Summary

Metod för att få mönster av andning i senescent möss genom ohämmad barometrisk plethysmography

Published: April 28, 2020
doi:

Summary

Ohämmad barometrisk plethysmografi används för att kvantifiera andningsmönstret hos vakna möss. Vi visar att 15 s segment under ett standardiserat protokoll visar liknande värden som en längre tid av tyst andning. Denna metod möjliggör också kvantifiering av apné och förstärkta andetag under den första timmen i kammaren.

Abstract

Ohämmad barometrisk plethysmography (UBP) är en metod för att kvantifiera mönstret för andning hos möss, där andningsfrekvens, tidvattenvolym och minut ventilation rutinmässigt rapporteras. Dessutom kan information samlas in om den neurala produktionen av andning, inklusive förekomsten av centrala apnéer och förstärkta andetag. En viktig faktor för UBP är att få en andning segment med en minimal inverkan av oroliga eller aktiva beteenden, att belysa svaret på andningsutmaningar. Här presenterar vi ett protokoll som gör det möjligt att erhålla korta, tysta baslinjer hos äldre möss, jämförbart med att vänta på längre anfall av tyst andning. Användningen av kortare tidssegment är värdefullt, eftersom vissa stammar av möss kan bli alltmer retbara eller ängsliga, och längre perioder av tyst andning kanske inte uppnås inom en rimlig tidsram. Vi placerade 22 månader gamla möss i en UBP kammare och jämförde fyra 15 s tyst andning segment mellan minuter 60-120 till en längre 10 min tyst andning period som tog 2-3 h att förvärva. Vi fick också räknas av centrala apnéer och förstärkta andetag före den tysta andning segment, efter en 30 min förtrogenhet period. Vi visar att 10 min tyst andning är jämförbar med att använda en mycket kortare 15 s varaktighet. Dessutom kan tiden fram till dessa 15 s tysta andningssegment användas för att samla in data om apnéer av centralt ursprung. Detta protokoll gör det möjligt för utredare att samla in mönster-of-andning data i en viss tid och gör tyst baslinje åtgärder genomförbara för möss som kan uppvisar ökade mängder retbara beteende. Själva UBP-metoden är ett användbart och icke-invasivt sätt att samla in mönster-of-andning data och gör det möjligt för möss som ska testas över flera tidpunkter.

Introduction

UBP är en vanlig teknik för bedömning av andningsmönster1,,2,,3,4. I denna metod placeras möss i en sluten kammare där tryckskillnader mellan huvudkammaren (där djuret är inrymt) och en referenskammare filtreras genom en pneumotachograf för att erhålla värden. Den resulterande UBP setup är noninvasive och ohämmad och gör det möjligt för luftvägarna åtgärder som skall bedömas utan krav på anestesi eller kirurgi. Dessutom är denna teknik lämplig för studier som kräver flera mätningar i samma mus över tiden. Variabler som andningsfrekvens, tidvattenvolym och minutventilation kan kvantifieras med denna metod, under en enda studie eller över flera försök. Hela kroppen UBP ger också åtgärder för topp flöden och andningscykeln varaktighet. Tillsammans kvantifierar dessa parametrar andningsmönstret. De registrerade andningsspåren gör det också möjligt att granska data och räkna antalet centrala apnéer som visas inom en viss tidsperiod. Detta antal kan användas tillsammans med en analys av tidvattenvolym och inandningstider för att mäta andra förändringar i andningsmönstret.

Medan flera noninvasive plethysmography tekniker finns för direkt bedömning av pulmonell fysiologiska parametrar, hela kroppen UBP möjliggör ett sätt att skärmen för andningsfunktion med minimal onödig stress till musen. Head-out plethysmography, som använder tidvatten midexpiratory flöde åtgärder och är också noninvasive, förlitar sig på återhållsamhet, liksom många andra typer av plethysmography (t.ex. dubbel-kammare plethysmography). Även om dessa metoder har använts i gnagare modeller för att mäta luftvägarna lyhördhet5,användning av hals kragar eller små fasthållningsanordningar kan ta möss (jämfört med andra arter) längre tid att acklimatisera sig till och återgå sin andning till vilonivåer.

Att få ett optimalt luftandningssegment är en viktig faktor för jämförelser vid baslinjen. Den ökade användningen av kommersiellt tillgängliga plethysmography system gör samla mönster-of-andning data möjligt i många laboratorier. Viktigt är att andningsmönstret varierar under hela insamlingsperioden, särskilt för möss. Med det sagt är det nödvändigt att standardisera baslinjeanalys som ett sätt att se till att utbildningsnivå av försökskarperger inte förvirrar resultaten. Det finns många sätt att samla in en luft-andning segment, som fungerar som ett område av variation mellan experimentell design. Ett exempel är i genomsnitt den slutliga 10-30 min data efter en tidigare definierad uppsättning tid inom kammaren1, medan en annan metod innebär att vänta tills musen är synligt lugn i 5-10 min6. Den senare kan ta 2–3 h att uppnå och i vissa fall kan en rättegång behöva överges om musen inte är lugn tillräckligt länge. Denna oro är en särskilt viktig faktor för stammar av möss där observerade beteenden är mer oroliga och retbara7. Dessa möss kan ta längre tid att anpassa sig till kammaren miljön och bara behålla lugnet för korta skurar av tid. Om du begränsar den tid som ägnas åt baslinjesamling standardiseras kammartiden för varje mus.

Det är viktigt att försökslösa får en lämplig baslinje som omfattar vilande beteendevärden i musen men också sker i tid. Därför är målet med denna rapport att ge en beskrivning av metoder som används för att få korta tysta baslinjevärden för andningsparametrar hos möss. Dessutom rapporterar vi att apnéer och förstärkta andetag kan kvantifieras under den första timmen i kammaren.

Protocol

Alla förfaranden godkändes av Le Moyne College Institutional Animal Care and Use Committee. All användning av djur överensstämde med de riktlinjer som beskrivs i handledningen för skötsel och användning av försöksdjur8. OBS: (Kritisk) Före försök, inhämta alla nödvändiga godkännanden och utbildning som krävs för djuranvändning. Det är viktigt att experimentörerna är bekanta med musen beteenden och aktivitetsnivåer, inklusive teck…

Representative Results

Resultaten av UBP som en utvärdering av andningsmönster hos 16 äldre (22 månader gamla) möss som utförs under normal luftgas (20,93% O2 med balanserad N2) rapporteras. Analysen inkluderade först en jämförelse av ett längre 10 min tyst andningssegment (som tog över 2 h att få) jämfört med genomsnittet av fyra korta 15 s segment (kvantifieras inom minut 60–120). En representativ flödesspårning av tyst andning, där andningen är förenlig med inga aktiva andningsbeteenden, finns i <s…

Discussion

Protokollet ger information om en tyst andningsbaslinje hos möss, samt samla in data om centrala apnéer och förstärkta andetag. De representativa resultaten visar att en 10 min tyst baslinje har ett liknande andningsmönster jämfört med i genomsnitt fyra 15 s anfall för en kohort av gamla möss. Viktigt är att 15 s skjutningar är inte statistiskt annorlunda, inte heller dessa grupper har skillnader i variation från varandra med Levene test. Dessa data visar att även en kort skjutningen är tillräcklig för at…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna vill tacka Angela Le, Sarah Ruby och Marisa Mickey för deras arbete med att upprätthålla djurkolonierna. Detta arbete finansierades av 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. för att stödja CNR) och McDevitt Undergraduate Research Fellowship in Natural Sciences (BEE).

Materials

Carbon Dioxide Analyzer AEI Technologies CD-3A 
Carbon Dioxide Sensor AEI Technologies  P-61B
Computer must be compliant with Ponemah requirements
Drierite beads PermaPure LLC DM-AR
Flow Control AEI Technologies R-1 vacuum
Flowmeter TSI 4100 need one per chamber and one for vacuum
Gas Mixer MCQ Instruments GB-103
Gas Tanks Haun 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen – food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges
Oxygen Analyzer AEI Technologies S-3A
Oxygen Sensor AEI Technologies  N-22M
Polyurethane Tubing SMC TUS 0604 Y-20
Ponemah Software DSI
Small Rodent Chamber Buxco/DSI
Thermometer (LifeChip System) Destron-Fearing any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber 
Transducers Validyne DP45 need one per chamber 
Whole Body Plethysmography System  Data Science International (DSI) Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. 

References

  1. DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
  2. Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
  3. Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
  4. van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
  5. Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
  6. Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , (2018).
  7. Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
  8. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , (2011).
  9. Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
  10. Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
  11. Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
  12. Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
  13. Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
  14. Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
  15. Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
  16. Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
  17. Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
  18. Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10 (2018).

Play Video

Cite This Article
Receno, C. N., Cunningham, C. M., Eassa, B. E., Purdy, R., DeRuisseau, L. R. Method to Obtain Pattern of Breathing in Senescent Mice through Unrestrained Barometric Plethysmography. J. Vis. Exp. (158), e59393, doi:10.3791/59393 (2020).

View Video