Summary
Uhæmmet barometerplethysmografi bruges til at kvantificere mønstret for vejrtrækning i vågen mus. Vi viser, at 15 s segmenter under en standardiseret protokol viser lignende værdier til en længere varighed af stille vejrtrækning. Denne metode giver også mulighed for kvantificering af apnø og augmented vejrtrækninger i løbet af den første time i kammeret.
Abstract
Uhæmmet barometrisk plethysmografi (UBP) er en metode til kvantificering af åndedrætsmønsteret hos mus, hvor vejrtrækningsfrekvens, tidevandsvolumen og minutventilation rutinemæssigt rapporteres. Desuden kan der indsamles oplysninger om neurale output af vejrtrækning, herunder eksistensen af centrale apnø og augmented vejrtrækninger. En vigtig overvejelse for UBP er at opnå en vejrtrækning segment med en minimal effekt af ængstelig eller aktiv adfærd, at belyse svaret på vejrtrækning udfordringer. Her præsenterer vi en protokol, der giver mulighed for korte, rolige baselines, der skal opnås i alderen mus, kan sammenlignes med at vente på længere anfald af stille vejrtrækning. Brugen af kortere tidsegmenter er værdifuld, da nogle stammer af mus kan være mere og mere ophidselige eller ængstelige, og længere perioder med stille vejrtrækning kan ikke opnås inden for en rimelig tidsramme. Vi placerede 22 måneder gamle mus i et UBP-kammer og sammenlignede fire 15 s stille vejrtrækningssegmenter mellem minutter 60-120 til en længere 10 minutters stille vejrtrækningsperiode, der tog 2-3 timer at erhverve. Vi opnåede også optællinger af centrale apnø og augmented vejrtrækninger forud for de stille vejrtrækningsegmenter efter en 30 minutters familiarization periode. Vi viser, at 10 min stille vejrtrækning kan sammenlignes med at bruge en meget kortere 15 s varighed. Derudover kan tiden op til disse 15 s stille vejrtrækning segmenter bruges til at indsamle data om apnø af central oprindelse. Denne protokol gør det muligt for efterforskere at indsamle mønstre-of-vejrtrækning data i et bestemt tidsrum og gør stille baseline foranstaltninger muligt for mus, der kan udvise øgede mængder af overgearet adfærd. UBP-metoden i sig selv giver en nyttig og noninvasive måde at indsamle mønstre-of-vejrtrækning data og giver mulighed for mus, der skal testes over flere tidspunkter.
Introduction
UBP er en almindelig teknik til vurdering af vejrtrækningsmønstre1,2,3,4. Ved denne metode anbringes musene i et lukket kammer, hvor trykforskelle mellem hovedkammeret (hvor dyret er anbragt) og et referencekammer filtreres gennem en pneutøchograf for at opnå værdier. Den resulterende UBP setup er noninvasive og uhæmmet og giver mulighed for respiratoriske foranstaltninger, der skal vurderes uden krav om anæstesi eller kirurgi. Derudover er denne teknik velegnet til undersøgelser, der kræver flere målinger i den samme mus over tid. Variabler såsom vejrtrækning frekvens, tidevandsvolumen, og minutter ventilation kan kvantificeres med denne metode, under et enkelt forsøg eller over flere forsøg. Hele kroppen UBP giver også målinger af peak strømme og respiratoriske cyklus varighed. Tilsammen kvantificerer disse parametre åndedrætsmønstret. De registrerede vejrtrækningsspor gør det også muligt at gennemgå dataene og tælle antallet af centrale apnø, der vises inden for en given tidsperiode. Dette antal kan bruges sammen med en analyse af tidevandsvolumen og inspiratorisk gange til at måle andre ændringer i åndedrætsmønsteret.
Mens flere noninvasive plethysmografi teknikker findes for direkte vurdering af pulmonal fysiologiske parametre, hele kroppen UBP giver mulighed for en måde at screene for respiratorisk funktion med minimal unødig stress til musen. Head-out plethysmografi, som udnytter tidevandmidtudløbflow foranstaltninger og er også noninvasive, er afhængig af tilbageholdenhed, ligesom mange andre typer af plethysmografi (f.eks dobbelt-kammer plethysmografi). Mens disse metoder har været anvendt i gnavere modeller til at måle luftvejene lydhørhed5, brug af hals kraver eller små fastholdelsesrør kan tage mus (vs andre arter) længere at akklimatisere til og returnere deres vejrtrækning til hvileniveauer.
Opnåelse af et optimalt luftåndende segment er en vigtig overvejelse for baseline sammenligninger. Den øgede brug af kommercielt tilgængelige plethysmografisystemer gør indsamling af åndedrætsmønstret muligt i mange laboratorier. Det er vigtigt, at åndedrætsmønsteret varierer i hele indsamlingsperioden, især for mus. Når det er sagt, er det nødvendigt at standardisere basisanalysen som et middel til at sikre, at forsøgseksperimenternes uddannelsesniveau ikke forvirrer resultaterne. Der er mange måder at indsamle en luft-vejrtrækning segment, der tjener som et område af variation mellem eksperimentelle design. Et eksempel omfatter gennemsnit de sidste 10-30 min data efter en tidligere defineret sæt tid i kammeret1, mens en anden metode indebærer at vente, indtil musen er synligt rolig i 5-10 min6. Sidstnævnte kan tage 2-3 h for at opnå, og i nogle tilfælde kan en retssag skal opgives, hvis musen ikke er rolig længe nok. Denne bekymring er en særlig vigtig overvejelse for stammer af mus, hvor observerede adfærd er mere ængstelig og excitable7. Disse mus kan tage længere tid at tilpasse sig kammeret miljø og kun bevare roen for korte byger af tid. Hvis du begrænser den tid, der afsættes til oprindelig samling, standardiserer kammertiden for hver mus.
Det er afgørende, at eksperimentatorer opnår en passende baseline, der omfatter hvileadfærdsværdier i musen, men også forekommer rettidigt. Derfor er formålet med denne rapport at give en beskrivelse af de metoder, der anvendes til at opnå korte stille baseline værdier for vejrtrækning parametre i mus. Desuden rapporterer vi, at apnø og augmented vejrtrækninger kan kvantificeres i løbet af den første time i kammeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af Le Moyne College Institutional Animal Care and Use Committee. Al anvendelse af dyr var i overensstemmelse med de politikker, der er beskrevet i vejledningen om pleje og anvendelse af laboratoriedyr8.
BEMÆRK: (Kritisk) Før forsøg skal du indhente alle nødvendige godkendelser og den uddannelse, der kræves til brug i dyrene. Det er vigtigt, at eksperimentatorerne er fortrolige med musens adfærd og aktivitetsniveauer, herunder tegn på søvn, angst og/ eller bevægelsesartefakt vs. normal sniffing og vejrtrækning.
1. Helkropsbarometrisk plethysmografikammer
- Læs de relevante brugervejledninger for det barometersammenrimet hymografikammer, herunder stik, O-ringe osv., og opret en standardprotokolfil til definition af analysatorer (f.eks. metaboliske) og parametre, der er specifikke for softwaren.
- Sørg for, at alle slanger og rør er forbundet til kammeret. Tilslut et gasflowrør (flow-in) og et vakuumrør (flow-out) direkte til det barometerplethysmografikammer.
BEMÆRK: Tilstrømningen skal være fastgjort til det markerede biasflow. - Fastgør CO2,O2og N2 gastanke til gasblanderen. Sørg for, at alle gastanke er i åben position før forsøg.
2. Kalibrering af det barometriske plethysmografkammer
- Kalibrer en høj og en lav gasstrøm ved at vælge opsætningen af 7700-forstærker under fanen Hardware i den barometerethysmografisoftware.
- Indstil et vakuum (flow ud af kammeret) egnet til den eksperimentelle design og gas analysatorer (~ 0,1 L / min).
BEMÆRK: Udstrømningshastigheden skal forblive den samme i kalibreringerne og eksperimentere for nøjagtige metaboliske optagelser. - Indstil en lav luftstrøm ved at fjerne flowrøret fra kammeret og slukke for vakuumet.
- Optag nulflowet ved at indtaste en 0 i cellen Lav enhed for det tilsvarende kammer. Dobbeltklik på cellen Lav kalist, skift klokkeslættet til 3 s, og tryk på Mål.
- Sæt flowrøret på igen, og lad gassen (20,93% O2, afbalanceret N2) flyde gennem det barometeriske plethysmografikammer fra gasblanderen.
- Omregne tilstrømningen fra liter/minutter til milliliter/sekund. Klik på cellen Høj enhed for det tilsvarende kammer, og angiv værdien i milliliter/sekund. Dobbeltklik på Høj kalk, skift klokkeslættet til 3 s, og klik på Mål.
- Lad fanen opsætning af 7700-forstærker være åben for at kalibrere de metaboliske analysatorer til den barometriske plethysmografisoftware.
3. Metabolisk analysator Kalibrering
- I gasmixerprogrammet indstilles gasmixeren til at frigive en gasstrøm indeholdende 20,93% O2 og 79,07% N2.
- På de metaboliske analysatorer indstilles O 2-kalibreringsniveauet til 20,93 % og CO2 til at aflæse 0 %.2 Vend knappen tilbage til Eksempel, når de relevante værdier er indtastet.
- Indstil den høje O2 procent. Klik på ABCD-4 fanen af barometeret plethysmografi software og derefter indtaste 20,93 under Høj enhed af C2 linje. Skift High Caltid til 3 s og tryk på Målpunkt.
- Indstil2 den lave CO 2-procent. Skriv 0 under Lav kalk af C3-linjen, og skift derefter klokkeslættet til 3 s, og klik på Mål under Lav kalender.
- I gasmixerprogrammet skal du ændre O2-værdien til 10 % og CO2-værdien til 5 %. Vent flere minutter, før gasstrømmen tilpasser sig disse værdier. På de metaboliske analysatorer drejes justeringsknapperne for at kalibrere CO2 svarende til 5%. Sørg for at vende knappen tilbage til Eksempel, når værdierne er kalibreret.
- Indstil2 den høje CO 2-procent. Sørg for, at analysatoraflæsningerne er stabile, før der indsættes passende værdier i O2 og CO2 på den barometerisme plethysmografisoftware. Klik på Høj enhed under C3 , og skriv 5. Skift High Cal til 3 s og tryk Foranstaltning.
- Indstil den lave O2 procent. Klik på Lav enhed under indstillingen C2 , og skriv 10. Klik på Lav kalender, input 3 s , og klik på Mål .
- Skift gasværdierne på gasmixeren tilbage til 20,93% O2 og 79,07% N2. Vent flere minutter på, at kammeret tilpasser sig disse værdier. Gentag trinene 3.1\u20123.7, hvis de metaboliske analysatorer ikke automatisk læser 20,93% O2 og 0% CO2for at sikre korrekt kalibrering. Bekræft rutinemæssigt korrekt kalibrering med certificerede gastanke.
- Kontroller de flowmålere, der er forbundet med det barometer, der er fyldt med hymografi. Luftstrømmen til og fra kammeret justeres til de hastigheder, der passer til forsøget (typisk 0,1-0,3 L/min. ).
- Når alle indstillinger er anvendt på den barometeret plethysmografi software, skal du klikke på OK for at begynde at optage.
4. Uhæmmet barometrisk plethysmografi
- Optag musens vægt og indledende kropstemperatur. Vent 10 minutter, før du placerer musen i kammeret, for at indsamle O2- og CO2-data fra et tomt kammer. Arbejd i et roligt område, der er velkendt for musene, så støj og lugt ikke forstyrrer dataindsamlingen. Undgå eventuelle forstyrrelser, herunder åbning og lukning af døre eller personale, der flytter ind/ud af dataindsamlingsrummet.
BEMÆRK: Denne særlige protokol beskæftigede 22 måneder gamle mandlige C57BL/6J mus. - I løbet af den første time skal du dokumentere musens funktionsmåde og tage detaljerede noter, herunder specifikke værdier for flowet ind/ud af kammeret.
- Efter 60 min kammer tilvænning, se efter segmenter af stille vejrtrækning for følgende 60 min. Liste eventuelle segmenter varer mindst 15 s i længden uden sniffing og grooming. Tag kropstemperatur målinger hver 10 min, når du bruger en implantabel enhed.
- I slutningen af forsøget, fjerne musen fra kammeret og placere den tilbage i sit bur. Alt udstyr skal rengøres og tørres grundigt ned. Hvis der stadig er dråber vand tilbage, skal du bruge trykluft til at fjerne dem.
5. Analyse af mønster af vejrtrækning og stofskifte
- Åbn den barometriske plethysmografi review-fil, og se de registrerede noter for det dyr, der er af interesse.
- Åbn metabolisk panel i softwaren og tage gennemsnittet af de første 10 min O2 og CO2, når kammeret var tomt. Registrer disse værdier som FiO2 og FiCO2.
- Se flowpanelet for den barometerisme plethysmografisoftware. Højreklik på Analysér attributter, og angiv de relevante parametre. Under fanen Meta 1 skal du indtaste FiO2 og FiCO2 fra trin 5.2 samt strømmen ind i kammeret under Meta 2for at beregne VO2 og VCO2.
- For mønster af vejrtrækning analyse, bekræfte tiderne for de 15 sekunder af stille vejrtrækning ved hjælp af noter om dyrs adfærd samt flow panel sporing. Angiv tiderne for de 15 s intervaller af stille vejrtrækning under Åben data parser dialog fra data Parser View Mode parser fanen.
- Klik på Gem parserede afledte data. Åbn datafilen i et regneark for at hente de binære data.
6. Analyse af apnø og augmented vejrtrækninger
- Afslut Parservisningstilstandi den åbne korrekturfil . Gå til indstillingen Grafopsætning under Opsætning > P3-opsætning, og vælg Sidevisning under Type. Vælg 5 for antallet af ruder. Indtast -2 i boksen med navnet Lav og 2 i boksen med mærket Høj for flowmål i milliliter/sekund. Anvend ændringerne.
- Rul til 30 min mærket på flow sporinger panel.
- Tæl apnø og augmented vejrtrækninger for 30-60 min efter musen blev placeret i kammeret. Kvantificer perioder med suspenderet vejrtrækning, der varer længere end eller lig med 0,5 s, hvilket indikerer en apnø. Augmented vejrtrækninger indikeres af en kraftig stigning i vejrtrækningssporingen over 1,25 ml/s efterfulgt af et kraftigt fald under -0,75 ml/s.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne af UBP som en vurdering af åndedrætsmønstret hos 16 gamle (22 måneder gamle) mus, der udføres under normal luftgas (20,93% O2 med afbalanceret N2) rapporteres. Analysen omfattede først en sammenligning af et længere 10 min stille vejrtrækningsegment (som tog over 2 timer at opnå) i forhold til gennemsnittet af fire korte 15 s segmenter (kvantificeret inden for minutter 60-120). En repræsentativ flow sporing af stille vejrtrækning, hvor vejrtrækning er i overensstemmelse med nogen aktiv vejrtrækning adfærd, er fastsat i figur 1A. Når lignende sporinger indsamles fra dyr, bør 100% af vejrtrækningerne accepteres af softwaren. Figur 1B repræsenterer imidlertid vejrtrækning fra et mere aktivt segment, hvor musene udforsker kammeret, sniffer og/eller grooming. Sporinger svarende til dem, der er vist i figur 1B, er mindre tilbøjelige til at blive accepteret af softwaren og er ikke ideelle til den type vejrtrækningsindsamling, der anvendes og forklares ved denne metode. De parametre, der blev valgt til vurdering af mulige mønstre-of-vejrtrækning forskelle mellem de to tidspunkter var vejrtrækning frekvens (Figur 2A), tidevandsvolumen (VT, Figur 2B), minutventilation (VE, figur 2C), tidevandsvolumen/inspiratorisk tidsforhold (VT/Ti, figur 2D) og minutventilations-/udstødt kuldioxidforhold (VE/VCO2/g,figur 2E), som alle blev beregnet ved hjælp af den barometriske plethysmografisoftware og Drorbaugh- og Fenn-ligningen. De værdier , der rapporteres for disse mål , ligger inden for det område , vi tidligere har rapporteret for musemodel6,9. Der blev ikke belyst væsentlige forskelle mellem grupperne. der blev foretaget post hoc-korrektioner for flere sammenligninger af vejrtrækningsfrekvens og VT-data med Bonferroni (p < 0,025 blev anset for signifikant). Disse resultater viser, at brugen af en forenklet protokol ved hjælp af 15 s baselines giver samme resultater som en længere baseline protokol.
Der blev foretaget yderligere analyse med hver af de fire 15 s baseline segmenter for frekvens, VT, VE, VT/Ti og VE/VCO2/g (Figur 3). Der blev ikke fundet væsentlige forskelle (p > 0,05) mellem nogen af tidspunkterne. Der var heller ingen forskelle i variabiliteten mellem nogen af de fire tidssegmenter for nogen mønster-of-vejrtrækning foranstaltning. Derudover testede vi variabiliteten af segmentet af 15-gruppen vs. 10 min gruppen og fandt ingen signifikante forskelle ved hjælp af Levenes test, når man sammenlignede de gennemsnitlige gruppedata.
Antallet af apnø og forstærkede vejrtrækninger observeret for hvert dyr i minutterne 30-60 i UBP-protokollen er vist i figur 4. Disse resultater viser, at gamle dyr viser et stort antal apnø og tilstedeværelsen af augmented vejrtrækninger inden for en 30 min spændvidde (sporing vist i figur 1C). Dataene er tegn på ændringer under aldringsprocessen, da disse fund blev observeret hos 22 måneder gamle mus. For at bekræfte interrater pålidelighed for apnø og augmented breath analyser, Pearson korrelation blev beregnet for to forskellige efterforskere. En høj grad af enighed mellem rotterblev fundet, som angivet ved en værdi af r = 0,99 for apnø og r = 0,86 for augmented vejrtrækninger. I fremtidige undersøgelser, et øget antal apnø i forhold til en kontrolgruppe ville være at fortælle om en vejrtrækning dysfunktion stammer fra en neural komponent.
Figur 1: Repræsentative flowsporinger. (A) Flowsporing fra en stille baseline, hvor musen ikke viser nogen aktiv adfærd, såsom sniffing eller grooming. -Flowsporingfra en aktiv vejrtrækningsperiode, der ikke indgår i vores analyser, hvor mus bevæger sig rundt i kammeret, og hvor mange vejrtrækninger ikke rutinemæssigt accepteres. (C) Flow sporing viser en forstærket ånde efterfulgt af en periode med apnø. Der vises et vindue på 5 s for alle spor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Vejrtrækningsparametre ne er ens for rolige vejrtrækningssegmenter på 10 min og 15 s i 22 måneder gamle mus. Barometerplethysmografi blev brugt til at indsamle vejrtrækningsdata hos ældede mus (n = 16, 22 måneder gamle). Vejrtrækningsdata blev beregnet for mus i to forskellige tidspunkter, nemlig gennemsnittet af fire 15 s rolige intervaller inden for 60-120 min mærke af musen er i kammeret og i 10 min konsekvent rolig vejrtrækning. (A) Vejrtrækningsfrekvens (vejrtrækning/minut). (B) Tidevandsvolumen (VT; milliliter/ånde). (C) Minutters ventilation (VE; milliliter/minut). (D) Forholdet mellem tidevandsvolumen og inspirationstid (VT/Ti; milliliter/sekund). (E) Forholdet mellem minutventilation og kuldioxid, der udvises, normaliseret til vægt (VE/VCO2/g). Der er ingen statistisk signifikante forskelle mellem grupperne efter post hoc-korrektioner (p > 0,025). Værdier på >3 SD over middelværdien blev betragtet som afvigende og fjernet fra datasættet. Data præsenteres som middel ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Sammenligning af fire intervaller på 15 sekunder. Vejrtrækningsdata blev beregnet i rolige vejrtrækningsmus (n = 16, 22 måneder gamle) for fire separate intervaller på 15 sekunder inden for 60-120 min. (A) Vejrtrækningsfrekvens (vejrtrækning/minut). (B) Tidevandsvolumen (VT; milliliter/ånde). (C) Minutters ventilation (VE; milliliter/minut). (D) Forholdet mellem tidevandsvolumen og inspirationstid (VT/Ti; milliliter/sekund). (E) Forholdet mellem minutventilation og kuldioxid, der udvises, normaliseret til vægt (VE/VCO2/g). Der er ingen statistisk signifikante forskelle mellem tidssegmenterne (p > 0,05). Afvigende midler defineres som >3 SD over middelværdien og fjernes. Data præsenteres som middel ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Apnø og forøget åndedræt stælling hos mus. Apnø (≥0,5 s uden vejrtrækning) og forstærkede vejrtrækninger (ABs; en kraftig stigning i inhalation over 1,25 ml/s efterfulgt af en skarp udånding under -0,75 ml/s) blev talt i alderen mus (n = 16, 22 måneder gammel) mellem 30-60 min. Optællingerne blev analyseret over 30 min, og det samlede antal for den pågældende periode rapporteres. Data præsenteres som middel ± SD. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Skemaaf opsætningen af uhæmmet barometrisk plethysmografi (UBP). Den samlede UBP-opsætning skal svare til den, der er beskrevet i figuren. Strømningsmålinger skal måles for de gasser, der trænger ind i og ud af kammeret, og gassammensætningen skal være kendt for datafortolkning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen indeholder oplysninger om en stille vejrtrækning baseline i mus, samt indsamling af data om centrale apnø og augmented vejrtrækninger. De repræsentative resultater viser, at en 10 min stille baseline har et lignende mønster af vejrtrækning sammenlignet med et gennemsnit på fire 15 s anfald for en kohorte af gamle mus. Det er vigtigt, at de 15 s anfald ikke er statistisk forskellige, og disse grupper har heller ikke forskelle i variation fra hinanden ved hjælp af Levene's test. Disse data viser, at selv en kort kamp er tilstrækkelig til overvågning af stille vejrtrækning. Men det er fuldt ud muligt, at analysere individuelle variation inden for en mus på 15 s vs 10 min kan resultere i forskellige resultater, som 10 min bout kunne omfatte minimal sniffing og grooming aktiviteter. Hvis du bruger Levenes test til en sammenligning af de enkelte basissegmenter for mus, giver det dog en anden analyse end den, der er beskrevet i denne protokol. Samlet set er udformningen af denne metode bruger 15 s vejrtrækning segmenter, der kan erhverves i løbet af minutter 60-120 i kammeret, versus at skulle vente på hver mus til at opnå længere varigheder af stille baseline.
Den kortere varighed, der kræves for baseline giver mulighed for mere ængstelig / ophidset stammer af mus, der skal testes for stille vejrtrækning. Brugen af et længere vejrtrækningssegment (dvs. 10 eller 2 min) forlænger protokollens varighed til et punkt, hvor det kan være nødvendigt at opgive et forsøg, hvis musene ikke udviser et stille vejrtrækningsspor inden for 3 timer. Da mange eksperimentelle design også omfatter respiratoriske udfordringer (dvs. hypoxi), understreger den forlængede tid, der er afsat til andre gasser, behovet for at standardisere baselineindsamlingstiden. Brugen af en enkelt 15's anfald af stille vejrtrækning hjælper med at lindre bekymringen for at arbejde med mus (og stammer af mus), der kan være særligt ophidselige i kammeret. Mens vi arbejdede med barometerplethysmografi, fandt vi, at ~ 10% af mus pr. undersøgelse måtte udelukkes på grund af deres manglende evne til at udføre så lidt som 2 min kontinuerlig stille vejrtrækning i kammeret. Gennemførelsen af tidligere kendskabforsøg lykkedes ikke at få mus til at falde til ro hurtigere, når de placeres i kammeret på dagen for eksperimentering. Men fordi forskellige stammer, køn og aldre af mus kan alle reagere forskelligt på kammeret miljø10,11, er det muligt, at tilvænning teknikker kan være nyttige12,13 for nogle kohorter. Vores familiarization forsøg bestod i at placere mus i UBP kammer i testrummet for 1-2 h i flere dage før eksperimenter. Mens vi observerede ingen ændringer i dyrs adfærd efter denne procedure, en tidligere undersøgelse har vist, at 24 h tilvænning var nødvendig for at fjerne nyhed effekter resulterer i spontan fysisk aktivitet i mus12. Derudover, Kabir et al. fandt, at placere plastcylindre ligner i størrelse til barometerplethysmografi kammer i hjemmet buret var en fordel i at få rotter til at sætte sig ind i opsætninger før eksperimenter13.
Denne protokol afdækker også mulige respiratoriske dysfunktion hos mus via kvantificering af centrale apnø, hvilket indikerer neurale kontrolproblemer. 30 minutters observation før den oprindelige indsamling af vejrtrækningsmønster viste, at alle 16 gamle mus udviste et stort antal apnøepisoder og forstærkede vejrtrækninger (repræsenteret i figur 1C). De mange apnøier i denne gamle musekohorte fremhæver denne protokols evne til at kvantificere en anden vigtig vejrtrækningsforanstaltning uden at tilføje ekstra tid til eksperimenter. Det skal bemærkes, at alder og sygdomsprogression (hvis relevant) kan påvirke tilstedeværelsen og antallet af apnøepisoder.
For at karakterisere stille vejrtrækning, er det vigtigt løbende at observere barometerplethysmografi kammer og mus i hele protokollens varighed. For kvantificering af stille vejrtrækning, mus bør være vågen, men ikke deltage i nogen aktiv adfærd såsom sniffing, grooming, eller udforske (repræsenteret i figur 1A). Da mønstre af vejrtrækning under søvn kan afvige fra dem i et vågent dyr14,15, indsamling af rolige vejrtrækning under vågen tilstand er kritisk. Det er muligt, at længere segmenter af stille vejrtrækning kan omfatte perioder med søvn, som måske ikke ønskes afhængigt af det eksperimentelle design. I dette tilfælde ville kortere segmenter af stille vejrtrækning være ideel til at dokumentere, da sandsynligheden for dataindsamling under søvn reduceres, når aktive segmenter flankerer de korte (15 s) stille vejrtrækningsegmenter. Vi har observeret, at længere segmenter af stille vejrtrækning kan være udfordrende at erhverve i musen model, som musen adfærd i kammeret synes at være meget anderledes i forhold til rotter. Det er vigtigt både at kritisk observere musen respiratoriske flow for passende vejrtrækning segmenter og til at dokumentere dyrs adfærd. I tilfælde af nedsat ventilation eller ustabil vejrtrækning, kan denne metode stadig udnyttes. I disse tilfælde er det vigtigt, at eksperimentatoren blændes af kohorten, når der vælges 15 s segmenter. Programmet bør skelne vejrtrækninger, med en accept på 100% i løbet af de 15 s periode. Vi anbefaler at notere sig vejrtrækning ssporinger ud over at sikre, at dyrene opfylder adfærdsmæssige kriterier for baseline, da det er muligt, at stationære mus stadig kan være ængstelig. En tidligere undersøgelse rapporterede, at selv om rotter udviste rolig adfærd, de stadig viste ændret vejrtrækning mønstre (dvs. øget hyppighed) som reaktion på kontrollerede stimuli i testrummet13.
Målinger af frekvens, VT, VE, inspiratorisk og expiratory tid, og VE / VCO2 er alle kvantificeret ved hjælp af analysatorer og UBP software og er ofte rapporteret i litteraturen. Især VT og VE beregninger bruge Drorbaugh og Fenn ligning16, som kræver kendte værdier for kropstemperatur, omgivende kammer temperatur, fugtighed, og barometertryk. Det anbefales at indsamle disse foranstaltninger i hele eksperimentet for de mest nøjagtige VT- og VE-værdier. Andre variabler, der beregnes af systemet, bør anvendes med forsigtighed. UBP er ikke et direkte mål for lungemekanik; Variabler relateret til luftvejsmodstand (f.eks. forbedret pause [Penh]) skal derfor fortolkes med dette forbehold for øje5. Yderligere komponenter i UBP-opsætningen, der kan påvirke variabler beregnet af softwaren, omfatter strømningshastigheder og den generelle kalibrering af systemet. Bekræft, at tætninger og pakninger fungerer korrekt (ingen utætheder), og sørg for korrekt tilslutning af alt udstyr til det barometerenets plethysmografikammer (Figur 5). Strømningshastigheder ind og ud af kammeret skal holdes konsistente. De ønskede strømningshastigheder kan variere mellem UBP-opsætninger, så det er vigtigt at kontrollere disse værdier før eksperimenter. Strømningshastigheden ind i kammeret bør være nok til at give frisk luft eller gas udfordringer i tide. Strømningshastigheden bør også være tilstrækkelig til, at metaboliske analysatorer kan måle O2 og CO2 uden at have co2 opbygget i kammermiljøet, hvilket indebærer en risiko for et skiftende åndedrætsmønster. På samme måde skal gasmixer/analysatorkalibreringer regelmæssigt implementeres for at sikre, at de metaboliske parametre måles nøjagtigt.
Andre overvejelser for bevidst UBP omfatter reducere distraktioner i forsøgsrummet, mens dyr bliver testet. Høje lyde, forskellige lugte, og tilstedeværelsen af uvæsentlige personale i rummet kan alle føje til ængstelige adfærd udstillet af mus. Brug af mindre rum som testområder kan hjælpe, men hvis dette ikke er muligt, kan der sættes papvægge (med et lille vindue) op omkring kammeret for at mindske distraktioner for musene. Elektrisk aktivitet i rummet bør holdes på et minimum for at forhindre yderligere støj inden for barometerplethysmografi tracings. Derfor er det vigtigt at notere sig flowsporingerne i løbet af 10 min perioden, hvor softwaren indsamler data fra et tomt kammer. Disse sporinger bør forblive flade, og eventuelle afbrydelser eller små bølger er tegn på støj og bør behandles. Trykændringer fra åbne og lukkedøre eller fra HVAC funktion kan også føje til fejlagtige udsving, og sikre, at disse handlinger sker minimalt (og bemærke dem, når de opstår) er kritisk. Fugtighed kan også påvirke den beregnede tidevandsvolumen og minutters ventilation, hvilket gør det meget vigtigt at bekræfte, at kammeret og tilslutningsrør tørres før brug. Hvis det er nødvendigt, kan brugen af Drierite perler i rækkefølge med flow-in rør hjælpe med at fjerne al kondens i luften før kammer indgangen. Dette trin vil blive indført i tilfælde, hvor luftfugtigheden rutinemæssigt har været højere end de niveauer, der er anført i The Guide for care and use of Animals8 (30%-70%, ideelt inden for 10% af setpoint). Fugtighed kan også opbygge i kammeret på grund af tilstedeværelsen af dyret. Selv om en vis luftfugtighed er normal, kan det fortsætte med at bygge, hvis dyret er alt for aktiv eller placeret i kammeret i længere tid. Hvis luftfugtigheden når maksimale niveauer (99,99%), kan det være nødvendigt at åbne og tørre kammeret ned under forsøg for at opretholde sammenlignelige vejrtrækningsforanstaltninger. Softwaren tegner sig for ændringer i barometertryk, omgivende temperatur, dyretemperatur og fugtighed. Bedste praksis er at opretholde værdierne inden for et rimeligt interval, således at "æbler til æbler" sammenlignes på tværs af aldre, stammer og køn. Desuden er den cirkadiske cyklus af mus og tidsintervallet for test, samt specifikke lysforhold i rummet, vigtige detaljer at overveje13,17. For eksempel tester vi typisk mus i belysning svarende til deres boligområde (enten lys eller mørk cyklus) og inden for en 3 h rækkevidde18. Forsøgspersonerne bør også forblive blinde for dyregrupperne under dataindsamling og analyser for at forhindre forskelle i udvælgelsen af en basislinje. Når det er muligt, skal den samme eksperimentator indsamle alle data og/eller analysere alle sporinger i et givet eksperiment. Skridt til at holde eksperimentatorer blændet til dyregrupper, samt randomisering og test i lignende tidspunkter af dagen, er afgørende for den stringens af undersøgelsen. I sidste ende er der uvedkommende faktorer, der kan ændre flow sporinger, og disse bekymringer bør overvejes, når de udfører UBP.
UBP-metoden er en teknik, der bruges til at karakterisere åndedrætsmønsteret hos mus. Baseline foranstaltninger kan indsamles inden for 2 timer, når du bruger en 15 s vejrtrækning segment. Her rapporterer vi en metode, der kan udføres med alderen mus, der ofte er mere ophidset i kammeret end yngre mus, hvilket tyder på, at andre ængstelige eller aktive musestammer også kunne testes med denne protokol. De data, der indsamles fra UBP er noninvasive og giver mulighed for test over flere tidspunkter, hvilket er nyttigt for undersøgelser om aldring, medicinsk behandling, og sygdomsprogression.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Angela Le, Sarah Ruby, og Marisa Mickey for deres arbejde med at opretholde de animalske kolonier. Dette arbejde blev finansieret af 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. til støtte for CNR) og McDevitt Undergraduate Research Fellowship in Natural Sciences (BEE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
- DeRuisseau, L. R., et al. Neural deficits contribute to respiratory insufficiency in Pompe disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (23), 9419-9424 (2009).
- Ogier, M., et al. Brain-derived neurotrophic factor expression and respiratory function improve after ampakine treatment in a mouse model of Rett syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10912-10917 (2007).
- Ohshima, Y., et al. Hypoxic ventilatory response during light and dark periods and the involvement of histamine H1 receptor in mice. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1350-1356 (2007).
- van Schaik, S. M., Enhorning, G., Vargas, I., Welliver, R. C. Respiratory syncytial virus affects pulmonary function in BALB/c mice. Journal of Infectious Diseases. 177 (2), 269-276 (1998).
- Glaab, T., Taube, C., Braun, A., Mitzner, W. Invasive and noninvasive methods for studying pulmonary function in mice. Respiratory Research. 8, (2007).
- Loeven, A. M., Receno, C. N., Cunningham, C. M., DeRuisseau, L. R. Arterial Blood Sampling in Male CD-1 and C57BL/6J Mice with 1% Isoflurane is Similar to Awake Mice. Journal of Applied Physiology. , Bethesda, MD. (2018).
- Receno, C. N., Eassa, B. E., Reilly, D. P., Cunningham, C., DeRuisseau, L. R. The pattern of breathing in young wild type and Ts65Dn mice during the dark and light cycle. FASEB Journal. 32 (1), (2018).
- Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, Inistitute fpr Laboratory Animal Research, Division on Earth and Life Studies, National Research Council of the National Academies. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th edition. , National Academies Press. Washington, DC. (2011).
- Receno, C. N., Glausen, T. G., DeRuisseau, L. R. Saline as a vehicle control does not alter ventilation in male CD-1 mice. Physiological Reports. 6 (10), (2018).
- Shanksy, R. M. Sex differences in behavioral strategies: Avoiding interpretational pitfalls. Current Opinion in Neurobiology. 49, 95-98 (2018).
- Kopp, C. Locomotor activity rhythm in inbred strains of mice: implications for behavioural studies. Behavioural Brain Research. 125 (1-2), 93-96 (2001).
- Teske, J. A., Perez-Leighton, C. E., Billington, C. J., Kotz, C. M. Methodological considerations for measuring spontaneous physical activity in rodents. American Journal of Physiology-Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 306 (10), 714-721 (2014).
- Kabir, M. M., et al. Respiratory pattern in awake rats: Effects of motor activity and of alerting stimuli. Physiology & Behavior. 101 (1), 22-31 (2010).
- Terada, J., et al. Ventilatory long-term facilitation in mice can be observed during both sleep and wake periods and depends on orexin. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 499-507 (2008).
- Friedman, L., et al. Ventilatory behavior during sleep among A/J and C57BL/6J mouse strains. Journal of Applied Physiology. 97 (5), 1787-1795 (2004).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Seifert, E. L., Mortola, J. P. The circadian pattern of breathing in conscious adult rats. Respiration Physiology. 129 (3), 297-305 (2002).
- Receno, C. N., Roffo, K. E., Mickey, M. C., DeRuisseau, K. C., DeRuisseau, L. R. Quiet breathing in hindlimb casted mice. Respiratory Physiology & Neurobiology. , 10 (2018).
