
- Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
- Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
- Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
- Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
- Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
- Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
- Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
- Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
- Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10 (2018).
