Summary
La pletismografia barometrica non vincolata viene utilizzata per quantificare il modello di respirazione nei topi svegli. Mostriamo che 15 segmenti s sotto un protocollo standardizzato visualizzano valori simili a una durata prolungata di respirazione silenziosa. Questa metodologia consente anche la quantificazione di apnea e respiri aumentati durante la prima ora nella camera.
Abstract
La pletismografia barometrica sfrenata (UBP) è un metodo per quantificare il modello di respirazione nei topi, dove la frequenza respiratoria, il volume delle maree e la ventilazione minuti sono regolarmente segnalati. Inoltre, le informazioni possono essere raccolte per quanto riguarda l'uscita neurale della respirazione, compresa l'esistenza di apnee centrali e respiri aumentati. Una considerazione importante per UBP è ottenere un segmento respiratorio con un impatto minimo di comportamenti ansiosi o attivi, per chiarire la risposta alle sfide respiratorie. Qui, presentiamo un protocollo che permette di ottenere linee di base brevi e tranquille in topi invecchiati, paragonabili ad aspettare periodi più lunghi di respirazione tranquilla. L'uso di segmenti di tempo più brevi è prezioso, poiché alcuni ceppi di topi possono essere sempre più eccitabili o ansiosi, e periodi più lunghi di respirazione tranquilla potrebbero non essere raggiunti entro un lasso di tempo ragionevole. Abbiamo collocato topi di 22 mesi in una camera UBP e abbiamo confrontato quattro segmenti di respirazione tranquilla di 15 s tra i minuti 60-120 a un periodo di respirazione tranquillo più lungo di 10 minuti che ha richiesto 2-3 h per l'acquisizione. Abbiamo anche ottenuto conteggi di apnee centrali e respiri aumentati prima dei segmenti di respirazione tranquilla, dopo un periodo di familiarizzazione di 30 minuti. Dimostriamo che 10 min di respirazione tranquilla è paragonabile all'utilizzo di una durata di 15 s molto più breve. Inoltre, il tempo che porta a questi segmenti di respirazione silenziosa di 15 s può essere utilizzato per raccogliere dati riguardanti le apnee di origine centrale. Questo protocollo consente agli investigatori di raccogliere dati di respirazione in un determinato lasso di tempo e rende possibili misure di base silenziose per i topi che possono presentare una maggiore quantità di comportamento eccitabile. La stessa metodologia UBP fornisce un modo utile e non invasivo per raccogliere dati di pattern-of-breathing e consente ai topi di essere testati su diversi punti temporali.
Introduction
UBP è una tecnica comune per la valutazione dei modelli respiratori1,2,3,4. In questo metodo, i topi vengono collocati in una camera chiusa dove le differenze di pressione tra la camera principale (dove l'animale è ospitato) e una camera di riferimento vengono filtrate attraverso uno pneumotacografo per ottenere valori. La configurazione UBP risultante è non invasiva e non vincolata e consente di valutare le misure respiratorie senza la necessità di anestesia o chirurgia. Inoltre, questa tecnica è adatta per studi che richiedono più misurazioni nello stesso mouse nel tempo. Variabili come la frequenza respiratoria, il volume delle maree e la ventilazione minuti possono essere quantificate con questo metodo, durante un singolo studio o in più prove. L'UBP di tutto il corpo fornisce anche misure dei flussi di picco e della durata del ciclo respiratorio. Insieme, questi parametri quantificano il modello di respirazione. Le tracce respiratorie registrate consentono inoltre di esaminare i dati e contare il numero di apnee centrali visualizzate entro un determinato periodo di tempo. Questo conteggio può essere utilizzato insieme ad un'analisi del volume delle maree e dei tempi di inspirazione per misurare altre alterazioni del modello di respirazione.
Sebbene esistano diverse tecniche di pletismografia non invasiva per la valutazione diretta dei parametri fisiologici polmonari, l'UBP per tutto il corpo consente di valutare la funzione respiratoria con uno stress indebito minimo per il topo. Pletismografia a testa in testa, che utilizza misure di flusso midexpiratory di marea ed è anche non invasiva, si basa sulla moderazione, come molti altri tipi di pletismografia (ad esempio, pletismografia a doppia camera). Mentre questi metodi sono stati utilizzati nei modelli di roditori per misurare la reattività delle vie aeree5, l'uso di collari del collo o piccoli tubi di ritenuta può prendere topi (vs. altre specie) più a cclimato e tornare la loro respirazione a livelli di riposo.
Ottenere un segmento ottimale di respirazione dell'aria è una considerazione importante per i confronti di base. L'aumento dell'uso di sistemi di pletismografia disponibili in commercio rende possibile la raccolta di dati di pattern of breathing in molti laboratori. È importante sottolineare che il modello di respirazione è variabile per tutto il periodo di raccolta, in particolare per i topi. Detto questo, è necessario standardizzare l'analisi di base come mezzo per garantire che il livello di formazione degli sperimentatori non confonda i risultati. Ci sono numerosi modi per raccogliere un segmento di respirazione dell'aria, che serve come un'area di variazione tra i disegni sperimentali. Un esempio include la media dell'ultimo 10-30 min di dati che seguono un insieme di tempo definito in precedenza all'interno della camera1, mentre un altro metodo prevede l'attesa fino a quando il mouse è visibilmente calmo per 5-10 min6. Quest'ultimo può richiedere 2-3 h per raggiungere e in alcuni casi, una prova potrebbe essere necessario abbandonare se il mouse non è calmo abbastanza a lungo. Questa preoccupazione è una considerazione particolarmente importante per i ceppi di topi in cui i comportamenti osservati sono più ansiosi ed eccitabili7. Questi topi possono richiedere più tempo per adattarsi all'ambiente della camera e rimanere calmi solo per brevi raffiche di tempo. Limitare il tempo dedicato alla raccolta della linea di base standardizza il tempo della camera per ogni mouse.
È fondamentale che gli sperimentatori ottengano una linea di base adatta che comprenda i valori di comportamento a riposo nel mouse, ma che si verifichino anche in modo tempestivo. Pertanto, l'obiettivo di questo rapporto è fornire una descrizione dei metodi utilizzati per ottenere brevi valori di base silenziosi per la respirazione dei parametri nei topi. Inoltre, riportiamo che le apnee e i respiri aumentati possono essere quantificati durante la prima ora in camera.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Le Moyne College. Tutto l'uso degli animali era in accordo con le politiche descritte nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio8.
NOTA: (Critico) Prima della sperimentazione, ottenere tutte le approvazioni e la formazione necessarie per l'uso degli animali. È importante che gli sperimentatori abbiano familiarità con i comportamenti e i livelli di attività del mouse, inclusi i segni di sonno, angoscia e/o artefatto di movimento rispetto al normale sniffing e respirazione.
1. Camera di Pletismografia Barometrica dell'intero corpo
- Leggere i manuali utente appropriati per la camera di pletismografia barometrica, inclusi connettori, o-anelli, ecc., e creare un file di protocollo standard per definire gli analizzatori (ad esempio, metabolici) e i parametri specifici del software.
- Assicurarsi che tutti i tubi flessibili e i tubi siano collegati alla camera. Collegare un tubo di flusso del gas (flow-in) e un tubo sottovuoto (flusso- out) direttamente alla camera di pletismografia barometrica.
NOT: L'afflusso deve essere collegato al flusso di distorsionecontrassegnato dall'apertura. - Attaccare i serbatoi di gas CO2, O2e N2 al miscelatore di gas. Assicurarsi che tutti i serbatoi di gas siano in posizione aperta prima della sperimentazione.
2. Calibrazione della camera pletismografica barometrica
- Calibrare un flusso elevato e basso di gas selezionando l'impostazione 7700-Amplifier nella scheda Hardware del software di pletismografia barometrica.
- Impostare un vuoto (flusso fuori dalla camera) appropriato per la progettazione sperimentale e gli analizzatori di gas (0,1 L/min).
NOT: Il tasso di deflusso deve rimanere lo stesso per tutta la durata delle calibrazioni e sperimentare registrazioni metaboliche accurate. - Impostare un flusso d'aria basso rimuovendo il tubo di flusso dalla camera e spegnendo il vuoto.
- Registrare il flusso zero immettendo uno 0 nella cella Unità bassa per la camera corrispondente. Fare doppio clic sulla cella Cal basso, modificare l'ora in 3 s e premere Misura.
- Ricollegare il tubo di flusso e consentire al gas (20,93% O2, bilanciato N2) di fluire attraverso la camera di pletismografia barometrica dal miscelatore di gas.
- Convertire l'afflusso da litri/minuti in millilitri/secondo. Fare clic sulla cella Unità alta per la camera corrispondente e immettere il valore in millilitri al secondo. Fare doppio clic su High Cal, modificare l'ora in 3 s e fare clic su Misura.
- Lasciare aperta la scheda Impostazione amplificatore 7700 per calibrare gli analizzatori metabolici al software di pletismografia barometrica.
3. Calibrazione dell'analizzatore metabolico
- Nel programma di miscelazione del gas, impostare il miscelatore di gas per rilasciare un flusso di gas contenente 20.93% O2 e 79.07% N2.
- Sugli analizzatori metabolici, impostare il livello di calibrazione O2 al 20,93% e il CO2 per leggere 0%. Riportare il quadrante su Campione una volta immessi i valori appropriati.
- Impostare la percentuale alta O2. Fare clic sulla scheda ABCD-4 del software di pletismografia barometrica, quindi immettere 20,93 sotto Unità alta della linea C2. In High Cal, cambiare il tempo a 3 s e premere Misura.
- Impostare la bassa percentuale di CO2. Immettere 0 in Basso Cal della linea C3, quindi modificare l'ora in 3 s e fare clic su Misura in Cal basso.
- Nel programma di miscelazione del gas, modificare il valore O2 al 10% e il valore di CO2 al 5%. Attendere alcuni minuti che il flusso di gas si adatti a questi valori. Sugli analizzatori metabolici, ruotare le manopole di regolazione per calibrare CO2 uguale al 5%. Assicurarsi di riportare il quadrante in Campione una volta calibrati i valori.
- Impostare l'alta percentuale di CO2. Assicurarsi che le letture dell'analizzatore siano stabili prima di inserire valori appropriati nell'O2 e CO2 nel software barometrico di pletismografia. Fare clic su Unità alta sotto C3 e immettere 5. Cambia High Cal a 3 s e premi Misura.
- Impostare la bassa percentuale O2. Fare clic su Unità bassa sotto l'opzione C2 e immettere 10. Fare clic su Low Cal, immettere 3 s e fare clic su Misura.
- Modificare i valori del gas sul miscelatore di gas al 20,93% O2 e 79.07% N2. Attendere alcuni minuti che la camera si adatti a questi valori. Ripetere i passaggi 3.1 -u20123.7 se gli analizzatori metabolici non leggono automaticamente 20,93% O2 e 0% CO2, per garantire la corretta calibrazione. Confermare regolarmente la corretta calibrazione con serbatoi di gas certificati.
- Ricontrollare i misuratori di flusso collegati alla camera di pletismografia barometrica. Regolare il flusso d'aria dentro e fuori dalla camera alle velocità appropriate per l'esperimento (in genere, 0,1–0,3 L/min).
- Una volta applicate tutte le impostazioni al software di pletismografia barometrica, fare clic su OK per iniziare la registrazione.
4. Pletimografia barometrica sfrenata
- Registrare il peso del mouse e la temperatura corporea iniziale. Attendere 10 min prima di posizionare il mouse nella camera, per raccogliere i dati O2 e CO2 da una camera vuota. Lavorare in una zona tranquilla familiare ai topi in modo che il rumore e gli odori non interferiscano con la raccolta dei dati. Evitare possibili interruzioni, tra cui l'apertura e la chiusura delle porte o del personale che si sposta all'interno e all'esterno della sala di raccolta dati.
NOT: Questo protocollo specifico impiegava il topo C57BL/6J di 22 mesi. - Durante la prima ora, documentare i comportamenti del mouse e prendere appunti dettagliati, compresi i valori specifici del flusso dentro/fuori dalla camera.
- Dopo 60 min di assuefazione da camera, guardare per i segmenti di respirazione tranquilla per i seguenti 60 min. Elencare tutti i segmenti della durata di almeno 15 s di lunghezza senza annusare e toelettare. Prendere misure di temperatura corporea ogni 10 min quando si utilizza un dispositivo impiantabile.
- Alla fine dell'esperimento, rimuovere il mouse dalla camera e rimetterlo nella sua gabbia. Tutte le attrezzature devono essere pulite e spazzate via accuratamente. Se rimangono goccioline d'acqua, utilizzare l'aria pressurizzata per rimuoverle.
5. Analisi del modello di respirazione e metabolismo
- Aprire il file di revisione della plitismo barometrica e consultare le note registrate per l'animale di interesse.
- Aprire il pannello Metabolico nel software e prendere la media dei primi 10 min di O2 e CO2, quando la camera era vuota. Registrare questi valori come FiO2 e FiCO2.
- Visualizzare il pannello Flusso del software di pletismografia barometrica. Fare clic con il pulsante destro del mouse su Analizza attributi e impostare i parametri appropriati. Nella scheda Meta 1, inserire FiO2 e FiCO2 del passaggio 5.2, nonché il flusso nella camera sotto Meta 2, per calcolare VO2 e VCO2.
- Per il modello di analisi della respirazione, confermare i tempi per i 15 secondi di respirazione tranquilla utilizzando note sul comportamento animale e il tracciato del pannello di flusso. Immettere gli orari per gli intervalli di 15 s di respirazione Parser View Mode silenziosa in Open Data Parser Dialogue dalla scheda Data Parser.
- Fare clic su Salva dati derivati analizzati. Aprire il file di dati in un foglio di calcolo per ottenere i dati collocati.
6. Analisi di Apnee e Respiri Aumentati
- Nel file di revisione aperto, uscire dalla modalitàdi visualizzazione del parser . Passare all'opzione Impostazione grafico in Impostazione > Impostazione P3 e selezionare Vista pagina in Tipo. Selezionare 5 per il numero di riquadri. Immettere -2 nella casella Bassa e 2 nella casella Alta per le misure di flusso in millilitri/secondo. Applicare le modifiche.
- Scorrere fino al contrassegno di 30 minuti nel pannello di tracciamento del flusso.
- Contare apnee e respiri aumentati per i 30-60 min dopo che il topo è stato posto nella camera. Quantificare i periodi di respirazione sospesa che durano più a lungo o uguale a 0,5 s, indicativo di un'apnea. I respiri aumentati sono indicati da un forte aumento della traccia respiratoria superiore a 1,25 mL/s, seguito da una forte diminuzione al di sotto di -0,75 mL/s.
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Representative Results
I risultati di UBP come valutazione del modello di respirazione in topi di età compresa tra 16 (22 mesi) eseguiti con gas d'aria normale (20,93% O2 con bilanciato N2)sono riportati. L'analisi ha incluso un confronto tra un segmento di respirazione silenziosa di 10 minuti più lungo (che ha richiesto più di 2 h per ottenere) rispetto alla media di quattro brevi segmenti di 15 s (quantificati in pochi minuti 60–120). Nella Figura 1Aè riportato un flusso rappresentativo della respirazione tranquilla, in cui la respirazione è coerente con l'inademazione di un comportamento respiratorio attivo. Quando tracce simili vengono raccolte dagli animali, il 100% dei respiri deve essere accettato dal software. Tuttavia, Figura 1B rappresenta la respirazione da un segmento più attivo, in cui i topi stanno esplorando la camera, sniffing, e / o toelettatura. I tracciati simili a quelli illustrati nella Figura 1B hanno meno probabilità di essere accettati dal software e non sono ideali per il tipo di raccolta respiratoria utilizzato e spiegato da questa metodologia. I parametri selezionati per la valutazione dei possibili differenze di respirazione tra i due punti temporali erano lafrequenzadi respirazione ( Figura 2A), il volume di marea (VT, Figura 2B), ventilazione dei minuti (VE, Figura 2C), rapporto di tempo di marea (VT/Ti, Figura 2D) e rapporto di biossido di carbonio per ventilazione minuti/espulsi(VE/VCO2/g, Figura 2E), tutti calcolati utilizzando il software barometrico di pletpiraegrafia e l'equazione di Drorbaugh e Fenn. I valori riportati per queste misure sono compresi nell'intervallo di quanto abbiamo precedentemente riportato per il modello del mouse6,9. Nessuna differenza significativa è stata chiarita tra i gruppi; Correzioni post hoc per confronti multipli di frequenza respiratoria e dati VT sono stati contabilizzati con Bonferroni (p < 0.025 è stato considerato significativo). Questi risultati mostrano che l'uso di un protocollo semplificato utilizzando linee di base 15 s fornisce risultati simili a quelli di un protocollo di base più lungo.
Sono state eseguite ulteriori analisi con ciascuno dei quattro segmenti di base 15 s per la frequenza, VT, VE, VT/Ti e VE/VCO2/g (Figura 3). Non sono state trovate differenze significative (p > 0,05) tra uno qualsiasi dei punti temporali. Inoltre, non vi erano differenze nella variabilità tra uno qualsiasi dei quattro segmenti temporali per qualsiasi misura di respirazione. Inoltre, abbiamo testato la variabilità del segmento del gruppo 15 s rispetto al gruppo di 10 min e non abbiamo trovato differenze significative utilizzando il test di Levene quando abbiamo confrontato i dati medi del gruppo.
Il numero di apnee e respiri aumentati osservati per ogni animale durante i verbali 30-60 del protocollo UBP sono presentati nella Figura 4. Questi risultati mostrano che gli animali anziani mostrano un elevato numero di apnee e la presenza di respiri aumentati all'interno di un intervallo di 30 min (traccia mostrata nella Figura 1C). I dati sono indicativi di cambiamenti durante il processo di invecchiamento, come questi risultati sono stati osservati in topi di 22 mesi. Per confermare l'affidabilità interrater per le analisi dell'apnea e dell'alito aumentato, la correlazione di Pearson è stata calcolata per due diversi ricercatori. È stato trovato un alto grado di accordo tra i tassi, come indicato da un valore di r - 0,99 per le apnee e r - 0,86 per i respiri aumentati. In studi futuri, un aumento del numero di apnee rispetto a un gruppo di controllo sarebbe raccontare di una disfunzione respiratoria derivante da una componente neurale.
Figura 1:Rappresentazione delle tracce diflusso. (A) Tracciadiflusso da una linea di base tranquilla, in cui il mouse non mostra alcun comportamento attivo come sniffing o toelettatura. (B) Tracciamento del flusso da un periodo di respirazione attiva non incluso nelle nostre analisi, in cui i topi si muovono sulla camera e molti respiri non sono regolarmente accettati. (C) Tracciamento del flusso che mostra un respiro aumentato seguito da un periodo di apnea. Viene visualizzata una finestra di 5 s per tutte le tracce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: I parametri direspirazione sono simili per i segmenti di respirazione calma di 10 min e 15 s in topi di 22 mesi. La pletismografia barometrica è stata utilizzata pern raccogliere dati respiratori nei topi di età compresa tra 16, 22 mesi. I dati di respirazione sono stati calcolati per i topi durante due diversi punti temporali, vale a dire la media di quattro intervalli di 15 s calmi all'interno del segno di 60-120 minuti del topo nella camera e per 10 minuti di respirazione calma costante. (A)Frequenza respiratoria (respiri/minuto). (B) Volume di marea (VT; millilitri/respiro). (C) Ventilazione verbale (VE; millilitri/minuto). (D) Rapporto tra volume delle maree e tempo di ispirazione (VT/Ti; millilitri/secondo). (E) Rapporto tra ventilazione miea e anidride carbonica espulsa, normalizzata a peso (VE/VCO2/g). Non ci sono differenze statisticamente significative tra i gruppi dopo le correzioni post hoc (p > 0.025). I valori di >3 SD al di sopra della media sono stati considerati outlier e rimossi dal set di dati. I dati sono presentati come media : SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Confronto di quattro intervalli di 15 s. I dati respiratori sono stati calcolati in topi respiratori calmi(n : 16, 22 mesi) per quattro intervalli separati di 15 s entro i 60-120 min di posizionamento della camera. (A)Frequenza respiratoria (respiri/minuto). (B) Volume di marea (VT; millilitri/respiro). (C) Ventilazione verbale (VE; millilitri/minuto). (D) Rapporto tra volume delle maree e tempo di ispirazione (VT/Ti; millilitri/secondo). (E) Rapporto tra ventilazione miea e anidride carbonica espulsa, normalizzata a peso (VE/VCO2/g). Non esistono differenze statisticamente significative tra i segmenti temporali (p > 0,05). Gli outlier sono definiti come >3 SD sopra la media e rimossi. I dati sono presentati come media : SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Apnea e numero di aliti aumentati nei topi. Gli apnei (0,5 s senza respirare) e i respiri aumentati (Ab; un forte aumento dell'inalazione superiore a 1,25 mL/s seguito da un'espirazione acuta inferiore a -0,75 mL/s) sono stati conteggiati in topi invecchiati(n : 16, 22 mesi) tra i 30 e i 60 min. I conteggi sono stati analizzati su 30 min e il totale per quel periodo di tempo sono segnalati. I dati sono presentati come media : SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Schematica dell'impostazione di pletismografia barometrica sfrenata (UBP). L'impostazione complessiva di UBP dovrebbe essere simile a quella descritta nella figura. Le misurazioni del flusso devono essere misurate per i gas che entrano ed escono dalla camera e la composizione del gas deve essere nota per l'interpretazione dei dati. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo fornisce informazioni riguardanti una linea di base di respirazione silenziosa nei topi, oltre a raccogliere dati sulle apnee centrali e sui respiri aumentati. I risultati rappresentativi mostrano che una linea di base tranquilla di 10 min ha un modello di respirazione simile rispetto a una media di quattro s bouts per una coorte di vecchi topi. È importante sottolineare che gli out 15 s non sono statisticamente diversi, né questi gruppi hanno differenze di variazione l'uno dall'altro utilizzando il test di Levene. Questi dati dimostrano che anche un breve incontro è sufficiente per monitorare la respirazione silenziosa. Tuttavia, è del tutto possibile che l'analisi della variazione individuale all'interno di un topo a 15 s vs. 10 min può provocare diversi risultati, come l'incontro di 10 min potrebbe comprendere le attività di sniffing e toelettatura minimo. Tuttavia, l'utilizzo del test di Levene per un confronto dei singoli segmenti di base del mouse fornisce un'analisi diversa da quella descritta in questo protocollo. Nel complesso, la progettazione di questa metodologia utilizza segmenti respiratori di 15 s che possono essere acquisiti durante i minuti 60-120 nella camera, rispetto a dover attendere che ogni topo raggiunga durate più lunghe di linea di base tranquilla.
La durata più breve richiesta per la linea di base consente di testare ceppi di topi più ansiosi/agitati per una respirazione tranquilla. L'uso di un segmento di respirazione più lungo (cioè 10 o 2 min) allunga la durata del protocollo, fino al punto in cui potrebbe essere necessario abbandonare una prova se i topi non visualizzano una traccia respiratoria silenziosa entro 3 h. Poiché molti progetti sperimentali incorporano anche sfide respiratorie (cioè l'ipossia), il tempo prolungato assegnato ad altri gas evidenzia la necessità di standardizzare il tempo di raccolta di base. L'uso di un singolo 15 s bout di respirazione tranquilla aiuta ad alleviare la preoccupazione di lavorare con topi (e ceppi di topi) che possono essere particolarmente eccitabili nella camera. Lavorando con la pletismografia barometrica, abbiamo scoperto che il 10% dei topi per studio doveva essere escluso a causa della loro incapacità di eseguire appena 2 min di respirazione silenziosa continua all'interno della camera. L'implementazione di precedenti prove di familiarizzazione non è riuscita a far calmare i topi più velocemente quando sono stati collocati nella camera il giorno della sperimentazione. Tuttavia, poiché diversi ceppi, sessi e età dei topi possono tutti reagire in modo diverso all'ambiente della camera10,11, è possibile che le tecniche di assuefazione possono essere utili12,13 per alcune coorti. I nostri studi di familiarizzazione consistevano nel collocare i topi nella camera UBP nella sala prove per 1-2 h per diversi giorni prima della sperimentazione. Mentre non abbiamo osservato cambiamenti nel comportamento animale a seguito di questa procedura, uno studio precedente ha dimostrato che 24 h di assuefazione era necessario per eliminare gli effetti di novità con conseguente attività fisica spontanea nei topi12. Inoltre, Kabir ealtri hanno scoperto che posizionare cilindri di plastica di dimensioni simili alla camera barometrica di pletismografia nella gabbia di casa era vantaggioso nel convincere i ratti a familiarizzare con le configurazioni prima della sperimentazione13.
Questo protocollo scopre anche possibili disfunzioni respiratorie nei topi attraverso la quantificazione delle apnee centrali, indicativo di problemi di controllo neurale. Trenta minuti di osservazione prima della raccolta di modelli di respirazione del modello di base hanno mostrato che tutti i 16 topi di età hanno mostrato un elevato numero di episodi apneici e respiri aumentati (rappresentati nella Figura 1C). Le numerose apnee in questa coorte di topi invecchiati evidenziano la capacità di questo protocollo di quantificare un'altra importante misura respiratoria senza aggiungere ulteriore tempo alla sperimentazione. Va notato che l'età e la progressione della malattia (se applicabile) possono influenzare la presenza e il numero di episodi apneici.
Al fine di caratterizzare la respirazione tranquilla, è importante osservare continuamente la camera di pletismografia barometrica e il topo per tutta la durata del protocollo. Per la quantificazione della respirazione tranquilla, i topi devono essere svegli ma non partecipare a comportamenti attivi come sniffing, toelettatura o esplorazione (rappresentata nella Figura 1A). Dal momento che i modelli di respirazione durante il sonno possono differire da quelli in un animale sveglio14,15, la raccolta di respirazione calma durante lo stato di veglia è fondamentale. È possibile che segmenti più lunghi di respirazione tranquilla possano includere periodi di sonno, che potrebbero non essere desiderati a seconda del progetto sperimentale. In questo caso, segmenti più brevi di respirazione silenziosa sarebbero ideali per documentare, poiché la probabilità di raccolta dei dati durante il sonno si riduce quando i segmenti attivi fiancheggiano i segmenti di respirazione tranquilla brevi (15 s). Abbiamo osservato che segmenti più lunghi di respirazione silenziosa possono essere difficili da acquisire nel modello murino, poiché il comportamento del topo nella camera sembra essere molto diverso rispetto a quello dei ratti. È importante sia osservare criticamente il flusso respiratorio dei topi per i segmenti respiratori appropriati sia documentare il comportamento degli animali. In caso di ventilazione ridotta o respirazione instabile, questo metodo può ancora essere utilizzato. In questi casi, è essenziale che lo sperimentatore sia accecato alla coorte quando si selezionano i segmenti 15 s. Il programma software dovrebbe distinguere i respiri, con un tasso di accettazione del 100% durante il periodo 15 s. Si consiglia di prendere nota dei tracciamenti respiratori oltre a garantire che gli animali soddisfino i criteri comportamentali per la linea di base, poiché è possibile che i topi fissi siano ancora ansiosi. Uno studio precedente ha riferito che anche se i ratti mostravano un comportamento calmo, mostravano ancora alterati schemi respiratori (cioè, una maggiore frequenza) in risposta a stimoli controllati all'interno della sala prove13.
Le misure di frequenza, VT, VE, tempo inspiratorio ed espiratorio, e VE/VCO2 sono tutte quantificate utilizzando analizzatori e il software UBP e sono spesso riportate nella letteratura. In particolare, i calcoli VT e VE utilizzano l'equazione di Drorbaugh e Fenn16, che richiede valori noti per la temperatura corporea, la temperatura della camera ambiente, l'umidità e la pressione barometrica. Si raccomanda di raccogliere queste misure durante l'esperimento per i valori VT e VE più accurati. Altre variabili calcolate dal sistema devono essere utilizzate con cautela. UBP non è una misura diretta della meccanica polmonare; pertanto, le variabili relative alla resistenza delle vie aeree (ad esempio, una pausa avanzata [Penh]) devono essere interpretate con questo avvertimento in mente5. Ulteriori componenti dell'impostazione UBP che possono avere un impatto sulle variabili calcolate dal software includono le portate e la calibrazione generale del sistema. Verificare che le guarnizioni e le guarnizioni funzionino correttamente (senza perdite) e garantire il collegamento corretto di tutte le attrezzature alla camera di pletismografia barometrica (Figura 5). Le velocità di flusso all'esterno e all'esterno della camera devono essere mantenute coerenti. Le velocità di flusso richieste possono variare tra le impostazioni UBP, quindi è importante controllare questi valori prima della sperimentazione. La portata nella camera dovrebbe essere sufficiente a fornire l'aria fresca o le sfide del gas in modo tempestivo. La portata dovrebbe anche essere sufficiente per consentire agli analizzatori metabolici di misurare O2 e CO2 senza che si accumulino CO2 all'interno dell'ambiente della camera, il che rappresenta il rischio di un cambiamento del modello di respirazione. Allo stesso modo, le calibrazioni del mixer/analizzatore di gas devono essere regolarmente implementate per garantire che i parametri metabolici siano misurati con precisione.
Altre considerazioni per UBP cosciente includono la riduzione delle distrazioni all'interno della stanza sperimentale mentre gli animali sono in fase di test. Rumori forti, odori diversi e la presenza di personale non essenziale nella stanza possono tutti aggiungere ai comportamenti ansiosi esposti dai topi. L'utilizzo di locali più piccoli come aree di prova può essere utile, ma se ciò non è possibile, è possibile impostare pareti di cartone (con una piccola finestra panoramica) che circondano la camera per ridurre le distrazioni per i topi. L'attività elettrica all'interno della stanza deve essere mantenuta al minimo per evitare ulteriori rumori all'interno dei ricorsi barometrici della pletismografia. Pertanto, è importante prendere nota delle analisi di flusso durante il periodo di 10 min quando il software sta raccogliendo dati da una camera vuota. Queste tracce dovrebbero rimanere piatte, e qualsiasi interruzione o leggera onda sono segni di rumore e dovrebbero essere affrontati. I cambiamenti di pressione derivanti dall'apertura e dalla chiusura delle porte o dal funzionamento dell'HVAC possono anche aumentare le fluttuazioni errate e garantire che queste azioni si verifichino minimamente (e annogarle quando si verificano) è fondamentale. L'umidità può anche influenzare il volume di marea calcolato e la ventilazione dei minuti, il che rende molto importante confermare che la camera e i tubi di collegamento vengono essiccati prima dell'uso. Se necessario, l'uso di perline Drierite in sequenza con i tubi flow-in può aiutare a rimuovere tutta la condensa nell'aria prima dell'ingresso della camera. Questo passaggio sarebbe istituito nei casi in cui l'umidità è stata regolarmente superiore ai livelli elencati nella Guida per la cura e l'uso degli animali8 (30%-70%, idealmente entro il 10% del setpoint). L'umidità può anche accumularsi nella camera a causa della presenza dell'animale. Anche se una certa umidità è normale, può continuare a costruire se l'animale è eccessivamente attivo o collocato nella camera per periodi più lunghi. Se i livelli di umidità raggiungono livelli massimi (99,99%), potrebbe essere necessario aprire la camera e abbassarla durante la sperimentazione per mantenere misure respiratorie comparabili. Il software tiene conto dei cambiamenti nella pressione barometrica, nella temperatura ambiente, nella temperatura animale e nell'umidità. La procedura consigliata consiste nel mantenere i valori all'interno di un intervallo ragionevole in modo che le "mele alle mele" vengano confrontate tra età, ceppi e sessi. Inoltre, il ciclo circadiano dei topi e la gamma temporale dei test, così come le specifiche condizioni di illuminazione della stanza, sono dettagli importanti da considerare13,17. Ad esempio, in genere testiamo i topi nell'illuminazione simile alla loro stanza di alloggiamento (ciclo chiaro o scuro) e all'interno di una gamma di 3 h18. Gli sperimentatori dovrebbero anche rimanere accecati ai gruppi animali durante la raccolta e le analisi dei dati per evitare differenze nella selezione di una linea di base. Quando possibile, lo stesso sperimentatore deve raccogliere tutti i dati e/o analizzare tutte le tracce in un determinato esperimento. I passi per tenere gli sperimentatori accecati dai gruppi animali, così come la randomizzazione e i test in momenti simili della giornata, sono cruciali per il rigore dell'indagine. In definitiva, ci sono fattori estranei che possono alterare le tracce di flusso, e queste preoccupazioni dovrebbero essere prese in considerazione quando si esegue UBP.
Il metodo UBP è una tecnica utilizzata per caratterizzare il modello di respirazione nei topi. Le misure di base possono essere raccolte entro 2 h quando si utilizza un segmento di respirazione di 15 s. Qui riportiamo un metodo che può essere eseguito con topi invecchiati, che sono spesso più agitati nella camera rispetto ai topi più giovani, suggerendo che altri ceppi di topo ansiosi o attivi potrebbero anche essere testati con questo protocollo. I dati raccolti da UBP non sono invasivi e consentono di testare più punti temporali, il che è utile per studi sull'invecchiamento, la terapia farmacologica e la progressione della malattia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Angela Le, Sarah Ruby e Marisa Mickey per il loro lavoro di mantenimento delle colonie animali. Questo lavoro è stato finanziato da 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. per sostenere il CNR), e la McDevitt Undergraduate Research Fellowship in Scienze Naturali (BEE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon Dioxide Analyzer | AEI Technologies | CD-3A | |
| Carbon Dioxide Sensor | AEI Technologies | P-61B | |
| Computer | must be compliant with Ponemah requirements | ||
| Drierite beads | PermaPure LLC | DM-AR | |
| Flow Control | AEI Technologies | R-1 | vacuum |
| Flowmeter | TSI | 4100 | need one per chamber and one for vacuum |
| Gas Mixer | MCQ Instruments | GB-103 | |
| Gas Tanks | Haun | 100% oxygen, 100% carbon dioxide, 100% nitrogen - food grade, or pre-mixed tanks for nomal room air and gas challenges | |
| Oxygen Analyzer | AEI Technologies | S-3A | |
| Oxygen Sensor | AEI Technologies | N-22M | |
| Polyurethane Tubing | SMC | TUS 0604 Y-20 | |
| Ponemah Software | DSI | ||
| Small Rodent Chamber | Buxco/DSI | ||
| Thermometer (LifeChip System) | Destron-Fearing | any type of thermometer to take accurate body temperatures is appropriate, but the use of implantable chips allows for minimal disturbance to animal for taking several body temperature measurements while the animal is still in the UBP chamber | |
| Transducers | Validyne | DP45 | need one per chamber |
| Whole Body Plethysmography System | Data Science International (DSI) | Includes ACQ-7700, pressure/temperature probes, etc. |
References
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