Summary
Uhemmet barometrisk plethysmography brukes til å kvantifisere pustemønsteret i våkne mus. Vi viser at 15 s segmenter under en standardisert protokoll viser lignende verdier som en lengre varighet av stille pusting. Denne metodikken gjør det også mulig å kvantifisere apné og forsterkede åndedrag i løpet av den første timen i kammeret.
Abstract
Uhemmet barometrisk plethysmography (UBP) er en metode for å kvantifisere pustemønsteret hos mus, hvor pustefrekvens, tidevannsvolum og minuttventilasjon rapporteres rutinemessig. Videre kan informasjon samles inn om nevrale utgang av pusting, inkludert eksistensen av sentrale apnéer og forsterkede åndedrag. En viktig vurdering for UBP er å oppnå et pustesegment med en minimal innvirkning av engstelig eller aktiv atferd, for å belyse responsen på pusteutfordringer. Her presenterer vi en protokoll som gjør det mulig for korte, stille grunnlinjer å få i eldre mus, sammenlignbarmed å vente på lengre anfall av stille pusting. Bruken av kortere tidssegmenter er verdifull, da noen stammer av mus kan bli stadig mer spennende eller engstelig, og lengre perioder med stille pust kan ikke oppnås innen rimelig tidsramme. Vi plasserte 22 måneder gamle mus i et UBP-kammer og sammenlignet fire 15 s stille pustesegmenter mellom minutter 60-120 til en lengre 10 min stille pusteperiode som tok 2-3 h å skaffe seg. Vi fikk også tellinger av sentrale apnéer og forsterkede åndedrag før de stille pustesegmentene, etter en 30 min kjennskapsperiode. Vi viser at 10 min stille pusting kan sammenlignes med å bruke en mye kortere 15-talls varighet. I tillegg kan tiden som fører opp til disse 15 stille pustesegmentene brukes til å samle inn data om apnéer av sentral opprinnelse. Denne protokollen gjør det mulig for forskere å samle inn mønster-of-breathing data i en bestemt tidsperiode og gjør stille baseline tiltak mulig for mus som kan vise økte mengder excitable atferd. UBP-metoden i seg selv gir en nyttig og ikke-invasiv måte å samle inn pustemønstret data på og gjør det mulig for mus å bli testet over flere tidspunkter.
Introduction
UBP er en vanlig teknikk for vurdering av pustemønstre1,2,3,4. I denne metoden plasseres mus i et lukket kammer hvor trykkforskjeller mellom hovedkammeret (hvor dyret er plassert) og et referansekammer filtreres gjennom en pneumotakolografi for å oppnå verdier. Det resulterende UBP-oppsettet er ikke-invasivt og uhemmet og gjør det mulig å vurdere åndedrettstiltak uten krav om anestesi eller kirurgi. I tillegg er denne teknikken egnet for studier som krever flere målinger i samme mus over tid. Variabler som pustefrekvens, tidevannsvolum og minuttventilasjon kan kvantifiseres med denne metoden, under en enkelt studie eller over flere studier. Hele kroppen UBP gir også tiltak for toppstrømmer og respiratorisk syklus varighet. Sammen kvantifiserer disse parametrene pustemønsteret. De registrerte pustesporene gjør det også mulig å gjennomgå dataene og telle antall sentrale apnéer som vises innen en gitt tidsperiode. Dette tallet kan brukes sammen med en analyse av tidevannsvolum og inspiratoriske tider for å måle andre endringer i pustemønsteret.
Mens flere ikke-invasive plethysmography teknikker eksisterer for direkte vurdering av lungefysiologiske parametere, helkroppenUBP gjør det mulig å screene for respiratorisk funksjon med minimal unødig stress til musen. Head-out plethysmography, som benytter tidevannsmideksitoriske strømningstiltak og er også ikke-invasiv, er avhengig av tilbakeholdenhet, som mange andre typer plethysmography (f.eks dobbeltkammerplethysmography). Mens disse metodene har blitt brukt i gnagermodeller for å måle luftveisrespons5, kan bruk av nakkekrager eller små sikkerhetsrør ta mus (vs. andre arter) lengre tid å akklimatisere seg til og returnere pusten til hvilenivåer.
Å oppnå et optimalt luftpustende segment er en viktig vurdering for sammenligninger ved baseline. Den økte bruken av kommersielt tilgjengelige plethysmography systemer gjør innsamling av mønster-of-breathing data mulig i mange laboratorier. Viktigere er pustemønsteret variabelt gjennom hele innsamlingsperioden, spesielt for mus. Med det sagt er det nødvendig å standardisere baselineanalyse som et middel for å sikre at treningsnivået til eksperimenterere ikke forvirrer resultater. Det er mange måter å samle et luftpustende segment på, og fungerer som et variasjonsområde mellom eksperimentelle design. Et eksempel inkluderer snitt de siste 10-30 min med data etter et tidligere definert sett med tid innenfor kammeret1, mens en annen metode innebærer å vente til musen er synlig rolig for 5-10 min6. Sistnevnte kan ta 2-3 h for å oppnå, og i noen tilfeller kan en rettssak måtte forlates hvis musen ikke er rolig lenge nok. Denne bekymringen er en spesielt viktig vurdering for stammer av mus der observert atferd er mer engstelig og spennende7. Disse musene kan ta lengre tid å tilpasse seg kammermiljøet og bare forbli rolig for korte utbrudd av tid. Begrense tiden viet til baseline samling standardiserer kammeret tid for hver mus.
Det er avgjørende at eksperimenterere får en passende grunnlinje som omfatter hvileatferdverdier i musen, men også forekommer i tide. Derfor er målet med denne rapporten å gi en beskrivelse av metoder som brukes til å oppnå korte stille baselineverdier for pusteparametere hos mus. Videre rapporterer vi at apnéer og forsterkede åndedrag kan kvantifiseres i løpet av den første timen i kammeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av Le Moyne College Institutional Animal Care and Use Committee. All bruk av dyr var i samsvar med retningslinjene som er beskrevet i Veiledningen for omsorg og bruk av laboratoriedyr8.
MERK: (Kritisk) Før eksperimentering, få alle nødvendige godkjenninger og opplæring som kreves for dyrebruk. Det er viktig at eksperimentererne er kjent med musenatferd og aktivitetsnivå, inkludert tegn på søvn, nød og / eller bevegelsesartefakt vs. normal sniffing og pusting.
1. Hele kroppen barometrisk plethysmography kammer
- Les de riktige brukerhåndbøkene for det barometriske plethysmography kammeret, inkludert kontakter, O-ringer, etc., og opprette en standard protokollfil for å definere analysatorer (f.eks metabolske) og parametere som er spesifikke for programvaren.
- Kontroller at alle slanger og rør er koblet til kammeret. Koble et gassstrømningsrør (flow-in) og et vakuumrør (utstrømning) direkte til det barometriske plethysmography kammeret.
MERK: Tilsigmå festes til den markerte innløpsflyten. - Fest CO2,O2og N2 gasstanker til gassmikseren. Sørg for at alle gasstanker er i åpen posisjon før eksperimentering.
2. Kalibrering av det barometriske plethysmograph kammeret
- Kalibrer en høy og lav strøm av gass ved å velge 7700-forsterkeroppsettet under kategorien Maskinvare i den barometriske plethysmography-programvaren.
- Sett et vakuum (strømning ut av kammeret) egnet for eksperimentell design og gassanalysatorer (~ 0,1 L / min).
MERK: Utstrømningshastigheten må forbli den samme gjennom kalibreringene og eksperimentere for nøyaktige metabolske opptak. - Still inn en lav luftstrøm ved å fjerne strømningsrøret fra kammeret og slå av vakuumet.
- Registrer nullstrømmen ved å angi en 0-celle i lavenhet-cellen for det tilsvarende kammeret. Dobbeltklikk low cal-cellen, endre tiden til 3 s, og trykk mål.
- Sett strømningsrøret på nytt og la gass (20,93 % O2, balansert N2) strømme gjennom det barometriske plethysmographykammeret fra gassmikseren.
- Konverter tilsig fra liter / minutter til milliliter / sekund. Klikk high unit-cellen for det tilsvarende kammeret, og angi verdien i milliliter/sekund. Dobbeltklikk Høy cal, endre tiden til 3 s, og klikk Mål.
- La kategorien oppsett på 7700 forsterker være åpen for å kalibrere metabolske analysatorer til den barometriske plethysmography-programvaren.
3. Metabolsk analysatorkalibrering
- I gassmikserprogrammet setter du gassmikseren til å frigjøre en gassstrøm som inneholder 20,93 % O2 og 79,07 % N2.
- På metabolske analysatorer, sett O2 kalibreringsnivået til 20,93% og CO2 for å lese 0%. Vri hjulet tilbake til Eksempel når de riktige verdiene er angitt.
- Angi den2 høye O 2-prosenten. Klikk på ABCD-4 kategorien i barometrisk plethysmography programvare og skriv deretter inn 20.93 under Høy enhet av C2-linjen. Under Høy Cal, endre tiden til 3 s og trykk Mål.
- Angi lav2 CO 2-prosent. Skriv inn 0 under Lav Cal på C3-linjen, og endre deretter tiden til 3 s og klikk mål under Lav Cal.
- I gassmikserprogrammet endrer du O2-verdien til 10 % og CO2-verdien til 5 %. Vent i flere minutter på at gassstrømmen skal tilpasse seg disse verdiene. På metabolske analysatorer, vri justeringsknottene til kalibrere CO2 lik 5%. Pass på at du slår hjulet tilbake til Eksempel når verdiene er kalibrert.
- Angi den2 høye CO 2-prosenten. Sørg for at analysatoravlesningene er stabile før du setter inn passende verdier i O2 og CO2 på barometrisk plethysmography programvare. Klikk Høy enhet under C3, og angi 5. Endre High Cal til 3 s og trykk Mål.
- Angi lav2 O 2-prosent. Klikk Lav enhet under C2-alternativet, og angi 10. Klikk Lav cal, inngang 3 s, og klikk Mål.
- Endre gassverdiene på gassmikseren tilbake til 20,93% O2 og 79,07% N2. Vent flere minutter til kammeret skal tilpasse seg disse verdiene. Gjenta trinnene 3.1\u20123.7 hvis metabolske analysatorer ikke automatisk lese 20.93% O2 og 0% CO2, for å sikre riktig kalibrering. Bekreft rutinemessig riktig kalibrering med sertifiserte gasstanker.
- Kontroller strømningsmålerne som er koblet til det barometriske plethysmography kammeret. Juster luftstrømmen inn og ut av kammeret til priser som passer for eksperimentet (vanligvis 0,1–0,3 l/min).
- Når alle innstillingene er brukt på den barometriske plethysmography-programvaren, klikker du OK for å begynne opptaket.
4. Uhemmet barometrisk plethysmografi
- Registrer musens vekt og innledende kroppstemperatur. Vent 10 minutter før du plasserer musen i kammeret, for å samle Inn O2- og CO2-data fra et tomt kammer. Arbeid i et rolig område kjent for musene, slik at støy og lukter ikke forstyrrer datainnsamlingen. Unngå eventuelle forstyrrelser, inkludert åpning og lukking av dører eller personell som flytter inn/ut av datainnsamlingsrommet.
MERK: Denne spesifikke protokollen ansatt 22 måneder gamle mannlige C57BL/6J mus. - I løpet av den første timen dokumenterer du musens atferd og tar detaljerte notater, inkludert bestemte verdier for flyten inn/ut av kammeret.
- Etter 60 min kammerhabituation, se etter segmenter av stille pust ing for følgende 60 min. Oppgi segmenter som varer minst 15 s i lengde uten å snuse og stelle. Ta kroppstemperaturtiltak hver 10.
- På slutten av eksperimentet, fjern musen fra kammeret og plasser den tilbake i buret. Alt utstyr skal rengjøres og tørkes grundig ned. Hvis dråper med vann forblir, bruk trykkluft for å fjerne dem.
5. Analyse av mønster av pust og metabolisme
- Åpne den barometriske plethysmography gjennomgangfilen og se de innspilte notatene for dyret av interesse.
- Åpne Metabolic panel i programvaren og ta gjennomsnittet av de første 10 min av O2 og CO2, når kammeret var tomt. Registrer disse verdiene som FiO2 og FiCO2.
- Vis Flow-panelet i den barometriske plethysmography-programvaren. Høyreklikk Analyser attributter og angi riktige parametere. Under Meta 1-fanen angir du FiO2 og FiCO2 fra trinn 5.2, samt flyten inn i kammeret under Meta 2, for å beregne VO2 og VCO2.
- For mønster av pusteanalyse, bekreft tidene for 15 sekunder med stille pust ing ved hjelp av notater om dyreatferd samt strømningspanelet sporing. Angi klokkeslettene for 15-talls intervaller med stille pusting under Åpne dataparserdialog fra kategorien Dataanalyse. Parser View Mode
- Klikk Lagre analyserte avledede data. Åpne datafilen i et regneark for å hente de hyllede dataene.
6. Analyse av Apnéer og forsterkede åndedrag
- I den åpne gjennomgangsfilen avslutter du Parser-visningsmodus. Gå inn i alternativet Oppsett av grafer under Oppsett > P3-oppsett, og velg Sidevisning under Type. Velg 5 for antall ruter. Skriv inn -2 i boksen merket Lav og 2 inn i boksen merket Høy for strømningstiltak i milliliter / sekund. Bruk endringene.
- Bla til 30 min-merket på flytsporinger-panelet.
- Tell apnéer og forsterkede åndedrag for 30-60 min etter at musen ble plassert i kammeret. Kvantifiser perioder med suspendert pust som varer lenger enn eller lik 0,5 s, noe som indikerer en apné. Forsterkede åndedrag indikeres av en kraftig økning i pustesporet over 1,25 ml/s etterfulgt av en kraftig reduksjon under -0,75 ml/s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene av UBP som en evaluering av pustemønster hos 16 alderen (22 måneder gamle) mus utført under normal luftgass (20,93% O2 med balansert N2) rapporteres. Analysen inkluderte først en sammenligning av et lengre 10 min stille pustesegment (som tok over 2 timer å oppnå) versus gjennomsnittet av fire korte 15 s segmenter (kvantifisert i løpet av minutter 60-120). En representativ flyt sporing av stille pusting, hvor pusten er konsistent med ingen aktiv pusteatferd, er gitt i figur 1A. Når lignende sporinger samles inn fra dyr, bør 100% av pusten aksepteres av programvaren. Figur 1B representerer imidlertid å puste fra et mer aktivt segment, hvor musene utforsker kammeret, snuser og/eller grooming. Sporinger som ligner på det som vises i figur 1B, er mindre sannsynlig å bli akseptert av programvaren og er ikke ideelle for den type pustesamling som brukes og forklares av denne metoden. Parametrene som ble valgt for vurdering av mulige forskjeller mellom de to tidspunktene var pustefrekvens (figur 2A), tidevannsvolum (VT, Figur 2B), minuttventilasjon (VE, figur 2C),tidevannsvolum/inspiratorisk tidsforhold (VT/Ti, figur 2D)og minuttventilasjon/utvist karbondioksidratio (VE/VCO2/g,figur 2E),som alle ble beregnet ved hjelp av barometrisk plethysmografiprogramvare og Drorbaugh og Fenn-ligningen. Verdier rapportert for disse tiltakene er innenfor rekkevidden av det vi tidligere har rapportert for musemodellen6,9. Ingen signifikante forskjeller var belyst mellom grupper; post hoc-korrigeringer for flere sammenligninger av pustefrekvens og VT-data ble redegjort for med Bonferroni (p < 0,025 ble ansett som signifikante). Disse resultatene viser at bruk av en forenklet protokoll ved hjelp av 15 s opprinnelige planer gir lignende resultater som en lengre opprinnelig protokoll.
Videre analyse ble utført med hver av de fire 15 s baseline segmenter for frekvens, VT, VE, VT/Ti, og VE/VCO2/g (Figur 3). Ingen signifikante forskjeller (p > 0,05) mellom noen av tidspunktene ble funnet. Det var heller ingen forskjeller i variasjonen mellom noen av de fire tidssegmentene for ethvert pustemønster. I tillegg testet vi variasjonen i segmentet av 15-s-gruppen kontra 10 min-gruppen og fant ingen signifikante forskjeller ved hjelp av Levenes test når vi sammenligner de gjennomsnittlige gruppedataene.
Antall apnéer og forsterkede åndedrag observert for hvert dyr i løpet av minutter 30-60 av UBP-protokollen presenteres i figur 4. Disse resultatene viser at eldre dyr viser et høyt antall apnéer og tilstedeværelsen av forsterkede åndedrag innen en 30 min span (sporing vist i figur 1C). Dataene indikerer endringer under aldringsprosessen, da disse funnene ble observert hos 22 måneder gamle mus. For å bekrefte interrater pålitelighet for apné og utvidet pusten analyser, Pearson korrelasjon ble beregnet for to forskjellige etterforskere. Det ble funnet en høy grad av enighet mellom raters, som angitt av en verdi på r = 0,99 for apnéer og r = 0,86 for forsterkede åndedrag. I fremtidige studier ville et økt antall apnéer sammenlignet med en kontrollgruppe fortelle om en pustedysfunksjon som stammer fra en nevralkomponent.
Figur 1:Representative flow-sporinger. (A) Flytsporing fra en stille grunnlinje, der musen ikke viser frem noen aktiv atferd som sniffing eller grooming. (B) Flow sporing fra en aktiv pusteperiode som ikke er inkludert i våre analyser, hvor mus beveger seg om kammeret og mange åndedrag er ikke rutinemessig akseptert. (C) Flow sporing viser et forsterket pust etterfulgt av en periode med apné. Et 5-talls vindu vises for alle spor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Pusteparametre er like for rolige pustesegmenter på 10 min og 15 s i 22 måneder gamle mus. Barometrisk plethysmography ble brukt til å samle inn pustedata hos eldre mus (n = 16, 22 måneder gammel). Pustedata ble beregnet for mus under to forskjellige tidspunkter, nemlig gjennomsnittet av fire 15 s rolige intervaller innenfor 60-120 min-merket av musen som er i kammeret og i 10 min med konsekvent rolig pusting. (A) Pustefrekvens (pust/minutt). (B) Tidevannsvolum (VT; milliliter/pust). (C) Minuttventilasjon (VE; milliliter/minutt). (D) Forholdet mellom tidevannsvolum til inspirasjonstid (VT/Ti; milliliter/sekund). (E) Forholdet mellom minuttventilasjon og karbondioksid utvist, normalisert til vekt (VE/VCO2/g). Det er ingen statistisk signifikante forskjeller mellom gruppene etter post hoc-korrigeringer (p > 0,025). Verdier for > 3 SD over gjennomsnittet ble ansett som outliers og fjernet fra datasettet. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Sammenligning av fire intervaller på 15 s. Pustedata ble beregnet i rolige pustemus (n = 16, 22 måneder gammel) for fire separate intervaller på 15 s innenfor 60–120 min med kammerplassering. (A) Pustefrekvens (pust/minutt). (B) Tidevannsvolum (VT; milliliter/pust). (C) Minuttventilasjon (VE; milliliter/minutt). (D) Forholdet mellom tidevannsvolum til inspirasjonstid (VT/Ti; milliliter/sekund). (E) Forholdet mellom minuttventilasjon og karbondioksid utvist, normalisert til vekt (VE/VCO2/g). Det er ingen statistisk signifikante forskjeller mellom tidssegmentene (p > 0,05). Outliers er definert som > 3 SD over gjennomsnittet og fjernet. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Apné og forsterket pust teller hos mus. Apnéer (≥0,5 s uten å puste) og forsterkede åndedrag (AB; en kraftig økning i innånding over 1,25 ml/s etterfulgt av en skarp utånding under -0,75 ml/s) ble regnet med alderen mus (n = 16, 22 måneder gammel) mellom 30-60 min. Tellingene ble analysert over 30 min og totalen for den tidsperioden rapporteres. Data presenteres som gjennomsnitt ± SD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Skjematisk av uhemmet barometrisk plethysmography (UBP) oppsett. Det generelle UBP-oppsettet skal være lik det som er beskrevet i figuren. Strømningsmålinger må måles for gassene som kommer inn og ut av kammeret, og gasssammensetningen må være kjent for datatolkning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen gir informasjon om en stille pustegrunnlinje hos mus, samt innsamling av data om sentrale apnéer og forsterkede åndedrag. De representative resultatene viser at en 10 min stille grunnlinje har et lignende pustemønster sammenlignet med et gjennomsnitt på fire 15 s anfall for en kohort av gamle mus. Viktigere, de 15 s bouts er ikke statistisk annerledes, og disse gruppene har heller ikke forskjeller i variasjon fra hverandre ved hjelp av Levenes test. Disse dataene viser at selv en kort kamp er tilstrekkelig for å overvåke stille pusting. Det er imidlertid fullt mulig at analyse av individuell variasjon i en mus på 15 s vs. 10 min kan resultere i forskjellige funn, da 10 min bout kan omfatte minimal sniffing og grooming aktiviteter. Bruk av Levenes test for en sammenligning av individuelle musesegmenter ved baseline gir imidlertid en annen analyse enn den som er beskrevet i denne protokollen. Samlet sett bruker utformingen av denne metodikken 15 s pustesegmenter som kan anskaffes i løpet av minutter 60-120 i kammeret, i motsetning til å måtte vente på at hver mus skal oppnå lengre varighet av stille grunnlinje.
Den kortere varigheten som kreves for baseline gjør det mulig for mer engstelige/ opphissede stammer av mus som skal testes for stille pusting. Bruken av et lengre pustesegment (dvs. 10 eller 2 min) forlenger protokollens varighet, til et punkt hvor en studie kan måtte forlates hvis musene ikke viser et stille pustespor innen 3 timer. Siden mange eksperimentelle design også inneholder respiratoriske utfordringer (dvs. hypoksi), fremhever den utvidede tiden som er tildelt for andre gasser behovet for at innsamlingstiden ved baseline skal standardiseres. Bruken av en enkelt 15 s bout av stille pust bidrar til å lindre bekymringen for å jobbe med mus (og stammer av mus) som kan være spesielt spennende i kammeret. Mens vi arbeidet med barometrisk plethysmography, fant vi at ~ 10% av musene per studie måtte utelukkes på grunn av deres manglende evne til å utføre så lite som 2 min kontinuerlig stille pust ing i kammeret. Implementeringen av tidligere kjente studier var mislykket i å få mus til å roe seg raskere når de ble plassert i kammeret på eksperimenteringsdagen. Men fordi ulike stammer, kjønn og alder av mus kan alle reagere annerledes på kammermiljøet10,11, er det mulig at habituation teknikker kan være nyttig12,13 for noen kohorter. Våre kjente studier besto av å plassere musene i UBP-kammeret i testrommet i 1-2 timer i flere dager før eksperimentering. Selv om vi ikke observerte noen endringer i dyreatferd etter denne prosedyren, har en tidligere studie vist at 24 timer med habituation var nødvendig for å eliminere nyhetseffekter som resulterer i spontan fysisk aktivitet hos mus12. I tillegg fant Kabir et al. at plassering av plastsylindere som ligner på det barometriske plethysmography kammeret i hjemmeburet var en fordel i å få rotter til å gjøre seg kjent med oppsettene før eksperimentering13.
Denne protokollen avdekker også mulig respiratorisk dysfunksjon hos mus via kvantifisering av sentrale apnéer, som indikerer nevrale kontrollproblemer. Tretti minutter med observasjon før baseline mønster-of-breathing samling viste at alle 16 alderen mus viste et høyt antall apneic episoder og forsterkede åndedrag (representert i figur 1C). De mange apnéene i denne gamle musekohorten fremhever evnen til denne protokollen til å kvantifisere et annet viktig pustetiltak uten å legge til ekstra tid til eksperimentering. Det bør bemerkes at alder og sykdomsprogresjon (hvis aktuelt) kan påvirke tilstedeværelsen og antall apneiske episoder.
For å karakterisere stille pusting, er det viktig å kontinuerlig observere det barometriske plethysmography kammeret og musen gjennom hele protokollens varighet. For kvantifisering av stille pusting, bør mus være våken, men ikke ta del i noen aktiv atferd som sniffing, grooming, eller utforske (representert i figur 1A). Siden pustemønstre under søvn kan avvike fra de i et våkent dyr14,15, er samlingen av rolig pust under våken tilstand kritisk. Det er mulig at lengre segmenter av stille pust ing kan inkludere perioder med søvn, som kanskje ikke er ønsket avhengig av eksperimentell design. I dette tilfellet vil kortere segmenter av stille pust være ideelle for å dokumentere, da sannsynligheten for datainnsamling under søvn reduseres når aktive segmenter flankerer de korte (15 s) stille pustesegmentene. Vi har observert at lengre segmenter av stille pust ing kan være utfordrende å skaffe seg i musemodellen, da museatferd i kammeret synes å være svært forskjellig i forhold til rotter. Det er viktig både å kritisk observere musen åndedrettsstrøm for passende pustesegmenter og for å dokumentere dyratferd. I tilfeller av redusert ventilasjon eller ustabil pusting, kan denne metoden fortsatt benyttes. I slike tilfeller er det viktig at eksperimentereren blindes til kohorten når du velger 15 s-segmentene. Programmet bør skille pusten, med en akseptrate på 100% i løpet av 15 s perioden. Vi anbefaler å merke seg pustesporingene i tillegg til å sikre at dyrene oppfyller atferdskriteriene for baseline, siden det er mulig at stasjonære mus fortsatt kan være engstelige. En tidligere studie rapporterte at selv om rotter viste rolig oppførsel, viste de fortsatt endrede pustemønstre (dvs. økt frekvens) som svar på kontrollerte stimuli i testrommet13.
Måler ei frekvens, VT, VE, inspiratorisk og ekspiratorisk tid, og VE/VCO2 kvantifiseres ved hjelp av analysatorer og UBP-programvaren og rapporteres ofte i litteraturen. Spesielt VT og VE beregninger bruker Drorbaugh og Fenn ligningen16, som krever kjente verdier for kroppstemperatur, omgivelseskammertemperatur, fuktighet og barometrisk trykk. Det anbefales å samle disse tiltakene gjennom hele eksperimentet for de mest nøyaktige VT- og VE-verdiene. Andre variabler som beregnes av systemet bør brukes med forsiktighet. UBP er ikke et direkte mål på lungemekanikk; dermed bør variabler relatert til luftveismotstand (f.eks. forbedret pause [Penh]) tolkes med denne advarselen i tankene5. Ytterligere komponenter i UBP-oppsettet som kan påvirke variabler som beregnes av programvaren, inkluderer strømningshastigheter og den generelle kalibreringen av systemet. Bekreft at tetninger og pakninger fungerer som de skal (ingen lekkasjer) og sørg for riktig tilkobling av alt utstyr til det barometriske plethysmography kammeret (Figur 5). Strømningshastighetene inn og ut av kammeret bør holdes konsekvente. Nødvendige strømningshastigheter kan variere mellom UBP-oppsett, så det er viktig å kontrollere disse verdiene før eksperimentering. Strømningshastigheten inn i kammeret bør være nok til å gi frisk luft eller gass utfordringer i tide. Strømningshastigheten bør også være tilstrekkelig for å tillate metabolske analysatorer å måle O2 og CO2 uten å ha CO2 bygge opp i kammermiljøet, noe som utgjør risikoen for et skiftende pustemønster. På samme måte må kalibreringer for gassmikser/analysator implementeres regelmessig for å sikre at metabolske parametere måles nøyaktig.
Andre hensyn til bevisst UBP inkluderer å redusere distraksjoner i det eksperimentelle rommet mens dyr blir testet. Høye lyder, forskjellige lukter og tilstedeværelsen av ikke-essensiell personell i rommet kan alle legge til engstelig atferd utstilt av mus. Ved hjelp av mindre rom som testområder kan hjelpe, men hvis dette ikke er mulig, kan pappvegger (med et lite visningsvindu) settes opp rundt kammeret for å redusere distraksjoner for musene. Elektrisk aktivitet i rommet bør holdes på et minimum for å forhindre ekstra støy innenfor barometriskplethysmography sporinger. Derfor er det viktig å notere seg strømningssporingene i løpet av 10 min perioden når programvaren samler inn data fra et tomt kammer. Disse sporingene skal forbli flate, og eventuelle avbrudd eller små bølger er tegn på støy og bør tas opp. Trykkendringer fra åpne og lukke dører eller fra HVAC-funksjon kan også legge til feilaktige svingninger, og å sikre at disse handlingene skjer minimalt (og merke dem når de oppstår) er kritisk. Fuktighet kan også påvirke beregnet tidevannsvolum og minuttventilasjon, noe som gjør det svært viktig å bekrefte at kammeret og tilkoblingsrørene tørkes før bruk. Om nødvendig kan bruk av Drierite perler i rekkefølge med innstrømningsrørene bidra til å fjerne all kondens i luften før kammerinngangen. Dette trinnet vil bli innført i tilfeller der fuktigheten rutinemessig har vært høyere enn nivåer som er oppført i Veiledningen for omsorg og bruk av dyr8 (30%-70%, ideelt innenfor 10% av setpoint). Fuktighet kan også bygge seg opp i kammeret på grunn av dyrets tilstedeværelse. Selv om noe fuktighet er normalt, kan det fortsette å bygge hvis dyret er for aktivt eller plassert i kammeret i lengre varighet. Hvis fuktighetsnivået når maksimale nivåer (99,99 %), kan det hende at kammeret må åpnes og tørkes ned under eksperimentering for å opprettholde sammenlignbare pustetiltak. Programvaren står for endringer i barometrisk trykk, omgivelsestemperatur, dyretemperatur og fuktighet. Beste praksis er å opprettholde verdiene innenfor et rimelig område, slik at "epler til epler" blir sammenlignet på tvers av aldre, stammer og kjønn. Videre er circadian syklus av mus og tidsintervallet for testing, samt spesifikke lysforhold i rommet, viktige detaljer å vurdere13,17. For eksempel tester vi vanligvis mus i belysning som ligner på deres stue (enten lys eller mørk syklus) og innenfor en 3 t rekkevidde18. Eksperimentere bør også forbli blindet for dyregruppene under datainnsamling og analyser for å forhindre forskjeller i valg av en grunnlinje. Når det er mulig, bør den samme eksperimentereren samle inn alle data og/eller analysere alle sporinger i et gitt eksperiment. Tiltak for å holde eksperimenterere blindet til dyregruppene, samt randomisering og testing i lignende tider på dagen, er avgjørende for etterforskningsforkjenningen. Til syvende og sist er det fremmede faktorer som kan endre strømningssporingene, og disse bekymringene bør vurderes når du utfører UBP.
UBP-metoden er en teknikk som brukes til å karakterisere pustemønsteret hos mus. Baseline tiltak kan samles innen 2 timer ved bruk av et 15 s pustesegment. Her rapporterer vi en metode som kan utføres med eldre mus, som ofte er mer opphisset i kammeret enn yngre mus, noe som tyder på at andre engstelige eller aktive musestammer også kan testes med denne protokollen. Dataene som samles inn fra UBP er ikke-invasiv og tillater testing over flere tidspunkter, noe som er nyttig for studier om aldring, medisinering og sykdomsprogresjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Angela Le, Sarah Ruby og Marisa Mickey for deres arbeid med å opprettholde dyrekoloniene. Dette arbeidet ble finansiert av 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. for å støtte CNR), og McDevitt Undergraduate Research Fellowship in Natural Sciences (BEE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
- DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
- Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
- Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
- van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
- Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
- Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , Bethesda, MD. (2018).
- Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
- Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
- Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
- Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
- Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
- Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
- Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
- Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
- Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10 (2018).
