Summary
Unrestrained barometrik plethysmography uyanık farelerde solunum paterni ölçmek için kullanılır. Standart bir protokol altında 15 s segmentleri sessiz nefes uzun bir süre benzer değerleri görüntülemek olduğunu göstermektedir. Bu metodoloji aynı zamanda apne ve artırılmış nefeslerin haznedeki ilk saat boyunca ölçülmesine olanak sağlar.
Abstract
Sınırsız barometrik pletirmografi (UBP), solunum sıklığı, gelgit hacmi ve dakika havalandırmasının rutin olarak raporlandığı farelerde solunum paternini ölçmek için kullanılan bir yöntemdir. Ayrıca, merkezi apne ve artırılmış nefes varlığı da dahil olmak üzere, solunum nöral çıkışı ile ilgili bilgi toplanabilir. UBP için önemli bir husus endişeli veya aktif davranışların en az etkisi ile bir nefes segmenti elde etmektir, solunum zorluklarına yanıt açıklamak için. Burada, yaşlı farelerde kısa ve sessiz taban çizgilerinin elde edilmesine olanak tanıyan bir protokol sıyoruz, daha uzun nefes alma nöbetlerini beklemekle karşılaştırılabilir. Farelerin bazı suşları giderek daha heyecanlı veya endişeli olabilir ve sessiz nefes alma uzun süre makul bir zaman dilimi içinde elde olmayabilir gibi kısa zaman segmentleri kullanımı değerlidir. 22 aylık fareleri UBP odasına yerleştirdik ve dakikalar arasında 4 adet 15 s sessiz nefes alma segmentini 60-120 dakika arasında, elde etmek için 2-3 saat süren daha uzun 10 dk sessiz nefes alma periyoduna karşılaştırdık. Ayrıca 30 dk'lık bir alışma dönemini takiben, sessiz nefes segmentlerinden önce merkezi apne ve artırılmış nefes sayımları elde ettik. Biz 10 dakika sessiz nefes çok daha kısa 15 s süresi kullanarak karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Ayrıca, bu 15 s sessiz nefes segmentleri kadar önde gelen zaman merkezi kökenli apne ile ilgili veri toplamak için kullanılabilir. Bu protokol, araştırmacıların belirli bir süre içinde nefes alma deseni verilerini toplamasına olanak tanır ve fareler için daha fazla heyecan verici davranış sergileyebilecek sessiz temel önlemleri uygulanabilir kılar. UBP metodolojisi kendisi, nefes alma deseni verilerini toplamak için yararlı ve noninvaziv bir yol sağlar ve farelerin birkaç zaman noktasında test edilmesine olanak tanır.
Introduction
UBP solunum desenleri1,2,,3,4değerlendirilmesi için ortak bir tekniktir. Bu yöntemde fareler, ana hazne (hayvanın bulunduğu yer) ile referans odası arasındaki basınç farklarının değer elde etmek için pnömonikokografyoluyla filtrelendiği kapalı bir odaya yerleştirilir. Ortaya çıkan UBP kurulumu noninvaziv ve sınırsızdır ve anestezi veya ameliyat şartı olmadan solunum önlemlerinin değerlendirilmesini sağlar. Ayrıca, bu teknik zaman içinde aynı farede birden fazla ölçüm gerektiren çalışmalar için uygundur. Solunum frekansı, gelgit hacmi ve dakika havalandırması gibi değişkenler bu yöntemle, tek bir deneme sırasında veya birkaç denemede ölçülebilir. Tüm vücut UBP de pik akışları ve solunum döngüsü süresi önlemleri sağlar. Birlikte, bu parametreler solunum deseni ölçmek. Kaydedilen solunum izleri, verilerin gözden geçirilmesini ve belirli bir süre içinde görüntülenen merkezi apne lerin sayısını saymayı da mümkün kılar. Bu sayı, nefes alma paternindeki diğer değişiklikleri ölçmek için gelgit hacmi ve inspiratuar zamanların analizi ile birlikte kullanılabilir.
Pulmoner fizyolojik parametrelerin doğrudan değerlendirilmesi için çeşitli noninvaziv pletirmografi teknikleri mevcut olmakla birlikte, tüm vücut UBP fareye en az gereksiz stres ile solunum fonksiyonu için tarama için bir yol sağlar. Gelgit orta ekspiratuar akış ölçütlerini kullanan ve aynı zamanda noninvaziv olan baş-out pletismografi, diğer birçok plethysmografi türünde (örn. çift odalı pletismografi) olduğu gibi kısıtlamaya dayanır. Bu yöntemler hava yolu duyarlılığını ölçmek için kemirgen modellerinde kullanılmış olsa da5,boyun yakalarının veya küçük bağlama tüplerinin kullanımı farelerin (diğer türlere karşı) alışması ve solunumlarını dinlenme seviyelerine döndürmesi için daha uzun sürebilir.
Optimum bir hava soluyan segment elde etmek temel karşılaştırmalar için önemli bir husustur. Ticari olarak mevcut pletismografi sistemlerinin kullanımının artması, birçok laboratuvarda nefes alma deseni verilerinin toplanmasımümkün kılmaktadır. Daha da önemlisi, nefes alma deseni toplama dönemi boyunca, özellikle fareler için değişkendir. Bununla birlikte, deneycilerin eğitim düzeyinin sonuçları şaşırtmamasını sağlamak için temel analizi standartlaştırmak gerekir. Deneysel tasarımlar arasında bir varyasyon alanı olarak hizmet veren, bir hava soluma segmenti toplamak için çeşitli yollar vardır. Bir örnek, oda1içinde daha önce tanımlanmış bir zaman kümesini izleyerek son 10-30 dk veri ortalamaiçerir, başka bir yöntem fare 5-10 dk6için gözle görülür sakin olana kadar bekleme içerir. İkinci ulaşmak için 2-3 saat sürebilir ve bazı durumlarda, fare yeterince uzun süre sakin değilse bir deneme terk edilmesi gerekebilir. Bu endişe, gözlenen davranışların daha endişeli ve heyecan verici olduğu fare suşları için özellikle önemli bir husustur7. Bu farelerin oda ortamına uyum sağlaması daha uzun sürebilir ve sadece kısa bir süre için sakin kalırlar. Taban çizgisi koleksiyonuna ayrılan süreyi sınırlamak, her fareiçin oda süresini standartlaştırır.
Denemecilerin faredeki dinlenme davranış değerlerini kapsayan ancak aynı zamanda zamanında meydana gelen uygun bir taban çizgisi edinmeleri çok önemlidir. Bu nedenle, bu raporun amacı farelerde solunum parametreleri için kısa sessiz temel değerleri elde etmek için kullanılan yöntemlerin bir açıklamasını sağlamaktır. Ayrıca, apne ve artırılmış nefes odasında ilk saat içinde ölçülebilir rapor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Le Moyne College Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Hayvanların tüm kullanımı, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda açıklanan politikalarla uyum içindedir8.
NOT: (Kritik) Deneyden önce, hayvan kullanımı için gerekli tüm onayları ve eğitimi alın. Deneycilerin uyku, sıkıntı ve/veya hareket objesi ve normal koklama ve nefes alma işaretleri de dahil olmak üzere fare davranışları ve aktivite düzeylerine aşina olması önemlidir.
1. Tüm vücut Barometrik Pletilografi Odası
- Konektörler, O-halkalar, vb. dahil olmak üzere barometrik pletirmografi odası için uygun kullanım kılavuzlarını okuyun ve analizörleri (örn. metabolik) ve yazılıma özgü parametreleri tanımlamak için standart bir protokol dosyası oluşturun.
- Tüm hortumların ve tüplerin haznebağlı olduğundan emin olun. Bir gaz akış tüpü (akış-in) ve bir vakum tüpü (flow-out) doğrudan barometrik pletismografi odasına bağlayın.
NOT: Giriş, açılış işaretli sapma akışınailiştirilmelidir. - GAZ mikserine CO2, O2ve N2 gaz tanklarını takın. Denemeden önce tüm gaz tanklarının açık konumda olduğundan emin olun.
2. Barometrik Plethysmograph Odasının Kalibrasyonu
- Barometrik pletizmografi yazılımının Donanım sekmesi altında 7700-Amplifikatör Kurulumunu seçerek yüksek ve düşük bir gaz akışını kalibre edin.
- Deneysel tasarım ve gaz analizörleri (~0.1 L/dk) için uygun bir vakum (hazneden dışarı akış) ayarlayın.
NOT: Doğru metabolik kayıtlar için kalibrasyonlar ve deney boyunca çıkış hızı aynı kalmalıdır. - Akış tüpünü hazneden çıkararak ve vakumu kapatarak düşük bir hava akışı ayarlayın.
- İlgili oda için Düşük Birim hücresine 0 girerek sıfır akışını kaydedin. Düşük Cal hücresine çift tıklayın, zamanı 3'e değiştirin ve Ölçü'yetıklayın.
- Akış tüpünü yeniden takın ve gazın (%20,93 O2, dengeli N2) gaz karıştırıcısından barometrik pletirmografi odasından akmasına izin verin.
- Girişi litre/dakikadan mililitre/saniyeye dönüştürün. İlgili oda için Yüksek Birim hücresini tıklatın ve değeri mililitre/saniye cinsinden girin. Yüksek Cal'ıçift tıklatın, zamanı 3'e değiştirin ve Ölçü'yetıklayın.
- Metabolik analizörleri barometrik plethysmography yazılımına kalibre etmek için 7700-Amplifikatör Kurulumu sekmesini açık bırakın.
3. Metabolik Analizör Kalibrasyonu
- Gaz karıştırıcı programında, gaz karıştırıcısını %20,93 O2 ve %79,07 N2içeren bir gaz akışı sağlamak için ayarlayın.
- Metabolik analizörlerde, O2 kalibrasyon seviyesini %20,93'e, CO2'yi ise %0'a ayarlayın. Uygun değerler girilen aramayı Örnek'e geri çevirin.
- Yüksek O2 yüzdesini ayarlayın. Barometrik pletiksmografi yazılımının ABCD-4 sekmesine tıklayın ve ardından C2 hattının Yüksek Birimi'nin altına 20.93 girin. Yüksek Calaltında, 3 s zaman değiştirin ve Measureçarptı.
- Düşük CO2 yüzdesini ayarlayın. C3 satırının Düşük Cal'ının altına 0 girin ve sonra zamanı 3'e değiştirin ve Düşük Cal'ınaltındaki Ölçü'ye tıklayın.
- Gaz karıştırıcı programında, O2 değerini %10'a, CO2 değerini ise %5'e değiştirin. Gaz akışının bu değerlere uyum sağlaması için birkaç dakika bekleyin. Metabolik analizörlerde, CO2'yi %5'e eşit olarak kalibre etmek için ayarlama düğümlerini çevirin. Değerler kalibre edildikten sonra kadranı Örnek'e geri çevirdiğinden emin olun.
- Yüksek CO2 yüzdesini ayarlayın. Barometrik pletismografi yazılımına O2 ve CO2'ye uygun değerler eklemeden önce analizör okumalarının kararlı olduğundan emin olun. C3 altında Yüksek Birim tıklayın ve 5girin . Yüksek Cal'ı 3 s'e değiştirin ve Measuretuşuna basın.
- Düşük O2 yüzdesini ayarlayın. C2 seçeneğinin altındaki Düşük Birim'i tıklatın ve 10girin. Düşük Cal'ıtıklatın, 3 s'yi girdive Ölçü'yetıklayın.
- Gaz karıştırıcıüzerindeki gaz değerlerini %20,93 O2 ve %79,07 N2'yedeğiştirin. Odanın bu değerlere uyum sağlaması için birkaç dakika bekleyin. Metabolik analizörler otomatik olarak% 20.93 O2 ve 0% CO2okumazsanız adımları 3.1\u20123.7 tekrarlayın , uygun kalibrasyon sağlamak için. Sertifikalı gaz tankları ile uygun kalibrasyonu rutin olarak onaylayın.
- Barometrik pletismografi odasına bağlı akış ölçerleri yeniden kontrol edin. Hava akışını odanın içine ve dışına, deneyiçin uygun hızlara göre ayarlayın (genellikle 0.1-0.3 L/dk).
- Barometrik pletismografi yazılımına tüm ayarlar uygulandıktan sonra, kayda başlamak için Tamam'ı tıklatın.
4. Sınırsız Barometrik Pletilografi
- Farenin ağırlığını ve ilk vücut sıcaklığını kaydedin. Boş bir odadan O2 ve CO2 verilerini toplamak için fareyi odaya yerleştirmeden önce 10 dakika bekleyin. Gürültü ve kokuların veri toplamaya engel olmaması için farelere aşina sakin bir alanda çalışın. Veri toplama odasına girip çıkan kapıların veya personelin açılması ve kapatılması da dahil olmak üzere olası aksaklıkları önleyin.
NOT: Bu özel protokolde 22 aylık erkek C57BL/6J fare kullanılmıştır. - İlk saat boyunca, farenin davranışlarını belgele ve odanın giriş/çıkışı akışının belirli değerleri de dahil olmak üzere ayrıntılı notlar alın.
- Oda alışkanlığı 60 dakika sonra, aşağıdaki 60 dk için sessiz nefes segmentleri için izlemek. Koklama ve tımar olmadan uzunluğu en az 15 s süren herhangi bir segmentleri liste. İmplante edilebilir bir cihaz kullanırken her 10 dakikada bir vücut ısısı ölçüleri alın.
- Deneyin sonunda fareyi odadan çıkarın ve kafesine geri yerleştirin. Tüm ekipmanlar temizlenmeli ve iyice silinmelidir. Su damlacıkları kalırsa, bunları kaldırmak için basınçlı hava kullanın.
5. Solunum Ve Metabolizma Deseni Analizi
- Barometrik pletismografi inceleme dosyasını açın ve ilgi çeken hayvan için kaydedilen notlara başvurun.
- Yazılımda Metabolik paneli açın ve oda boşken, O2 ve CO2'ninilk 10 dk ortalamasını alın. Bu değerleri FiO2 ve FiCO2olarak kaydedin.
- Barometrik plethysmography yazılımının Akış panelini görüntüleyin. Öznitelikleri Çözümle'yi sağ tıklatın ve uygun parametreleri ayarlayın. Meta 1 sekmesi altında, Adım 5.2'den FiO2 ve FiCO2'yi girin ve VO 2 ve VCO2'yihesaplamak için Meta 2'ninaltındaki odaya akışı girin.
- Nefes analizi deseni için, hayvan davranışları ve akış paneli izleme hakkında notlar kullanarak sessiz nefes 15 saniye için zaman onaylamak. Data Parser sekmesinden Açık Veri Parser Diyaloğu altında 15 s aralıklı sessiz nefes alma sürelerini girin. Yalnızca belirli 15 s'lik ilgi segmentlerini göstermek için Parser Görünüm Modu'nu tıklatın.
- Ayrışmış Türemiş Verileri Kaydet'itıklatın. Binned verileri elde etmek için bir elektronik tablodaki veri dosyasını açın.
6. Apne ve Artırılmış Nefeslerin Analizi
- Açık inceleme dosyasında Parser Görünüm Modu'ndançıkın. Kurulum > P3 Kurulumu altında Grafik Kurulumu seçeneğine gidin ve Tür altında Sayfa Görünümü'nü seçin. Type Bölme sayısı için 5'i seçin. Mililitre/saniyede akış ölçümleri için -2'yi Düşük etiketli kutuya ve 2'yi yüksek etiketli kutuya girin. Değişiklikleri uygulayın.
- Akış izleme panelindeki 30 dk işaretine gidin.
- Fare odaya yerleştirildikten sonra 30-60 dakika boyunca apne ve artırılmış nefes leri sayın. Bir apne göstergesi, 0,5 s daha uzun veya eşit süren askıya nefes süreleri ölçmek. Artırılmış nefesler, 1,25 mL/s'nin üzerindeki solunum takibinde keskin bir artış ve ardından -0,75 mL/s'nin altında keskin bir düşüş ile gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
UBP sonuçları normal hava gazı altında yapılan 16 yaşlı (22 aylık) farelerde (22 aylık) solunum paterninin değerlendirilmesinde (%20.93 O2 dengeli N2)rapor edilmiştir. Analiz ilk olarak daha uzun 10 dk sessiz nefes alma segmentinin (elde etmek için 2 saat üzerinden alınan) dört kısa 15 s segmentinin ortalaması ile karşılaştırılmasını içeriyordu (60-120 dakika içinde ölçüldü). Sakin nefes almanın, aktif solunum davranışları yla tutarlı olmadığı temsili bir akış izleme, Şekil 1A'daverilmiştir. Benzer izlemeler hayvanlardan toplandığında, nefeslerin %100'ü yazılım tarafından kabul edilmelidir. Ancak Şekil 1B, farelerin odayı keşfettiği, kokladığı ve/veya tımar ettiği daha aktif bir segmentten nefes alma temsil eder. Şekil 1B'de gösterilene benzer izlemelerin yazılım tarafından kabul edilme olasılığı daha düşüktür ve bu metodoloji ile kullanılan ve açıklanan nefes alma koleksiyonu türü için ideal değildir. İki zaman noktası arasındaki olası solunum örüntü farklarının değerlendirilmesi için seçilen parametreler solunum frekansı(Şekil 2A),gelgit hacmi (VT, Şekil 2B), dakika havalandırma (VE, Şekil 2C), gelgit hacmi/inspiratuar zaman oranı (VT/Ti, Şekil 2D),ve dakika havalandırma/çıkarılan karbondioksit oranı (VE/VCO2/g, Şekil 2E),hepsi barometrik pletirmografi yazılımı ve Drorbaugh ve Fenn denklemi kullanılarak hesaplanmıştır. Bu önlemler için bildirilen değerler, daha önce fare modeli6,9için bildirdiğimiz aralıktadır. Gruplar arasında önemli bir fark açıklığa kavuşturulmaz; solunum sıklığı ve VT verilerinin birden fazla karşılaştırması için post hoc düzeltmeleri Bonferroni ile muhasebeleştirilmiştir (p < 0.025 anlamlı kabul edilmiştir). Bu sonuçlar, basitleştirilmiş bir iletişim kuralının 15 s taban çizgisi kullanılarak kullanılmasının daha uzun bir temel iletişim kuralına benzer sonuçlar sağladığını göstermektedir.
Frekans, VT, VE, VT/Ti ve VE/VCO2/g(Şekil 3)için dört 15 s bazbasamak segmentinin her biri ile daha ileri analizler yapıldı. Zaman noktalarından herhangi biri arasında anlamlı fark(p > 0.05) saptanmandı. Ayrıca herhangi bir desen-nefes ölçmek için dört zaman segmentleri arasında değişkenlik hiçbir fark vardı. Ayrıca, 15 s grubun 10 dk grubuna karşı segmentinin değişkenliğini test ettik ve ortalama grup verilerini karşılaştırırken Levene'nin testini kullanarak önemli bir fark bulamadık.
UBP protokolünün 30-60 dakika boyunca her bir hayvan için gözlenen apne ve artırılmış nefes sayısı Şekil 4'tever. Bu sonuçlar, yaşlı hayvanların yüksek sayıda apne ve artırılmış nefeslerin 30 dk'lık bir açıklık içinde varlığını gösterdiğini göstermektedir (Şekil 1C'degösterilen izleme). Bu bulgular 22 aylık farelerde gözlendiği için veriler yaşlanma sürecindeki değişimlerin göstergesidir. Apne ve artırılmış nefes analizleri için interrater güvenilirliğini doğrulamak için, Pearson korelasyon iki farklı araştırmacılar için hesaplanmıştır. Apneler için r = .99 değeri ve artırılmış nefesler için r = 0,86 değeri ile belirtildiği gibi, raters arasında yüksek derecede anlaşma bulundu. Gelecekteki çalışmalarda, bir kontrol grubuna göre apne artan sayıda bir sinir bileşeni kaynaklanan bir solunum disfonksiyonu söylüyorum olacaktır.
Şekil 1: Temsili akış izlemeleri. (A) Farenin koklama veya tımar gibi etkin davranışları sergilemediği sessiz bir taban çizgisinden gelen akış izleme. (B) Analizlerimizde yer almayan aktif bir solunum döneminden gelen akış takibi, farelerin oda üzerinde hareket ettiği ve birçok nefesin rutin olarak kabul edilmediğini. (C) Artırılmış bir nefesi gösteren akış takibi ve ardından apne dönemi. Tüm izlemeler için 5 s penceresi gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Solunum parametreleri 22 aylık farelerde 10 dk ve 15 s sakin solunum segmentleri için benzerdir. Barometrik pletismografi yaşlı farelerde(n = 16, 22 aylık) solunum verilerini toplamak için kullanıldı. İki farklı zaman noktasında fareler için solunum verileri hesaplandı, yani farenin 60-120 dk'lık işareti içinde dört adet 15 s sakin aralıkların ortalaması ve 10 dk tutarlı sakin nefes alma için hesaplandı. (A) Solunum frekansı (nefes/dakika). (B) Gelgit hacmi (VT; mililitre/nefes). (C) Dakika havalandırma (VE; mililitre/dakika). (D) Gelgit hacminin ilham süresine oranı (VT/Ti; mililitre/saniye). (E) Dakika havalandırmasının, normale döndürülen karbondioksite oranı (VE/VCO2/g). Post hoc düzeltmeleri sonrası gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı fark yoktur(p > 0.025). Ortalamanın üzerindeki >3 SD değerleri aykırı olarak kabul edildi ve veri kümesinden kaldırıldı. Veriler ortalama ± SD olarak sunulur.
Şekil 3: Dört 15 s aralığının karşılaştırılması. Solunum verileri, 60-120 dk oda yerleşimi içinde dört ayrı 15 s aralığında sakin solunum farelerinde(n = 16, 22 aylık) hesaplandı. (A) Solunum frekansı (nefes/dakika). (B) Gelgit hacmi (VT; mililitre/nefes). (C) Dakika havalandırma (VE; mililitre/dakika). (D) Gelgit hacminin ilham süresine oranı (VT/Ti; mililitre/saniye). (E) Dakika havalandırmasının, normale döndürülen karbondioksite oranı (VE/VCO2/g). Zaman dilimleri arasında istatistiksel olarak anlamlı fark yoktur(p > 0.05). Aykırı lar ortalamanın üzerinde >3 SD olarak tanımlanır ve kaldırılır. Veriler ortalama ± SD olarak sunulur.
Şekil 4: Farelerde apne ve artırılmış nefes sayar. Apneler (≥0.5 s nefes almadan) ve artırılmış nefesler (AP'ler; 1.25 mL/s'nin üzerinde inhalasyonda keskin bir artış ve ardından -0.75 mL/s) yaşlı farelerde(n = 16, 22 aylık) 30-60 dakika arasında sayıldı. Sayımlar 30 dk üzerinden analiz edildi ve bu süre için toplam rapor edildi. Veriler ortalama ± SD olarak sunulur.
Şekil 5: Sınırsız barometrik pletiksografi (UBP) kurulumu şeması. Genel UBP kurulumu, şekilde açıklanana benzer olmalıdır. Odaya giren ve çıkan gazlar için akış ölçümleri ölçülmeli ve gaz bileşimi veri yorumu için bilinmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol, farelerde sakin bir solunum taban çizgisi nin yanı sıra merkezi apneler ve artırılmış nefesler hakkında veri toplama hakkında bilgi sağlar. Temsili sonuçlar, 10 dk sessiz bir taban çizgisinin, yaşlı farelerden oluşan bir kohort için ortalama dört 15 s nöbeti ile karşılaştırıldığında benzer bir nefes alma desenine sahip olduğunu göstermektedir. Daha da önemlisi, 15 s nöbetleri istatistiksel olarak farklı değildir, ne de bu grupların Levene testi kullanarak birbirinden varyasyon farklılıkları yok. Bu veriler, bir kısa nöbetin bile sessiz nefes alma nın izlenmesi için yeterli olduğunu göstermektedir. Ancak, 10 dk bout minimal koklama ve tımar faaliyetleri kapsayabilir gibi, 15 s vs 10 dk bir fare içinde bireysel varyasyon analiz farklı bulgular neden olabilir tamamen mümkündür. Ancak, tek tek fare temel segmentleri karşılaştırmak için Levene testi kullanarak bu protokolde açıklanan dan farklı bir çözümsağlar. Genel olarak, bu metodolojinin tasarımı, odada 60-120 dakika boyunca elde edilebilen 15 s nefes segmenti kullanır, buna karşı her farenin daha uzun süresessiz taban çizgisi elde etmesini beklemek zorunda kalır.
Taban çizgisi için gereken daha kısa süre, sessiz nefes almak için daha endişeli/tedirgin farelerin suşlarının test edilmesine olanak tanır. Daha uzun bir solunum segmentinin (yani, 10 veya 2 dakika) kullanılması protokol süresini uzatır ve fareler 3 saat içinde sessiz bir nefes izi göstermezlerse denemenin terk edilmesi gerekebileceği bir noktaya kadar uzatAbilir. Birçok deneysel tasarım da solunum zorlukları dahil olduğundan (yani, hipoksi), diğer gazlar için ayrılan uzun süre temel toplama süresi standartolması için ihtiyaç vurgulamaktadır. Sessiz nefes tek bir 15 s nöbeti kullanımı özellikle odasında heyecan verici olabilir fareler (ve fare suşları) ile çalışma endişesini hafifletmeye yardımcı olur. Barometrik pletizografi ile çalışırken, çalışma başına farelerin ~% 10 oda içinde sürekli sessiz nefes 2 dakika kadar az gerçekleştirmek için yetersizlik nedeniyle dışlanması gerektiğini bulundu. Önceki aşinalık çalışmalarının uygulanması, deney günü odaya yerleştirildiğinde farelerin daha hızlı sakinleşmesini sağlamakta başarısız oldu. Ancak, farklı suşları, cinsiyetler ve farelerin yaşları odaortamınafarklı tepki verebilir çünkü 10,11, bu alışkanlık teknikleri yararlı olabilir mümkündür12,bazı kohortlar için13. Bizim aşinalık denemeleri deney öncesi birkaç gün için test odasında 1-2 saat için UBP odasında fareler yerleştirerek oluşuyordu. Bu işlemden sonra hayvan davranışlarında herhangi bir değişiklik gözlenmezken, bir önceki çalışma, farelerde spontan fiziksel aktiviteile sonuçlanan yenilik etkilerini ortadan kaldırmak için 24 saat alışmaya ihtiyaç duyulduğunu göstermiştir12. Ayrıca, Kabir ve ark. ev kafesi barometrik plethysmography odasına benzer boyutta plastik silindirler yerleştirerek fareler deneme13önce kurulumları kendilerini tanımak için avantajlı olduğunu bulundu .
Bu protokol aynı zamanda merkezi apnelerin nicelleştirilmesi yoluyla farelerde olası solunum fonksiyon bozukluğu ortaya çıkarır, nöral kontrol sorunlarının göstergesi. Temel deseni-nefes toplama öncesinde gözlem otuz dakika tüm 16 yaşlı fareler apneik bölüm ve artırılmış nefes (Şekil 1Ctemsil) yüksek sayıda görüntülenen gösterdi. Bu yaşlı fare kohortundaki çok sayıda apne, bu protokolün deneye ek süre eklemeden başka bir önemli nefes alma ölçüsünü ölçme yeteneğini vurgular. Bu yaş ve hastalık ilerlemesi (varsa) varlığı ve apneik atak sayısı etkileyebilir unutulmamalıdır.
Sessiz nefes alma karakterize etmek için, protokol süresi boyunca barometrik pletismografi odası ve fare sürekli olarak gözlemlemek önemlidir. Sessiz nefes almanın ölçülmesi için fareler uyanık olmalı ancak koklama, tımar veya keşif gibi aktif davranışlara katılmamalıdır (Şekil 1A'datemsil edilir). Uyku sırasında nefes kalıpları uyanık bir hayvan,14,15olanlara farklı olabilir bu yana, uyanık devlet sırasında sakin nefes toplama önemlidir. Sessiz nefes almanın daha uzun segmentlerinin deneysel tasarıma bağlı olarak istenmeyebilecek uyku dönemlerini içermesi mümkündür. Bu durumda, aktif segmentler kısa (15 s) sessiz nefes segmentleri yan zaman uyku sırasında veri toplama olasılığı azalır gibi sessiz nefes kısa segmentleri belgelemek için ideal olacaktır. Odadaki fare davranışı farelerinkine göre çok farklı göründüğünden, sessiz nefes almanın daha uzun segmentlerinin fare modelinde elde edilmesinin zor olabileceğini gözlemledik. Uygun solunum segmentleri için fare solunum akışını eleştirel olarak gözlemlemek ve hayvan davranışlarını belgelemek önemlidir. Azaltılmış ventilasyon veya kararsız solunum durumlarında, bu yöntem hala kullanılabilir. Bu gibi durumlarda, deneycinin 15 s segmenti seçerken kohorta kör olması esastır. Yazılım programı 15 s döneminde% 100 kabul oranı ile, nefes ayırt etmelidir. Sabit farelerin hala endişeli olması mümkün olduğundan, hayvanların temel için davranışkriterlerini karşılamasını sağlamanın yanı sıra solunum izlemelerini de dikkate almanızı tavsiye ederiz. Bir önceki çalışmada fareler sakin davranış sergiledi rağmen, hala test odası içinde kontrollü uyaranlara yanıt olarak değişmiş solunum desenleri gösterdi bildirdi13.
Frekans, VT, VE, inspiratuar ve son kullanma süresi ve VE/VCO2 ölçüleri analizörler ve UBP yazılımı kullanılarak ölçülür ve literatürde sıklıkla raporlanır. Özellikle, VT ve VE hesaplamaları Drorbaugh ve Fenn denklemi16kullanın , hangi vücut ısısı için bilinen değerleri gerektirir, ortam odası sıcaklığı, nem, ve barometrik basınç. Bu önlemlerin deney boyunca en doğru VT ve VE değerleri için toplanması önerilir. Sistem tarafından hesaplanan diğer değişkenler dikkatli kullanılmalıdır. UBP pulmoner mekaniğin doğrudan bir ölçüsü değildir; bu nedenle, hava yolu direnci ile ilgili değişkenler (örneğin, gelişmiş duraklama [Penh]) akılda bu uyarı ile yorumlanmalıdır5. UBP kurulumunun yazılım tarafından hesaplanan değişkenleri etkilenebilen ek bileşenleri arasında akış hızları ve sistemin genel kalibrasyonu yer almaktadır. Contaların ve contaların düzgün çalıştığını onaylayın (sızıntı yok) ve tüm ekipmanların barometrik pletismografi odasına doğru bağlanmasını sağlayın(Şekil 5). Odanın giriş ve çıkış hızları tutarlı tutulmalıdır. Gerekli akış hızları UBP kurulumları arasında farklılık görebilir, bu nedenle denemeden önce bu değerleri denetlemek önemlidir. Odaya akış hızı zamanında temiz hava veya gaz sorunları sağlamak için yeterli olmalıdır. Akış hızı aynı zamanda metabolik analizörlerin oda ortamında CO2 birikmeden O2 ve CO2'yi ölçmelerine izin vermek için yeterli olmalıdır, bu da değişen bir nefes alma deseni riski oluşturur. Benzer şekilde, metabolik parametrelerin doğru bir şekilde ölçülmesini sağlamak için gaz karıştırıcı/analizör kalibrasyonlarının düzenli olarak uygulanması gerekir.
Bilinçli UBP için diğer hususlar hayvanlar test edilirken deneysel oda içinde dikkat dağıtıcı azaltılması içerir. Yüksek sesler, farklı kokular ve odada gereksiz personelin varlığı fareler tarafından sergilenen endişeli davranışlar ekleyebilirsiniz. Test alanları olarak küçük odalar kullanarak yardımcı olabilir, ancak bu mümkün değilse, karton duvarlar (küçük bir görüntüleme penceresi ile) fareler için dikkat dağıtıcı hafifletmek için oda çevreleyen kurulabilir. Barometrik pletismografi izlemelerinde ek gürültüyü önlemek için oda içindeki elektriksel aktivite minimumda tutulmalıdır. Bu nedenle, yazılımın boş bir hazneden veri topladığı 10 dk'lık dönemdeki akış izlemelerine dikkat etmek önemlidir. Bu izlemeler düz kalmalıdır ve herhangi bir kesinti veya hafif dalgalar gürültü belirtileri ve ele alınmalıdır. Kapıların açılması ve kapanmasından veya HVAC'ın işleyişinden kaynaklanan basınç değişiklikleri hatalı dalgalanmalara da katkıda bulunabilir ve bu eylemlerin en az düzeyde gerçekleşmesini sağlamak (ve meydana geldiklerinde bunları belirtmek) çok önemlidir. Nem aynı zamanda hesaplanan gelgit hacmini ve dakika havalandırmasını da etkileyerek, odanın ve bağlantı tüplerinin kullanılmadan önce kurutulduğunu doğrulamayı çok önemli hale getirir. Gerekirse, akış tüpleri ile sırayla Drierite boncuk kullanımı oda girişinden önce havada tüm yoğuşma kaldırmaya yardımcı olabilir. Bu adım, nem rutin olarak Hayvanların Bakım ve Kullanımı Kılavuzu8'de listelenen seviyelerden daha yüksek olduğu durumlarda (ideal olarak set noktasının %10'u içinde %30-%70) uygulanmalıdır. Nem de hayvanVarlığı nedeniyle odasında birikebilir. Bazı nem normal olmasına rağmen, hayvan aşırı aktif veya daha uzun süre ler için hazne yerleştirilir eğer inşa etmeye devam edebilir. Nem seviyeleri maksimum seviyelere ulaşırsa (%99.99), karşılaştırılabilir solunum ölçümlerini korumak için odanın deney sırasında açılması ve silinmesi gerekebilir. Yazılım, barometrik basınç, ortam sıcaklığı, hayvan sıcaklığı ve nem deki değişiklikleri hesaba katar. En iyi uygulama böylece "elma elma" yaş, suşları ve cinsiyetler arasında karşılaştırılmaktadır makul bir aralık içinde değerleri korumaktır. Ayrıca, farelerin sirkadiyen döngüsü ve test zaman aralığı, hem de odanın belirli aydınlatma koşulları, dikkate alınması gereken önemli ayrıntılardır 13,17. Örneğin, biz genellikle kendi konut odası (ya açık veya karanlık döngüsü) benzer aydınlatma ve 3 saat aralığı18içinde fareler test edin. Deneyciler ayrıca, bir taban çizgisinin seçimindeki farklılıkları önlemek için veri toplama ve analizler sırasında hayvan gruplarına karşı kör olmalıdır. Mümkün olduğunda, aynı deneyci tüm verileri toplamalı ve/veya belirli bir deneydeki tüm izlemeleri analiz etmelidir. Deneycileri hayvan gruplarına karşı kör edecek adımlar ve günün benzer zamanlarında rastgeleleştirme ve test etme, araştırmanın katılığı açısından çok önemlidir. Sonuç olarak, akış izlemelerini değiştirebilecek gereksiz faktörler vardır ve UBP yaparken bu endişeler göz önünde bulundurulmalıdır.
UBP yöntemi farelerde solunum paterni karakterize etmek için kullanılan bir tekniktir. Temel ölçüler 15 s solunum segmenti kullanılarak 2 saat içinde toplanabilir. Burada, genellikle küçük farelere göre odada daha tedirgin olan yaşlı farelerle yapılabileceği bir yöntem rapor ediyoruz, bu da diğer endişeli veya aktif fare suşlarının da bu protokolle test edilebildiğini düşündürüyor. UBP toplanan veriler noninvaziv ve birden fazla zaman noktaları üzerinde test için izin verir, hangi yaşlanma ile ilgili çalışmalar için yararlıdır, ilaç tedavisi, ve hastalığın ilerlemesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Angela Le, Sarah Ruby ve Marisa Mickey'e hayvan kolonilerini koruma çalışmaları için teşekkür etmek isterler. Bu çalışma 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (CNR'yi desteklemek için L.R.D. ve McDevitt Lisans Araştırma Bursu( BEE) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
- DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
- Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
- Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
- van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
- Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
- Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , Bethesda, MD. (2018).
- Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
- Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
- Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
- Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
- Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
- Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
- Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
- Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
- Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10 (2018).
