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Behavior

Methode, um Muster der Atmung in seneszierenden Mäusen durch hemmungslose Barometrische Plethysmographie zu erhalten

Published: April 28, 2020 doi: 10.3791/59393
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, Le Moyne College, 2Department of Mathematics, Statistics and Computer Science, Le Moyne College

Summary

Hemmungslose Barometrische Plethysmographie wird verwendet, um das Muster der Atmung bei wachen Mäusen zu quantifizieren. Wir zeigen, dass 15 s Segmente unter einem standardisierten Protokoll ähnliche Werte wie eine längere Dauer der leisen Atmung anzeigen. Diese Methode ermöglicht auch die Quantifizierung von Apnoe und Augmented Atem während der ersten Stunde in der Kammer.

Abstract

Die hemmungslose Barometrische Plethysmographie (UBP) ist eine Methode zur Quantifizierung des Atmungsmusters bei Mäusen, bei der Atemfrequenz, Gezeitenvolumen und Minutenbeatmung routinemäßig berichtet werden. Darüber hinaus können Informationen über die neuronale Leistung der Atmung gesammelt werden, einschließlich der Existenz von zentralen Apnoen und augmented Atem. Eine wichtige Überlegung für UBP ist es, ein Atmungssegment mit minimalen Auswirkungen von ängstlichen oder aktiven Verhaltensweisen zu erhalten, um die Reaktion auf Atemprobleme aufzuklären. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das kurze, leise Grundlinien bei gealterten Mäusen ermöglicht, vergleichbar mit dem Warten auf längere Anfälle von stiller Atmung. Die Verwendung kürzerer Zeitabschnitte ist wertvoll, da einige Mäusestämme zunehmend erregbar oder ängstlich sein können und längere Perioden der stillen Atmung nicht innerhalb eines angemessenen Zeitrahmens erreicht werden können. Wir platzierten 22 Monate alte Mäuse in einer UBP-Kammer und verglichen vier 15 s ruhige Atmungssegmente zwischen den Minuten 60–120 mit einer längeren 10 min leisen Atmungsphase, die 2–3 h dauerte. Wir erhielten auch Zählungen von zentralen Apnoen und augmentierten Atemzügen vor den ruhigen Atmungssegmenten, nach einer 30 min Eingewöhnungszeit. Wir zeigen, dass 10 min leise Atmung mit einer viel kürzeren 15 s Dauer vergleichbar ist. Darüber hinaus kann die Zeit bis zu diesen 15 s ruhigen Atmungssegmenten verwendet werden, um Daten über Apnoen zentralen Ursprungs zu sammeln. Dieses Protokoll ermöglicht es den Forschern, Muster-Atmungsdaten in einer festgelegten Zeit zu sammeln und macht ruhige Basismaßnahmen für Mäuse möglich, die erhöhte Mengen an erregbarem Verhalten aufweisen können. Die UBP-Methodik selbst bietet eine nützliche und nichtinvasive Möglichkeit, Atmungsmusterdaten zu sammeln, und ermöglicht es Mäusen, über mehrere Zeiträume hinweg getestet zu werden.

Introduction

UBP ist eine gängige Technik zur Beurteilung von Atemmustern1,2,3,4. Bei dieser Methode werden Mäuse in einer geschlossenen Kammer platziert, in der Druckunterschiede zwischen der Hauptkammer (wo das Tier untergebracht ist) und einer Referenzkammer durch einen Pneumochographen gefiltert werden, um Werte zu erhalten. Die daraus resultierende UBP-Einrichtung ist nicht invasiv und hemmungslos und ermöglicht die Bewertung von Atemwegsmaßnahmen ohne Anästhesie oder Operation. Darüber hinaus eignet sich diese Technik für Studien, die im Laufe der Zeit mehrere Messungen in derselben Maus erfordern. Variablen wie Atemfrequenz, Gezeitenvolumen und Minutenbelüftung können mit dieser Methode, während einer einzigen Studie oder über mehrere Versuche quantifiziert werden. Ganzkörper-UBP bietet auch Messungen der Spitzenströme und der Atemzyklusdauer. Zusammen quantifizieren diese Parameter das Atmungsmuster. Die aufgezeichneten Atemspuren ermöglichen es auch, die Daten zu überprüfen und die Anzahl der zentralen Apnoen zu zählen, die innerhalb eines bestimmten Zeitraums angezeigt werden. Diese Anzahl kann zusammen mit einer Analyse des Gezeitenvolumens und der inspiratorischen Zeiten verwendet werden, um andere Veränderungen im Atmungsmuster zu messen.

Während es mehrere nichtinvasive Plethysmographie-Techniken für die direkte Beurteilung der pulmonalen physiologischen Parameter gibt, ermöglicht ganzkörperliches UBP eine Möglichkeit, die Atemfunktion mit minimalem Unmut für die Maus abzuschirmen. Die Kopf-out-Plethysmographie, die Gezeitenmittelexipirationsfließmaßnahmen nutzt und auch nicht invasiv ist, beruht auf Zurückhaltung, wie viele andere Arten der Plethysmographie (z. B. Doppelkammerplethysmographie). Während diese Methoden in Nagetiermodellen verwendet wurden, um die Reaktionsfähigkeit der Atemwege zu messen5, kann die Verwendung von Halshalsbändern oder kleinen Rückhalterohren Mäusen (im Vergleich zu anderen Arten) länger zeitnehmen, um sich an ihre Atmung zu gewöhnen und ihre Atmung wieder auf Ruheniveau zu bringen.

Die Erlangung eines optimalen Luftatmungssegments ist eine wichtige Überlegung für Basisvergleiche. Der verstärkte Einsatz kommerziell erhältlicher Plethysmographiesysteme ermöglicht das Sammeln von Atmungsmusterdaten in vielen Laboratorien. Wichtig ist, dass das Atmungsmuster während des gesamten Sammelzeitraums variabel ist, insbesondere für Mäuse. Dabei ist es notwendig, die Basisanalyse zu standardisieren, um sicherzustellen, dass das Ausbildungsniveau der Experimentatoren die Ergebnisse nicht verwirrt. Es gibt zahlreiche Möglichkeiten, ein luftatmendes Segment zu sammeln, das als ein Bereich der Variation zwischen experimentellen Designs dient. Ein Beispiel ist die Mittelung der letzten 10–30 min Daten nach einem zuvor definierten Satz von Zeit innerhalb der Kammer1, während eine andere Methode beinhaltet zu warten, bis die Maus für 5–10 min6sichtbar ruhig ist. Letzteres kann 2-3 h dauern, um zu erreichen, und in einigen Fällen muss eine Prüfung möglicherweise abgebrochen werden, wenn die Maus nicht lange genug ruhig ist. Diese Sorge ist eine besonders wichtige Überlegung für Stämme von Mäusen, wo beobachtete Verhaltensweisen ängstlicher und erregbarer sind7. Diese Mäuse können länger brauchen, um sich an die Kammerumgebung anzupassen und nur für kurze Zeitausbrüche ruhig zu bleiben. Durch die Begrenzung der Zeit für die Baseline-Sammlung wird die Kammerzeit für jede Maus standardisiert.

Es ist entscheidend, dass Die Experimentatoren eine geeignete Ausgangsbasis erhalten, die Ruheverhaltenswerte in der Maus umfasst, aber auch zeitnah auftritt. Daher besteht das Ziel dieses Berichts darin, eine Beschreibung der Methoden zu liefern, die verwendet werden, um kurze stille Ausgangswerte für Atemparameter bei Mäusen zu erhalten. Darüber hinaus berichten wir, dass Apnoen und augmentierte Atemzüge während der ersten Stunde in der Kammer quantifiziert werden können.

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Protocol

Alle Verfahren wurden vom Le Moyne College Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Jede Verwendung von Tieren stimmte mit den im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren beschriebenen Richtlinienüberein 8.

HINWEIS: (Kritisch) Vor dem Experimentieren alle erforderlichen Genehmigungen und Schulungen für den Einsatz von Tieren einholen. Es ist wichtig, dass die Experimentatoren mit dem Verhalten und den Aktivitätsstufen der Maus vertraut gemacht werden, einschließlich Anzeichen von Schlaf, Not und/oder Bewegungsartefakt im Vergleich zu normalem Schnüffeln und Atmen.

1. Ganzkörper-Kammer der Barometrischen Plethysmographie

  1. Lesen Sie die entsprechenden Bedienungsanleitungen für die barometrische Plethysmographiekammer, einschließlich Steckverbinder, O-Ringe usw., und erstellen Sie eine Standardprotokolldatei, um Analysatoren (z. B. metabolische) und softwarespezifische Parameter zu definieren.
  2. Stellen Sie sicher, dass alle Schläuche und Rohre mit der Kammer verbunden sind. Verbinden Sie ein Gasdurchflussrohr (Flow-In) und ein Vakuumrohr (Flow-Out) direkt mit der barometrischen Plethysmographiekammer.
    HINWEIS: Der Zufluss muss an den öffnungsmarkierten Bias-Flowangehängt werden.
  3. Befestigen Sie die Gastanks CO2, O2und N2 an den Gasmischer. Stellen Sie sicher, dass sich alle Gastanks vor dem Experimentieren in der offenen Position befinden.

2. Kalibrierung der Barometrischen Plethysmographenkammer

  1. Kalibrieren Sie einen hohen und einen niedrigen Gasstrom, indem Sie das 7700-Verstärker-Setup unter der Registerkarte Hardware der barometrischen Plethysmographie-Software auswählen.
  2. Stellen Sie ein Vakuum (Ausfluss aus der Kammer) auf, das für die experimentelle Konstruktion und die Gasanalysatoren geeignet ist (0,1 L/min).
    HINWEIS: Die Abflussrate muss während der Kalibrierungen gleich bleiben und auf genaue metabolische Aufnahmen experimentieren.
  3. Stellen Sie einen niedrigen Luftstrom ein, indem Sie das Durchflussrohr aus der Kammer entfernen und das Vakuum ausschalten.
  4. Zeichnen Sie den Nullstrom auf, indem Sie eine 0 in die Zelle "Niedrige Einheit" für die entsprechende Kammer eingeben. Doppelklicken Sie auf die Zelle Low Cal, ändern Sie die Zeit auf 3 s, und klicken Sie auf Messen.
  5. Schließen Sie das Durchflussrohr wieder an und lassen Sie Gas (20,93%O2, symmetrisch N2) durch die barometrische Plethysmographiekammer aus dem Gasmischer fließen.
  6. Konvertieren Sie den Zufluss von Litern/Minuten in Milliliter/Sekunde. Klicken Sie auf die Zelle "Hohe Einheit" für die entsprechende Kammer, und geben Sie den Wert in Milliliter/Sekunde ein. Doppelklicken Sie auf High Cal, ändern Sie die Zeit auf 3 s, und klicken Sie auf Messen.
  7. Lassen Sie die Registerkarte 7700-Amplifier Setup geöffnet, um die metabolischen Analysatoren auf die barometrische Plethysmographie-Software zu kalibrieren.

3. Metabolische Analyzer-Kalibrierung

  1. Stellen Sie im Gasmischerprogramm den Gasmischer so ein, dass er einen Gasstrom mit 20,93 %O2 und 79,07 % N2freisetzt.
  2. Setzen Sie bei den metabolischen Analysatoren denO2-Kalibrierwert auf 20,93 % und den CO2 auf 0 %. Drehen Sie das Zifferblatt zurück in Sample, sobald die entsprechenden Werte eingegeben wurden.
  3. Legen Sie den hohen O2-Prozentsatz fest. Klicken Sie auf die ABCD-4-Registerkarte der barometrischen Plethysmographie-Software und geben Sie dann 20.93 unter High Unit der C2-Linie ein. Ändern Sie unter High Caldie Zeit auf 3 s und drücken Sie Measure.
  4. Stellen Sie den niedrigen CO2-Prozentsatz ein. Geben Sie 0 unter Low Cal der C3-Linie ein, und ändern Sie dann die Zeit auf 3 s, und klicken Sie unter Low Calauf Messen .
  5. Ändern Sie im Gasmischerprogramm denO2-Wert auf 10 % und denCO2-Wert auf 5 %. Warten Sie einige Minuten, bis sich der Gasstrom an diese Werte anpasst. Drehen Sie bei den metabolischen Analysatoren die Einstellknöpfe, um CO2 gleich 5 % zu kalibrieren. Stellen Sie sicher, dass Sie das Zifferblatt nach der Kalibrierung der Werte wieder auf Beispiel zurückdrehen.
  6. Stellen Sie den hohen CO2-Prozentsatz ein. Stellen Sie sicher, dass die Messwerte des Analysators stabil sind, bevor Sie entsprechende Werte in dieO2- undCO2-Werte der Barometrischen Plethysmographie-Software einfügen. Klicken Sie auf Hohe Einheit unter C3 und geben Sie 5ein. Ändern Sie High Cal auf 3 s und drücken Sie Measure.
  7. Legen Sie den niedrigen O2-Prozentsatz fest. Klicken Sie unter der Option C2 auf "Niedrige Einheit" und geben Sie 10ein. Klicken Sie auf Low Cal, geben Sie 3 s ein, und klicken Sie auf Messen.
  8. Ändern Sie die Gaswerte am Gasmischer wieder auf 20,93% O2 und 79,07% N2. Warten Sie einige Minuten, bis sich die Kammer an diese Werte anpasst. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-u20123.7, wenn die metabolischen Analysatoren nicht automatisch 20,93 % O2 und 0 % CO2lesen, um eine ordnungsgemäße Kalibrierung zu gewährleisten. Bestätigen Sie routinemäßig die ordnungsgemäße Kalibrierung mit zertifizierten Gastanks.
  9. Überprüfen Sie die Mitflussmesser, die mit der barometrischen Plethysmographiekammer verbunden sind. Stellen Sie den Luftstrom in und aus der Kammer auf die für das Experiment geeigneten Raten ein (in der Regel 0,1–0,3 L/min).
  10. Sobald alle Einstellungen auf die barometrische Plethysmographie-Software angewendet wurden, klicken Sie auf OK, um mit der Aufnahme zu beginnen.

4. Hemmungslose Barometrische Plethysmographie

  1. Zeichnen Sie das Gewicht der Maus und die anfängliche Körpertemperatur auf. Warten Sie 10 min, bevor Sie die Maus in die Kammer legen, um O2- undCO2-Daten aus einer leeren Kammer zu sammeln. Arbeiten Sie in einem ruhigen Bereich, der den Mäusen vertraut ist, so dass Lärm und Gerüche die Datenerfassung nicht stören. Vermeiden Sie mögliche Störungen, einschließlich des Öffnens und Schließens von Türen oder des Ein- oder Auszugs von Personal aus dem Datenerfassungsraum.
    HINWEIS: Dieses spezifische Protokoll beschäftigte 22 Monate alte männliche C57BL/6J Maus.
  2. Dokumentieren Sie in der ersten Stunde das Verhalten der Maus und machen Sie detaillierte Notizen, einschließlich spezifischer Werte des Ein-/Ausflusses aus der Kammer.
  3. Nach 60 min Kammerbehausung, achten Sie auf Segmente der ruhigen Atmung für die folgenden 60 min. Listen Sie alle Segmente mit einer Länge von mindestens 15 s ohne Schnüffeln und Pflegenauf. Nehmen Sie Körpertemperaturmessungen alle 10 min, wenn Sie ein implantierbares Gerät verwenden.
  4. Entfernen Sie am Ende des Experiments die Maus aus der Kammer und legen Sie sie wieder in ihren Käfig. Alle Geräte sollten gründlich gereinigt und abgewischt werden. Wenn Wassertröpfchen übrig bleiben, verwenden Sie Druckluft, um sie zu entfernen.

5. Analyse des Musters der Atmung und des Stoffwechsels

  1. Öffnen Sie die Barometrische Plethysmographie-Überprüfungsdatei und konsultieren Sie die aufgezeichneten Notizen für das Tier von Interesse.
  2. Öffnen Sie das Metabolic Panel in der Software und nehmen Sie den Durchschnitt der ersten 10 min von O2 und CO2, wenn die Kammer leer war. Zeichnen Sie diese Werte als FiO2 und FiCO2auf.
  3. Sehen Sie sich das Flow-Bedienfeld der barometrischen Plethysmographie-Software an. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf Attribute analysieren, und legen Sie die entsprechenden Parameter fest. Geben Sie unter der Registerkarte Meta 1 die FiO2 und FiCO2 ab Schritt 5.2 sowie den Durchfluss in die Kammer unter Meta 2ein, um VO2 und VCO2zu berechnen.
  4. Für Muster der Atemanalyse, bestätigen Sie die Zeiten für die 15 Sekunden der stillen Atmung mit Notizen über das Verhalten des Tieres sowie die Ablauftafel Tracing. Geben Sie die Zeiten für die 15 s Intervalle der leisen Atmung unter Open Data Parser Dialogue auf der Registerkarte Data Parser ein. Klicken Sie auf Parser-Ansichtsmodus, um nur die spezifischen 15 s Segmente anzuzeigen, die von Interesse sind.
  5. Klicken Sie auf Analysierte abgeleitete Daten speichern. Öffnen Sie die Datendatei in einer Kalkulationstabelle, um die bindierten Daten zu erhalten.

6. Analyse von Apnoe und Augmented Breaths

  1. Beenden Sie in der Datei "Offene Überprüfung" den Analyseansichtsmodus. Gehen Sie unter Setup > P3-Setup in die Option Graph-Setup und wählen Sie Seitenansicht unter Typaus. Wählen Sie 5 für die Anzahl der Bereiche aus. Geben Sie -2 in die Box mit der Bezeichnung Niedrig und 2 in die Box mit der Bezeichnung Hoch für Durchflussmaße in Milliliter/Sekunde ein. Wenden Sie die Änderungen an.
  2. Scrollen Sie zur 30-min-Markierung im Bedienfeld "Flow-Tracings".
  3. Zählen Sie Apnoen und erhöhte Atemzüge für die 30-60 min, nachdem die Maus in die Kammer gelegt wurde. Quantifizieren Sie Perioden der suspendierten Atmung, die länger als oder gleich 0,5 s dauert, was auf eine Apnoe hindeutet. Erweiterte Atemzüge werden durch einen starken Anstieg der Atemspur über 1,25 ml/s gefolgt von einem starken Rückgang unter -0,75 ml/s angezeigt.

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Representative Results

Die Ergebnisse von UBP als Bewertung des Atmungsmusters bei 16 (22 Monate alten) Mäusen, die unter normalem Luftgas (20,93%O2 mit ausgeglichenem N2) durchgeführt wurden, werden berichtet. Die Analyse beinhaltete zunächst einen Vergleich eines längeren 10 min leisen Atmungssegments (das über 2 h benötigte) mit dem Durchschnitt von vier kurzen 15 s Segmenten (quantifiziert innerhalb von Minuten 60–120). Eine repräsentative Strömungsverfolgung der stillen Atmung, bei der die Atmung ohne aktives Atmungsverhalten im Einklang steht, ist in Abbildung 1Adargestellt. Wenn ähnliche Spuren von Tieren gesammelt werden, sollten 100% der Atemzüge von der Software akzeptiert werden. Abbildung 1B stellt jedoch die Atmung aus einem aktiveren Segment dar, in dem die Mäuse die Kammer erforschen, schnüffeln und/oder pflegen. Rückverfolgungen, die denen in Abbildung 1B ähneln, werden seltener von der Software akzeptiert und sind nicht ideal für die Art der Atemaufnahme, die mit dieser Methode verwendet und erklärt wird. Die parameter für die Beurteilung möglicher Atemmusterunterschiede zwischen den beiden Zeitpunkten waren Atemfrequenz (Abbildung 2A), Gezeitenvolumen (VT, Abbildung 2B), Minutenbelüftung (VE, Abbildung 2C), Gezeitenvolumen/inspiratorisches Zeitverhältnis (VT/Ti, Abbildung 2D) und Minutenbelüftung/ausgestoßenes Kohlendioxidverhältnis (VE/VCO2/g,Abbildung 2E), die alle mit der Barometrischen Plethysmographie-Software und der Drorbaugh- und Fenn-Gleichung berechnet wurden. Die für diese Maßnahmen gemeldeten Werte liegen im Bereich dessen, was wir zuvor für das Mausmodell6,9gemeldet haben. Zwischen den Gruppen wurden keine signifikanten Unterschiede aufgeklärt; Nach-hoc-Korrekturen für mehrfache Vergleiche von Atemfrequenz und VT-Daten wurden mit Bonferroni bilanziert (p < 0,025 wurde als signifikant angesehen). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung eines vereinfachten Protokolls mit 15 s-Baselines ähnliche Ergebnisse wie ein längeres Basisprotokoll liefert.

Weitere Analysen wurden mit jedem der vier 15 s Basissegmente für Frequenz, VT, VE, VT/Ti und VE/VCO2/g durchgeführt (Abbildung 3). Es wurden keine signifikanten Unterschiede(p > 0,05) zwischen einem der Zeitpunkte gefunden. Es gab auch keine Unterschiede in der Variabilität zwischen einem der vier Zeitsegmente für eine Atemmustermessung. Darüber hinaus haben wir die Variabilität des Segments der 15 s Gruppe im Vergleich zur 10-min-Gruppe getestet und beim Vergleich der gemittelten Gruppendaten keine signifikanten Unterschiede beim Levene-Test festgestellt.

Die Anzahl der Apnoen und Augmented Atemzüge, die für jedes Tier in den Minuten 30 bis 60 des UBP-Protokolls beobachtet wurden, sind in Abbildung 4dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass gealterte Tiere eine hohe Anzahl von Apnoen und das Vorhandensein von augmentierten Atemzügen innerhalb einer 30-minuten-Spanne zeigen (Spurverfolgung in Abbildung 1C). Die Daten deuten auf Veränderungen während des Alterungsprozesses hin, da diese Ergebnisse bei 22 Monate alten Mäusen beobachtet wurden. Um die Interrater-Zuverlässigkeit für Apnoe- und Augmented-Atem-Analysen zu bestätigen, wurde die Pearson-Korrelation für zwei verschiedene Forscher berechnet. Es wurde ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen den Ratern festgestellt, wie durch einen Wert von r = 0,99 für Apnoe und r = 0,86 für Augmented Atemzüge angegeben. In zukünftigen Studien würde eine erhöhte Anzahl von Apnoen im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von einer Atemstörung erzählen, die aus einer neuronalen Komponente stammt.

Figure 1
Abbildung 1: Repräsentative Ablaufverfolgungen. (A) Flussablaufverfolgung von einer ruhigen Grundlinie, bei der die Maus keine aktiven Verhaltensweisen wie Sniffing oder Grooming zeigt. (B) Flussverfolgung aus einer aktiven Atemzeit, die nicht in unseren Analysen enthalten ist, wo Mäuse sich um die Kammer bewegen und viele Atemzüge nicht routinemäßig akzeptiert werden. (C) Flussverfolgung mit einem erhöhten Atem, gefolgt von einer Apnoeperiode. Für alle Spuren wird ein 5-s-Fenster angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2:Die Atemparameter sind für ruhige Atemsegmente von 10 min und 15 s bei 22 Monate alten Mäusen ähnlich. Die barometrische Plethysmographie wurde verwendet, um Atemdaten bei gealterten Mäusen zu sammeln (n = 16, 22 Monate alt). Die Atemdaten wurden für Mäuse während zwei verschiedener Zeitpunkte berechnet, nämlich den Durchschnitt von vier 15 s Ruheintervallen innerhalb der 60–120 min-Marke der Maus in der Kammer und für 10 min gleichbleibend ruhige Atmung. (A) Atemfrequenz (Atem/Minute). (B) Gezeitenvolumen (VT; Milliliter/Atem). (C) Minutenbelüftung (VE; Milliliter/Minute). (D) Verhältnis von Gezeitenvolumen zur Inspirationszeit (VT/Ti; Milliliter/Sekunde). (E) Verhältnis von Minutenbelüftung zu ausgestoßenem Kohlendioxid, normalisiert zum Gewicht (VE/VCO2/g). Es gibt keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen nach Post-hoc-Korrekturen(p > 0,025). Werte von >3 SD über dem Mittelwert wurden als Ausreißer betrachtet und aus dem Datensatz entfernt. Die Daten werden als mittelwertige SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3:Vergleich von vier 15-s-Intervallen. Die Atemdaten wurden in ruhigen Atemmäusen(n = 16, 22 Monate alt) für vier separate 15 s Intervalle innerhalb der 60–120 min Kammerplatzierung berechnet. (A) Atemfrequenz (Atem/Minute). (B) Gezeitenvolumen (VT; Milliliter/Atem). (C) Minutenbelüftung (VE; Milliliter/Minute). (D) Verhältnis von Gezeitenvolumen zur Inspirationszeit (VT/Ti; Milliliter/Sekunde). (E) Verhältnis von Minutenbelüftung zu ausgestoßenem Kohlendioxid, normalisiert zum Gewicht (VE/VCO2/g). Es gibt keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitsegmenten (p > 0,05). Ausreißer werden als >3 SD über dem Mittelwert definiert und entfernt. Die Daten werden als mittelwertige SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4:Apnoe und augmentierte Atemzahl bei Mäusen. Apnoe (0,5 s ohne Atmung) und erhöhte Atemzüge (ABs; ein starker Anstieg der Inhalation über 1,25 ml/s, gefolgt von einer scharfen Ausatmung unter -0,75 ml/s) wurden bei gealterten Mäusen(n = 16, 22 Monate alt) zwischen 30 und 60 min gezählt. Die Zählungen wurden über 30 min analysiert und die Summe für diesen Zeitraum wird gemeldet. Die Daten werden als mittelwertige SD dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Schematische Einrichtung der hemmungslosen barometrischen Plethysmographie (UBP). Die gesamte UBP-Einrichtung sollte der in der Abbildung beschriebenen ähnlich sein. Strömungsmessungen müssen für die Gase gemessen werden, die in die Kammer eindringen und sie verlassen, und die Gaszusammensetzung muss für die Dateninterpretation bekannt sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das Protokoll liefert Informationen über eine stille Atmungsbasislinie bei Mäusen sowie das Sammeln von Daten über zentrale Apnoen und erweiterte Atemzüge. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass eine 10 min ruhige Grundlinie ein ähnliches Atmungsmuster aufweist, verglichen mit durchschnittlich vier 15 s Anfällen für eine Kohorte alter Mäuse. Wichtig ist, dass die 15-S-Kämpfe statistisch nicht unterschiedlich sind, noch haben diese Gruppen Unterschiede in der Variation voneinander mit Levenes Test. Diese Daten zeigen, dass auch nur ein kurzer Kampf ausreicht, um die leise Atmung zu überwachen. Es ist jedoch durchaus möglich, dass die Analyse individueller Variationen innerhalb einer Maus bei 15 s vs. 10 min zu unterschiedlichen Befunden führen kann, da der 10-min-Kampf minimale Schnüffel- und Pflegeaktivitäten umfassen könnte. Die Verwendung des Levene-Tests für einen Vergleich einzelner Maus-Baselinesegmente bietet jedoch eine andere Analyse als die in diesem Protokoll beschriebene. Insgesamt verwendet das Design dieser Methode 15 s Atmungssegmente, die in Den minuten 60–120 in der Kammer erfasst werden können, anstatt auf jede Maus warten zu müssen, um längere Daueren der leisen Grundlinie zu erreichen.

Die kürzere Dauer, die für die Baseline erforderlich ist, ermöglicht es, mehr ängstliche/aufgeregte Stämme von Mäusen auf eine ruhige Atmung zu testen. Die Verwendung eines längeren Atmungssegments (d. h. 10 oder 2 min) verlängert die Protokolldauer bis zu einem Punkt, an dem eine Studie abgebrochen werden muss, wenn die Mäuse innerhalb von 3 h keine ruhige Atemspur zeigen. Da viele Versuchsentwürfe auch Atemwegsherausforderungen (d. h. Hypoxie) beinhalten, unterstreicht die für andere Gase vorgesehene längere Zeit die Notwendigkeit, die Basissammelzeit zu standardisieren. Die Verwendung eines einzigen 15 s Anfall s Anfall von stiller Atmung hilft, die Sorge der Arbeit mit Mäusen (und Stämme von Mäusen) zu lindern, die in der Kammer besonders erregbar sein können. Bei der Arbeit mit der barometrischen Plethysmographie stellten wir fest, dass 10 % der Mäuse pro Studie aufgrund ihrer Unfähigkeit, nur 2 min ununterbrochene stille Atmung in der Kammer durchzuführen, ausgeschlossen werden mussten. Die Durchführung früherer Einarbeitungsversuche war erfolglos, um Mäuse dazu zu bringen, sich schneller zu beruhigen, wenn sie am Tag des Experiments in der Kammer platziert wurden. Da jedoch verschiedene Stämme, Geschlechter und Alter von Mäusen alle unterschiedlich auf die Kammerumgebung reagieren können10,11, ist es möglich, dass Gewöhnungstechniken hilfreich sein können12,13 für einige Kohorten. Unsere Einarbeitungsversuche bestanden darin, die Mäuse mehrere Tage vor dem Experimentieren für 1–2 h in der UBP-Kammer im Testraum zu platzieren. Während wir keine Veränderungen im Verhalten der Tiere nach diesem Verfahren beobachteten, hat eine frühere Studie gezeigt, dass 24 h Gewöhnung erforderlich war, um Neuheitseffekte zu beseitigen, die zu spontaner körperlicher Aktivität bei Mäusen12führten. Darüber hinaus fanden Kabir et al. heraus, dass das Platzieren von Kunststoffzylindern ähnlich der Größe der barometrischen Plethysmographiekammer im Hauskäfig vorteilhaft war, um Ratten dazu zu bringen, sich vor dem Experimentieren mit den Setups vertraut zu machen13.

Dieses Protokoll deckt auch mögliche Atemfunktionsstörungen bei Mäusen durch die Quantifizierung der zentralen Apnoe, Hinweis auf neuronale Kontrollprobleme. Dreißig Minuten Beobachtung vor der Basismuster-der-Atmung-Sammlung zeigten, dass alle 16 im Alter von Mäusen alterten Mäuse eine hohe Anzahl von Apnoe-Episoden und augmentierten Atemzügen zeigten (dargestellt in Abbildung 1C). Die zahlreichen Apnoen in dieser gealterten Mauskohorte unterstreichen die Fähigkeit dieses Protokolls, eine weitere wichtige Atemmaßnahme zu quantifizieren, ohne zusätzliche Zeit für Experimente zu benötigen. Es sollte beachtet werden, dass Alter und Krankheitsprogression (falls zutreffend) das Vorhandensein und die Anzahl der apnoischen Episoden beeinflussen können.

Um die leise Atmung zu charakterisieren, ist es wichtig, die barometrische Plethysmographiekammer und Die Maus während der gesamten Dauer des Protokolls kontinuierlich zu beobachten. Für die Quantifizierung der stillen Atmung sollten Mäuse wach sein, aber nicht an aktiven Verhaltensweisen wie Schnüffeln, Pflegen oder Erforschen teilnehmen (dargestellt in Abbildung 1A). Da sich die Atmungsmuster während des Schlafes von denen in einem wachen Tier14,15unterscheiden können, ist die Sammlung der ruhigen Atmung während des Wachzustandes entscheidend. Es ist möglich, dass längere Segmente der stillen Atmung Schlafphasen umfassen können, die je nach experimentellem Design nicht erwünscht sein können. In diesem Fall wären kürzere Segmente der leisen Atmung ideal zu dokumentieren, da die Wahrscheinlichkeit der Datenerfassung während des Schlafes verringert wird, wenn aktive Segmente die kurzen (15 s) leisen Atmungssegmente flankieren. Wir haben beobachtet, dass längere Segmente der leisen Atmung im Mausmodell eine Herausforderung darstellen können, da das Mausverhalten in der Kammer im Vergleich zu Ratten sehr unterschiedlich zu sein scheint. Es ist wichtig, sowohl den Atemfluss der Maus für geeignete Atemsegmente kritisch zu beobachten als auch das Verhalten von Tieren zu dokumentieren. Bei eingeschränkter Beatmung oder instabiler Atmung kann diese Methode weiterhin eingesetzt werden. In diesen Fällen ist es wichtig, dass der Experimentator bei der Auswahl der 15 s-Segmente für die Kohorte geblendet wird. Das Softwareprogramm sollte die Atemzüge mit einer Akzeptanzrate von 100% während der 15 s Periode unterscheiden. Wir empfehlen, die Atemspuren zu beachten und sicherzustellen, dass die Tiere die Verhaltenskriterien für die Ausgangsbasis erfüllen, da es möglich ist, dass stationäre Mäuse noch ängstlich sind. Eine frühere Studie berichtete, dass Ratten zwar ein ruhiges Verhalten zeigten, aber dennoch veränderte Atemmuster (d. h. erhöhte Frequenz) als Reaktion auf kontrollierte Reize im Testraum13zeigten.

Messungen von Frequenz, VT, VE, inspiratorische und expiratorische Zeit und VE/VCO2 werden alle mit Hilfe von Analysatoren und der UBP-Software quantifiziert und häufig in der Literatur berichtet. Insbesondere verwenden VT- und VE-Berechnungen die Drorbaugh- und Fenn-Gleichung16, die bekannte Werte für Körpertemperatur, Umgebungskammertemperatur, Luftfeuchtigkeit und Luftdruck erfordert. Es wird empfohlen, diese Maßnahmen während des gesamten Experiments für die genauesten VT- und VE-Werte zu sammeln. Andere Variablen, die vom System berechnet werden, sollten mit Vorsicht verwendet werden. UBP ist kein direktes Maß für die Lungenmechanik; daher sollten Variablen im Zusammenhang mit dem Atemwegswiderstand (z. B. verbesserte Pause [Penh]) mit diesem Vorbehalt im Hinterkopf interpretiert werden5. Weitere Komponenten des UBP-Setups, die sich auf die von der Software berechneten Variablen auswirken können, sind die Durchflussraten und die allgemeine Kalibrierung des Systems. Bestätigen Sie, dass Dichtungen und Dichtungen ordnungsgemäß funktionieren (keine Leckagen) und stellen Sie sicher, dass alle Geräte ordnungsgemäß mit der barometrischen Plethysmographiekammer verbunden sind (Abbildung 5). Die Durchflussraten in und aus der Kammer sollten konstant gehalten werden. Erforderliche Durchflussraten können zwischen UBP-Setups variieren, daher ist es wichtig, diese Werte vor dem Experimentieren zu überprüfen. Der Durchfluss in die Kammer sollte ausreichen, um rechtzeitig frische Luft- oder Gasherausforderungen zu bewältigen. Die Durchflussmenge sollte auch ausreichen, um den metabolischen Analysatoren zu ermöglichen,O2 und CO2 zu messen, ohne dass sichCO2 in der Kammerumgebung ansammeln muss, was die Gefahr eines sich ändernden Atmungsmusters birgt. Ebenso müssen Gasmischer-/Analysatorkalibrierungen regelmäßig durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die metabolischen Parameter genau gemessen werden.

Andere Überlegungen für bewusstes UBP sind die Verringerung von Ablenkungen innerhalb des Versuchsraums, während Tiere getestet werden. Laute Geräusche, unterschiedliche Gerüche und die Anwesenheit von unwesentlichem Personal im Raum können alle zu ängstlichen Verhaltensweisen von Mäusen hinzufügen. Die Verwendung kleinerer Räume als Testbereiche kann helfen, aber wenn dies nicht möglich ist, können Pappwände (mit einem kleinen Sichtfenster) um die Kammer herum aufgestellt werden, um Ablenkungen für die Mäuse zu lindern. Die elektrische Aktivität im Raum sollte so lange auf ein Minimum beschränkt werden, um zusätzliches Rauschen innerhalb der barometrischen Plethysmographie-Tracings zu vermeiden. Daher ist es wichtig, die Ablaufverfolgungen während der 10-min-Periode zu beachten, wenn die Software Daten aus einer leeren Kammer sammelt. Diese Spuren sollten flach bleiben, und alle Unterbrechungen oder leichten Wellen sind Anzeichen von Lärm und sollten angegangen werden. Druckänderungen durch Öffnen und Schließen von Türen oder von HLK-Funktion können auch zu fehlerhaften Schwankungen beitragen, und sicherzustellen, dass diese Aktionen minimal auftreten (und sie beachten, wenn sie auftreten) ist entscheidend. Feuchtigkeit kann auch das berechnete Gezeitenvolumen und die Minutenbelüftung beeinflussen, so dass es sehr wichtig ist, zu bestätigen, dass die Kammer und die Verbindungsrohre vor Dem Gebrauch getrocknet werden. Bei Bedarf kann die Verwendung von Drierite-Perlen in der Reihenfolge mit den Einflussrohren helfen, alle Kondensation in der Luft vor dem Kammereingang zu entfernen. Dieser Schritt würde in Fällen eingeleitet, in denen die Luftfeuchtigkeit routinemäßig höher war als die im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Tieren8 (30%–70%, idealerweise innerhalb von 10% des Sollwerts) aufgeführten Werte. Feuchtigkeit kann sich auch in der Kammer aufgrund der Anwesenheit des Tieres aufbauen. Obwohl eine gewisse Luftfeuchtigkeit normal ist, kann es weiter bauen, wenn das Tier übermäßig aktiv ist oder für längere Zeit in der Kammer platziert wird. Wenn die Luftfeuchtigkeit den Höchstwert (99,99%) erreicht, muss die Kammer möglicherweise während des Versuchs geöffnet und abgewischt werden, um vergleichbare Atemmaßnahmen aufrechtzuerhalten. Die Software berücksichtigt Änderungen des Luftdrucks, der Umgebungstemperatur, der Tiertemperatur und der Luftfeuchtigkeit. Die beste Praxis besteht darin, die Werte innerhalb eines angemessenen Bereichs beizubehalten, so dass "Äpfel zu Äpfeln" über Alter, Stämme und Geschlechter hinweg verglichen werden. Darüber hinaus sind der zirkadiane Zyklus von Mäusen und der Zeitbereich der Tests, sowie spezifische Lichtverhältnisse des Raumes, wichtige Details zu berücksichtigen13,17. Zum Beispiel testen wir Mäuse in der Regel in Beleuchtung ähnlich ihrem Gehäuseraum (entweder hell oder dunkel) und innerhalb eines 3 h Bereich18. Die Experimentatoren sollten auch während der Datenerhebung und -analysen für die Tiergruppen geblendet bleiben, um Unterschiede bei der Auswahl einer Basislinie zu vermeiden. Wenn möglich, sollte derselbe Experimentator alle Daten sammeln und/oder alle Ablaufverfolgungen in einem bestimmten Experiment analysieren. Schritte, um Die erbzeugende Tiere für die Tiergruppen zu verblenden, sowie Randomisierung und Tests zu ähnlichen Tageszeiten sind entscheidend für die Strenge der Untersuchung. Letztlich gibt es fremde Faktoren, die die Ablaufverfolgungen verändern können, und diese Bedenken sollten bei der Durchführung von UBP berücksichtigt werden.

Die UBP-Methode ist eine Technik, die verwendet wird, um das Muster der Atmung bei Mäusen zu charakterisieren. Basismaße können innerhalb von 2 h gesammelt werden, wenn ein 15 s Atmungssegment verwendet wird. Hier berichten wir über eine Methode, die mit gealterten Mäusen durchgeführt werden kann, die oft mehr in der Kammer aufgeregt sind als jüngere Mäuse, was darauf hindeutet, dass auch andere ängstliche oder aktive Mausstämme mit diesem Protokoll getestet werden könnten. Die von UBP gesammelten Daten sind nichtinvasiv und ermöglichen Tests über mehrere Zeitpunkte hinweg, was für Studien über Alterung, medikamentöse Therapie und Krankheitsprogression nützlich ist.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken Angela Le, Sarah Ruby und Marisa Mickey für ihre Arbeit zur Erhaltung der Tierkolonien. Diese Arbeit wurde von 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. zur Unterstützung von CNR) und dem McDevitt Undergraduate Research Fellowship in Natural Sciences (BEE) finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbon Dioxide Analyzer AEI Technologies CD-3A 
Carbon Dioxide Sensor AEI Technologies  P-61B
Computer must be compliant with Ponemah requirements
Drierite beads PermaPure LLC DM-AR
Flow Control AEI Technologies R-1 vacuum
Flowmeter TSI 4100 need one per chamber and one for vacuum
Gas Mixer MCQ Instruments GB-103
Gas Tanks Haun 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges
Oxygen Analyzer AEI Technologies S-3A
Oxygen Sensor AEI Technologies  N-22M
Polyurethane Tubing SMC TUS 0604 Y-20
Ponemah Software DSI
Small Rodent Chamber Buxco/DSI
Thermometer (LifeChip System) Destron-Fearing any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber 
Transducers Validyne DP45 need one per chamber 
Whole Body Plethysmography System  Data Science International (DSI) Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. 

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References

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Verhalten Ausgabe 158 Apnoe Frequenz Minutenbelüftung Gezeitenvolumen VCO2 Atemnot
Methode, um Muster der Atmung in seneszierenden Mäusen durch hemmungslose Barometrische Plethysmographie zu erhalten
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Receno, C. N., Cunningham, C. M., Eassa, B. E., Purdy, R., DeRuisseau, L. R. Method to Obtain Pattern of Breathing in Senescent Mice through Unrestrained Barometric Plethysmography. J. Vis. Exp. (158), e59393, doi:10.3791/59393 (2020).

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