Summary
Ohämmad barometrisk plethysmografi används för att kvantifiera andningsmönstret hos vakna möss. Vi visar att 15 s segment under ett standardiserat protokoll visar liknande värden som en längre tid av tyst andning. Denna metod möjliggör också kvantifiering av apné och förstärkta andetag under den första timmen i kammaren.
Abstract
Ohämmad barometrisk plethysmography (UBP) är en metod för att kvantifiera mönstret för andning hos möss, där andningsfrekvens, tidvattenvolym och minut ventilation rutinmässigt rapporteras. Dessutom kan information samlas in om den neurala produktionen av andning, inklusive förekomsten av centrala apnéer och förstärkta andetag. En viktig faktor för UBP är att få en andning segment med en minimal inverkan av oroliga eller aktiva beteenden, att belysa svaret på andningsutmaningar. Här presenterar vi ett protokoll som gör det möjligt att erhålla korta, tysta baslinjer hos äldre möss, jämförbart med att vänta på längre anfall av tyst andning. Användningen av kortare tidssegment är värdefullt, eftersom vissa stammar av möss kan bli alltmer retbara eller ängsliga, och längre perioder av tyst andning kanske inte uppnås inom en rimlig tidsram. Vi placerade 22 månader gamla möss i en UBP kammare och jämförde fyra 15 s tyst andning segment mellan minuter 60-120 till en längre 10 min tyst andning period som tog 2-3 h att förvärva. Vi fick också räknas av centrala apnéer och förstärkta andetag före den tysta andning segment, efter en 30 min förtrogenhet period. Vi visar att 10 min tyst andning är jämförbar med att använda en mycket kortare 15 s varaktighet. Dessutom kan tiden fram till dessa 15 s tysta andningssegment användas för att samla in data om apnéer av centralt ursprung. Detta protokoll gör det möjligt för utredare att samla in mönster-of-andning data i en viss tid och gör tyst baslinje åtgärder genomförbara för möss som kan uppvisar ökade mängder retbara beteende. Själva UBP-metoden är ett användbart och icke-invasivt sätt att samla in mönster-of-andning data och gör det möjligt för möss som ska testas över flera tidpunkter.
Introduction
UBP är en vanlig teknik för bedömning av andningsmönster1,,2,,3,4. I denna metod placeras möss i en sluten kammare där tryckskillnader mellan huvudkammaren (där djuret är inrymt) och en referenskammare filtreras genom en pneumotachograf för att erhålla värden. Den resulterande UBP setup är noninvasive och ohämmad och gör det möjligt för luftvägarna åtgärder som skall bedömas utan krav på anestesi eller kirurgi. Dessutom är denna teknik lämplig för studier som kräver flera mätningar i samma mus över tiden. Variabler som andningsfrekvens, tidvattenvolym och minutventilation kan kvantifieras med denna metod, under en enda studie eller över flera försök. Hela kroppen UBP ger också åtgärder för topp flöden och andningscykeln varaktighet. Tillsammans kvantifierar dessa parametrar andningsmönstret. De registrerade andningsspåren gör det också möjligt att granska data och räkna antalet centrala apnéer som visas inom en viss tidsperiod. Detta antal kan användas tillsammans med en analys av tidvattenvolym och inandningstider för att mäta andra förändringar i andningsmönstret.
Medan flera noninvasive plethysmography tekniker finns för direkt bedömning av pulmonell fysiologiska parametrar, hela kroppen UBP möjliggör ett sätt att skärmen för andningsfunktion med minimal onödig stress till musen. Head-out plethysmography, som använder tidvatten midexpiratory flöde åtgärder och är också noninvasive, förlitar sig på återhållsamhet, liksom många andra typer av plethysmography (t.ex. dubbel-kammare plethysmography). Även om dessa metoder har använts i gnagare modeller för att mäta luftvägarna lyhördhet5,användning av hals kragar eller små fasthållningsanordningar kan ta möss (jämfört med andra arter) längre tid att acklimatisera sig till och återgå sin andning till vilonivåer.
Att få ett optimalt luftandningssegment är en viktig faktor för jämförelser vid baslinjen. Den ökade användningen av kommersiellt tillgängliga plethysmography system gör samla mönster-of-andning data möjligt i många laboratorier. Viktigt är att andningsmönstret varierar under hela insamlingsperioden, särskilt för möss. Med det sagt är det nödvändigt att standardisera baslinjeanalys som ett sätt att se till att utbildningsnivå av försökskarperger inte förvirrar resultaten. Det finns många sätt att samla in en luft-andning segment, som fungerar som ett område av variation mellan experimentell design. Ett exempel är i genomsnitt den slutliga 10-30 min data efter en tidigare definierad uppsättning tid inom kammaren1, medan en annan metod innebär att vänta tills musen är synligt lugn i 5-10 min6. Den senare kan ta 2–3 h att uppnå och i vissa fall kan en rättegång behöva överges om musen inte är lugn tillräckligt länge. Denna oro är en särskilt viktig faktor för stammar av möss där observerade beteenden är mer oroliga och retbara7. Dessa möss kan ta längre tid att anpassa sig till kammaren miljön och bara behålla lugnet för korta skurar av tid. Om du begränsar den tid som ägnas åt baslinjesamling standardiseras kammartiden för varje mus.
Det är viktigt att försökslösa får en lämplig baslinje som omfattar vilande beteendevärden i musen men också sker i tid. Därför är målet med denna rapport att ge en beskrivning av metoder som används för att få korta tysta baslinjevärden för andningsparametrar hos möss. Dessutom rapporterar vi att apnéer och förstärkta andetag kan kvantifieras under den första timmen i kammaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden godkändes av Le Moyne College Institutional Animal Care and Use Committee. All användning av djur överensstämde med de riktlinjer som beskrivs i handledningen för skötsel och användning av försöksdjur8.
OBS: (Kritisk) Före försök, inhämta alla nödvändiga godkännanden och utbildning som krävs för djuranvändning. Det är viktigt att experimentörerna är bekanta med musen beteenden och aktivitetsnivåer, inklusive tecken på sömn, ångest, och / eller rörelse artefakt vs normal sniffning och andning.
1. Hela kroppen Barometer Plethysmography Avdelningen
- Läs lämpliga bruksanvisningar för barometer plethysmography kammaren, inklusive kontakter, O-ringar, etc., och skapa en standard protokollfil för att definiera analysatorer (t.ex. metaboliska) och parametrar som är specifika för programvaran.
- Se till att alla slangar och rör är anslutna till kammaren. Anslut ett gasflödesrör (inflöde) och ett vakuumrör (utflöde) direkt till barometerkammaren.
OBS: Inflödet måste fästas på det öppna markerade bias-flödet. - Fäst CO2,O2och N2 gastankar på gasblandaren. Se till att alla gastankar är i öppet läge före experiment.
2. Kalibrering av barometerkammaren för plethysmograph
- Kalibrera ett högt och lågt gasflöde genom att välja 7700-förstärkarens inställningar under fliken Hårdvaruutrustning i programvaran för barometrisk plethysmografi.
- Ställ in ett vakuum (flöde ut ur kammaren) som är lämpligt för experimentella konstruktions- och gasanalysatorer (~0,1 L/min).
OBS: Utflödet måste förbli detsamma under hela kalibreringen och experimentet för korrekta metaboliska inspelningar. - Ställ in ett lågt luftflöde genom att ta bort flödesröret från kammaren och stänga av vakuumet.
- Registrera nollflödet genom att ange en 0-cell i cellen låg enhet för motsvarande kammare. Dubbelklicka på lågkalkcellen, ändra tiden till 3 s och tryck på Mät.
- Sätt tillbaka flödesröret och låt gas (20,93 % O2, balanserad N2) flöda genom den barometriska plethysmografikammaren från gasblandaren.
- Konvertera inflödet från liter/minuter till milliliter/sekund. Klicka på cellen Hög enhet för motsvarande kammare och ange värdet i milliliter/sekund. Dubbelklicka på Hög cal, ändra tiden till 3 s och klicka på Mät.
- Lämna fliken 7700-amplifier Setup öppen för att kalibrera de metaboliska analysatorerna till barometer plethysmography programvara.
3. Metabolisk analysator kalibrering
- I gasblandare programmet, ställ in gasblandaren för att frigöra ett flöde av gas som innehåller 20,93% O2 och 79,07% N2.
- På de metaboliska analysatorerna ställer du in O 2-kalibreringsnivån till 20,93 % och CO2 för att läsa 0%.2 Vrid tillbaka ratten till Exempel när lämpliga värden har angetts.
- Ställ in2 den höga O 2-procenten. Klicka på fliken ABCD-4 i den barometriska plethysmography-programvaran och ange sedan 20,93 under Hög enhet på C2-linjen. Under High Cal, ändra tiden till 3 s och tryck åtgärd.
- Ställ in2 den låga CO 2-procenten. Ange 0 under Låg Cal på C3-raden och ändra sedan tiden till 3 s och klicka på Mät under Låg cal.
- I gasblandare programmet, ändra O2 värde till 10% och CO2-värdet till 5%. Vänta flera minuter tills gasflödet har anpassats till dessa värden. På de metaboliska analysatorerna vrider du justeringsrattarna för att kalibrera CO2 som motsvarar 5 %. Var noga med att vrida tillbaka ratten till Prov när värdena har kalibrerats.
- Ställ in2 den höga CO 2-procenten. Se till att analysatoravläsningarna är stabila innan du sätter in lämpliga värden i O2 och CO2 på den barometriska plethysmography-programvaran. Klicka på Hög enhet under C3 och skriv in 5. Ändra High Cal till 3 s och tryck åtgärd.
- Ställ in2 den låga O 2-procenten. Klicka på Låg enhet under alternativet C2 och ange 10. Klicka på Låg cal, mata in 3 s och klicka på Mät.
- Ändra gasvärdena på gasblandaren tillbaka till 20,93% O2 och 79,07% N2. Vänta i flera minuter innan kammaren har anpassat sig till dessa värden. Upprepa stegen 3.1\u20123.7 om de metaboliska analysatorerna inte automatiskt läser 20,93% O2 och 0% CO2, för att säkerställa korrekt kalibrering. Bekräfta rutinmässigt korrekt kalibrering med certifierade gastankar.
- Kontrollera flödesmätarena som är anslutna till barometerkammaren. Justera luftflödet in i och ut ur kammaren till de hastigheter som är lämpliga för experimentet (vanligtvis 0,1–0,3 L/min).
- När alla inställningar har tillämpats på programvaran för barometrisk plethysmography klickar du på OK för att börja spela in.
4. Ohämmad barometrisk plethysmografi
- Registrera musens vikt och ursprungliga kroppstemperatur. Vänta 10 min innan du placerar musen i kammaren, för att samla in O2- och CO2-data från en tom kammare. Arbeta i ett lugnt område som är bekant för mössen så att buller och lukter inte stör datainsamlingen. Undvik eventuella störningar, inklusive öppning och stängning av dörrar eller personal som flyttar in/ut ur datainsamlingsrummet.
OBS: Detta specifika protokoll anställda 22 månader gamla manliga C57BL/6J mus. - Under den första timmen dokumenterar du musens beteenden och gör detaljerade anteckningar, inklusive specifika värden för flödet in/ut ur kammaren.
- Efter 60 min kammare tillvänjning, titta på segment av tyst andning för följande 60 min. Lista alla segment som varar minst 15 s i längd utan sniffning och grooming. Ta kroppstemperatur åtgärder var 10 min när du använder en implanterbar enhet.
- I slutet av experimentet, ta bort musen från kammaren och placera den tillbaka i sin bur. All utrustning ska rengöras och torkas av noggrant. Om droppar av vatten kvarstår, använd trycksatt luft för att ta bort dem.
5. Analys av mönster för andning och metabolism
- Öppna den barometriska plethysmography översyn fil och konsultera inspelade anteckningar för djuret av intresse.
- Öppna metabola panelen i programvaran och ta genomsnittet av de första 10 minuter av O2 och CO2, när kammaren var tom. Registrera dessa värden som FiO2 och FiCO2.
- Visa flödespanelen i programvaran för barometrisk plethysmografi. Högerklicka på Analysera attribut och ange lämpliga parametrar. Under fliken Meta 1 anger du FiO2 och FiCO2 från steg 5.2, samt flödet in i kammaren under Meta 2för att beräkna VO2 och VCO2.
- För mönster av andningsanalys, bekräfta tiderna för 15 sekunder av tyst andning med hjälp av anteckningar om djurs beteende samt flödespanelen spårning. Ange tiderna för de 15 sekunder av tyst andning under Open Data Parser Parser View Mode Dialogue från fliken Datatolsk.
- Klicka på Spara parserade härledda data. Öppna datafilen i ett kalkylblad för att hämta binneddata.
6. Analys av Apneas och Förstärkt Breaths
- Avsluta Parser View Modei den öppna granskningsfilen . Gå in i alternativet Diagraminställningar under Inställningar > P3-inställningar och välj Sidvy under Text. Välj 5 för antalet fönsterrutor. Ange -2 i lådan Låg och 2 i rutan märkt Hög för flödesmått i milliliter/sekund. Tillämpa ändringarna.
- Bläddra till 30-minutersmärket på panelen flödesspårning.
- Räkna apneas och förstärkta andetag för 30-60 min efter att musen placerades i kammaren. Kvantifiera perioder av suspenderad andning som varar längre än eller lika med 0,5 s, vilket tyder på en apné. Förstärkta andetag indikeras av en kraftig ökning av andningsspåret över 1,25 ml/s följt av en kraftig minskning under -0,75 ml/s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten av UBP som en utvärdering av andningsmönster hos 16 äldre (22 månader gamla) möss som utförs under normal luftgas (20,93% O2 med balanserad N2) rapporteras. Analysen inkluderade först en jämförelse av ett längre 10 min tyst andningssegment (som tog över 2 h att få) jämfört med genomsnittet av fyra korta 15 s segment (kvantifieras inom minut 60–120). En representativ flödesspårning av tyst andning, där andningen är förenlig med inga aktiva andningsbeteenden, finns i figur 1A. När liknande spårningar samlas in från djur, bör 100% av andetagen accepteras av programvaran. Figur 1B representerar dock andning från ett mer aktivt segment, där mössen utforskar kammaren, sniffar och/eller grooming. Spårningar liknande dem som visas i figur 1B är mindre benägna att accepteras av programvaran och är inte idealiska för den typ av andningsinsamling som används och förklaras av denna metod. De parametrar som valts för bedömning av möjliga skillnader mellan de två tidspunkterna var andningsfrekvens (figur 2A),tidvattenvolym (VT, Figur 2B), minutventilation (VE, figur 2C),tidvattenvolym/inandningstidsförhållande (VT/Ti, figur 2D)och minutventilation/utstött koldioxidförhållande (VE/VCO2/g, figur 2E), som alla beräknades med hjälp av barometer plethysmography programvara och Drorbaugh och Fenn ekvation. Värden som rapporteras för dessa mått ligger inom intervallet för vad vi tidigare har rapporterat för musmodell6,9. Inga betydande skillnader klargjordes mellan grupperna. Post hoc-korrigeringar för flera jämförelser av andningsfrekvens och VT-data redovisades med Bonferroni (p < 0,025 ansågs betydande). Dessa resultat visar att användningen av ett förenklat protokoll med 15 s baslinjer ger liknande resultat som för ett längre baslinjeprotokoll.
Ytterligare analys utfördes med vart och ett av de fyra 15-s baslinjesegmenten för frekvens, VT, VE, VT/Ti och VE/VCO2/g (figur 3). Inga signifikanta skillnader (p > 0,05) mellan någon av tidspunkterna hittades. Det fanns inte heller några skillnader i variabiliteten mellan någon av de fyra tidssegmenten för någon mönster-of-andning åtgärd. Dessutom testade vi variationen i segmentet i 15-gruppen jämfört med 10-minutersgruppen och fann inga signifikanta skillnader med Levenes test när man jämförde genomsnittsgruppsdata.
Antalet apnéer och förstärkta andetag som observerats för varje djur under minut 30–60 i UBP-protokollet presenteras i figur 4. Dessa resultat visar att äldre djur visar upp ett stort antal apnéer och förekomsten av förstärkta andetag inom en 30 minuters span (spårning visas i figur 1C). Uppgifterna är ett tecken på förändringar under åldrandet, eftersom dessa fynd observerades hos 22 månader gamla möss. För att bekräfta interrater tillförlitlighet för apné och förstärkt andetag analyser, Pearson korrelation beräknades för två olika utredare. En hög grad av överenskommelse mellan bedömare hittades, vilket indikeras av ett värde av r = 0,99 för apnéer och r = 0,86 för förstärkta andetag. I framtida studier, ett ökat antal apnéer jämfört med en kontrollgrupp skulle berätta om en andningsdysfunktion som härrör från en neural komponent.
Figur 1: Representativ flödesspårning. (A)Flödesspårning från en tyst baslinje, där musen inte visar upp några aktiva beteenden som sniffning eller grooming. (B)Flödesspårning från en aktiv andningsperiod som inte ingår i våra analyser, där möss rör sig i kammaren och många andetag inte rutinmässigt accepteras. (C)Flödesspårning som visar ett förstärkt andetag följt av en period av apné. Ett 5-fönster visas för alla spår. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Andningsparametrar är likartade för lugna andningssegment på 10 min och 15 s hos 22 månader gamla möss. Barometrisk plethysmography användes för att samla in andningsdata hos äldre möss (n = 16, 22 månader gammal). Andningsdata beräknades för möss under två olika tidpunkter, nämligen genomsnittet av fyra 15 s lugna intervall inom 60-120 min märket av musen är i kammaren och för 10 min konsekvent lugn andning. (A) Andningsfrekvens (andetag / minut). (B)Tidvattenvolym (VT; milliliter/andedräkt). (C) Minut ventilation (VE; milliliter/minut). (D) Förhållandet mellan tidvattenvolym och inspirationstid (VT/Ti; milliliter/sekund). (E) Förhållandet mellan minut ventilation och koldioxid utvisas, normaliserad till vikt (VE/ VCO2/g). Det finns inga statistiskt signifikanta skillnader mellan grupperna efter post hoc-korrigeringar (p > 0,025). Värden på >3 SD ovanför medelvärdet ansågs vara extremvärden och togs bort från datauppsättningen. Data presenteras som medelvärde ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämförelse av fyra 15-sekundersintervall. Andningsdata beräknades i lugna andningsmöss (n = 16, 22 månader gamla) för fyra separata 15 s intervall inom 60–120 minuter av kammarens placering. (A) Andningsfrekvens (andetag / minut). (B)Tidvattenvolym (VT; milliliter/andedräkt). (C) Minut ventilation (VE; milliliter/minut). (D) Förhållandet mellan tidvattenvolym och inspirationstid (VT/Ti; milliliter/sekund). (E) Förhållandet mellan minut ventilation och koldioxid utvisas, normaliserad till vikt (VE/ VCO2/g). Det finns inga statistiskt signifikanta skillnader mellan tidssegmenten (p > 0,05). Extremvärden definieras som >3 SD ovanför medelvärdet och tas bort. Data presenteras som medelvärde ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Apné och förstärkt andetag räknas hos möss. Apneas (≥0,5 s utan andning) och förstärkta andetag (ABs; en kraftig ökning av inandningen över 1,25 ml/s följt av en kraftig utandning under -0,75 ml/s) räknades i åldrade möss(n = 16, 22 månader gamla) mellan 30–60 minuter. Antalet analyserades över 30 min och summan för den tidsperioden rapporteras. Data presenteras som medelvärde ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Schematisk för den ohämmade barometern (UBP) setup. Den övergripande UBP-inställningen bör likna den som beskrivs i figuren. Flödesmätningar skall mätas för de gaser som kommer in i och ut ur kammaren, och gassammansättningen skall vara känd för datatolkning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet ger information om en tyst andningsbaslinje hos möss, samt samla in data om centrala apnéer och förstärkta andetag. De representativa resultaten visar att en 10 min tyst baslinje har ett liknande andningsmönster jämfört med i genomsnitt fyra 15 s anfall för en kohort av gamla möss. Viktigt är att 15 s skjutningar är inte statistiskt annorlunda, inte heller dessa grupper har skillnader i variation från varandra med Levene test. Dessa data visar att även en kort skjutningen är tillräcklig för att övervaka tyst andning. Det är dock fullt möjligt att analysera individuella variationer inom en mus på 15 s vs 10 min kan resultera i olika resultat, som 10 min skjutningen kan omfatta minimal sniffning och grooming aktiviteter. Men att använda Levenes test för en jämförelse av enskilda mus baslinjesegment ger en annan analys än den som beskrivs i detta protokoll. Sammantaget använder utformningen av denna metod 15 s andningssegment som kan förvärvas under minut 60-120 i kammaren, jämfört med att behöva vänta på varje mus för att uppnå längre löptider av tyst baslinje.
Den kortare tid som krävs för baslinjen gör det möjligt att testa mer ängsliga/upprörda stammar av möss för tyst andning. Användningen av ett längre andningssegment (dvs. 10 eller 2 min) förlänger protokollets varaktighet, till en punkt där en prövning kan behöva överges om mössen inte visar ett tyst andningsspår inom 3 timmar. Eftersom många experimentella konstruktioner även innehåller andningsutmaningar (dvs. hypoxi) belyser den förlängda tid som avsatts för andra gaser behovet av att standardisera insamlingstiden vid baslinjen. Användningen av en enda 15 s anfall av tyst andning hjälper till att lindra oron för att arbeta med möss (och stammar av möss) som kan vara särskilt retlig i kammaren. Medan du arbetar med barometrisk plethysmography, fann vi att ~ 10% av möss per studie måste uteslutas på grund av deras oförmåga att utföra så lite som 2 min kontinuerlig tyst andning i kammaren. Genomförandet av tidigare förtrogenhetsförsök misslyckades med att få möss att lugna ner sig snabbare när de placeras i kammaren på experimentdagen. Men eftersom olika stammar, kön och åldrar av möss kan alla reagera olika på kammaren miljön10,11, är det möjligt att tillvänjning tekniker kan vara till hjälp12,13 för vissa kohorter. Våra förtrogenhetsförsök bestod i att placera mössen i UBP-kammaren i testrummet i 1–2 timmar i flera dagar före experiment. Medan vi observerade inga förändringar i djurs beteende efter detta förfarande, en tidigare studie har visat att 24 h av tillvänjning behövdes för att eliminera nyhet effekter som resulterar i spontan fysisk aktivitet hos möss12. Dessutom fann Kabir et al. att placera plastcylindrar liknande i storlek till barometrisk plethysmography kammaren i hemburen var fördelaktigt att få råttor att bekanta sig med uppställningar före experiment13.
Detta protokoll avslöjar också möjliga respiratorisk dysfunktion hos möss via kvantifiering av centrala apnéer, vägledande för neural kontroll frågor. Trettio minuters observation före baslinjen mönster-andning samling visade att alla 16 äldre möss visade ett stort antal apneic episoder och förstärkt andetag (representerade i figur 1C). De många apneas i denna åldern mus kohort belysa förmågan hos detta protokoll att kvantifiera en annan viktig andningsåtgärd utan att lägga till ytterligare tid till experiment. Det bör noteras att ålder och sjukdomsprogression (om tillämpligt) kan påverka närvaron och antalet apnéepisoder.
För att karakterisera tyst andning är det viktigt att kontinuerligt observera den barometriska plethysmographykammaren och musen under protokollets hela tid. För kvantifiering av tyst andning bör möss vara vakna men inte delta i några aktiva beteenden som sniffning, grooming eller utforskande (representerad i figur 1A). Sedan mönstrar av att andas under sömn kan skilja sig åt från de i ett vaken djur14,15, är samlingen av lugna som andas under det vakna statligt kritisk. Det är möjligt att längre segment av tyst andning kan inkludera perioder av sömn, som kanske inte önskas beroende på experimentell design. I detta fall skulle kortare segment av tyst andning vara idealiska för att dokumentera, eftersom sannolikheten för datainsamling under sömnen minskar när aktiva segment flankerar de korta (15 s) tysta andningssegmenten. Vi har observerat att längre segment av tyst andning kan vara utmanande att förvärva i musmodellen, som mus beteende i kammaren verkar vara mycket annorlunda jämfört med råttor. Det är viktigt både att kritiskt observera mus andningsflöde för lämpliga andningssegment och att dokumentera djurs beteende. Vid minskad ventilation eller instabil andning kan denna metod fortfarande användas. I dessa fall är det viktigt att experimentören är förblindad till kohorten när du väljer 15 s segment. Programvaran bör skilja andetag, med en acceptans på 100% under 15 s period. Vi rekommenderar att du noterar andningsspårningarna förutom att se till att djuren uppfyller beteendekriterierna för baslinjen eftersom det är möjligt att stationära möss fortfarande kan vara oroliga. En tidigare studie rapporterade att även råttor uppvisade lugnt beteende, de fortfarande visade förändrade andningsmönster (dvs. ökad frekvens) som svar på kontrollerade stimuli i testrummet13.
Mått på frekvens, VT, VE, inandningstid och expiratory tid, och VE/VCO2 är alla kvantifierade med analysatorer och UBP programvara och rapporteras ofta i litteraturen. Särskilt VT- och VE-beräkningar använder drorbaugh- och fennekvationen16, som kräver kända värden för kroppstemperatur, omgivningskammares temperatur, fuktighet och barometertryck. Det rekommenderas att samla in dessa åtgärder under hela experimentet för de mest exakta VT- och VE-värdena. Andra variabler som beräknas av systemet bör användas med försiktighet. UBP är inte ett direkt mått på lungmekanik; Variabler relaterade till luftvägsresistens (t.ex. förbättrad paus [Penh]) bör därför tolkas med denna varning i åtanke5. Ytterligare komponenter i UBP-installationen som kan påverka variabler som beräknas av programvaran inkluderar flödeshastigheter och den allmänna kalibreringen av systemet. Bekräfta att tätningar och packningar fungerar korrekt (inga läckor) och se till att all utrustning ansluts till den barometriska plethysmografikammaren (figur 5). Flödeshastigheten in och ut ur kammaren bör hållas konsekventa. Erforderliga flödeshastigheter kan skilja sig åt mellan UBP-inställningar, så det är viktigt att kontrollera dessa värden före experiment. Flödet in i kammaren bör vara tillräckligt för att ge frisk luft eller gas utmaningar i tid. Flödet bör också vara tillräckligt för att de metaboliska analysatorerna ska kunna mäta O2 och CO2 utan att co2 byggs upp i kammarmiljön, vilket medför risk för ett förändrat andningsmönster. På samma sätt måste gasblandare/analysatorkalibreringar regelbundet genomföras för att säkerställa att de metaboliska parametrarna mäts korrekt.
Andra överväganden för medvetna UBP inkluderar att minska distraktioner inom försöksrummet medan djur testas. Höga ljud, olika dofter, och förekomsten av oväsentlig personal i rummet kan alla lägga till oroliga beteenden som visas av möss. Använda mindre rum som testområden kan hjälpa, men om detta inte är möjligt, kartong väggar (med ett litet fönster) kan ställas in kring kammaren för att minska distraktioner för möss. Elektrisk aktivitet i rummet bör hållas på ett minimum för att förhindra ytterligare buller inom barometriska plethysmography spårningar. Därför är det viktigt att notera flödesspårningarna under den 10 min period då programvaran samlar in data från en tom kammare. Dessa spårningar bör förbli oförändrade, och eventuella avbrott eller små vågor är tecken på buller och bör åtgärdas. Tryckförändringar från att öppna och stänga dörrar eller från VVS-funktion kan också lägga till felaktiga fluktuationer, och se till att dessa åtgärder sker minimalt (och notera dem när de inträffar) är avgörande. Luftfuktigheten kan också påverka den beräknade tidvattenvolymen och minutventilationen, vilket gör det mycket viktigt att bekräfta att kammaren och anslutningsrören torkas före användning. Vid behov kan användningen av drieritpärlor i följd med inflödet hjälpa till att avlägsna all kondens i luften före kammarens ingång. Detta steg skulle införas i de fall då luftfuktigheten rutinmässigt har varit högre än de nivåer som anges i Guiden för vård och användning av djur8 (30%-70%, helst inom 10% av börvärdet). Fuktighet kan också byggas upp i kammaren på grund av djurets närvaro. Även om en viss fuktighet är normal kan den fortsätta att bygga om djuret är alltför aktivt eller placeras i kammaren under längre tid. Om fuktighetsnivåerna når gränsvärdena (99,99 %), kan kammaren behöva öppnas och torkas av under experiment för att bibehålla jämförbara andningsåtgärder. Programvaran står för förändringar i barometertryck, omgivningstemperatur, djurtemperatur och luftfuktighet. Bästa praxis är att upprätthålla värdena inom ett rimligt intervall så att "äpplen till äpplen" jämförs över åldrar, stammar och kön. Dessutom är dygnsrytmen cykel av möss och tidsintervallet för testning, liksom särskilda ljusförhållanden i rummet, viktiga detaljer att överväga13,17. Till exempel testar vi vanligtvis möss i belysning som liknar deras bostadsrum (antingen ljus eller mörk cykel) och inom en 3 h intervall18. Försökskaror bör också förbli blinda för djurgrupperna under datainsamling och analyser för att förhindra skillnader i valet av baslinje. När det är möjligt bör samma experimentör samla in alla data och/eller analysera alla spårningar i ett visst experiment. Åtgärder för att hålla experimentörer förblindade för djurgrupper, samt randomisering och testning under liknande tider på dagen, är avgörande för stringensen av undersökningen. I slutändan finns det främmande faktorer som kan förändra flödesspårningarna, och dessa problem bör beaktas när UBP utförs.
UBP-metoden är en teknik som används för att karakterisera andningsmönstret hos möss. Utgångsmått kan samlas in inom 2 timmar vid användning av ett andningssegment på 15 s. Här rapporterar vi en metod som kan utföras med äldre möss, som ofta är mer upprörda i kammaren än yngre möss, vilket tyder på att andra oroliga eller aktiva musstammar också kan testas med detta protokoll. De data som samlas in från UBP är noninvasive och möjliggör testning över flera tidpunkter, vilket är användbart för studier om åldrande, läkemedelsbehandling, och sjukdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Angela Le, Sarah Ruby och Marisa Mickey för deras arbete med att upprätthålla djurkolonierna. Detta arbete finansierades av 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. för att stödja CNR) och McDevitt Undergraduate Research Fellowship in Natural Sciences (BEE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
- DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
- Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
- Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
- van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
- Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
- Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , Bethesda, MD. (2018).
- Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
- Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
- Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
- Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
- Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
- Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
- Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
- Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
- Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10 (2018).
