Summary
Este protocolo esboça um método para a análise quantitativa da formação complexa da proteína do mitofagia especificamente em pilhas beta das amostras preliminares do Islet humano. Esta técnica permite assim a análise da mitofagia do material biológico limitado, que são cruciais em amostras pancreatic humanas preciosas da pilha beta.
Abstract
Mitophagy é uma via de controle de qualidade mitocondrial essencial, que é crucial para bioenergética de células beta de Islet pancreáticas para abastecer a liberação de insulina estimulada por glicose. A avaliação da mitophagia é desafiadora e muitas vezes requer repórteres genéticos ou múltiplas técnicas complementares não facilmente utilizadas em amostras de tecido, como as ilhotas pancreáticas primárias humanas. Aqui nós demonstramos uma aproximação robusta para visualizar e quantificar a formação de complexos endógenos principais do mitofagia em ilhotas pancreatic humanas preliminares. Utilizando a técnica sensível do ensaio da ligadura da proximidade para detectar a interação dos reguladores NRDP1 e USP8 de mitofagia, nós podemos quantificar especificamente a formação de complexos mitofagia essenciais in situ. Ao acoplar essa abordagem à contracepção para o fator de transcrição PDX1, podemos quantificar complexos de mitophagia, e os fatores que podem prejudicar a mitofagia, especificamente dentro das células beta. A metodologia que descrevemos supera a necessidade de grandes quantidades de extratos celulares necessários para outros estudos de interação proteína-proteína, como a imunoprecipitação (IP) ou espectrometria de massas, e é ideal para amostras de Islet humanas preciosas geralmente não disponíveis em quantidades suficientes para estas abordagens. Além disso, esta metodologia elimina a necessidade de técnicas de triagem de fluxo para purificar as células beta de uma população de Ilhéus heterogêneo para aplicações proteicas a jusante. Assim, nós descrevemos um protocolo valioso para o visualização do mitofagia altamente-compatível para o uso em populações heterogêneas e limitadas da pilha.
Introduction
As células beta pancreáticas produzem a insulina necessária para manter a homeostase normal da glicose, e sua falha resulta no desenvolvimento de todas as formas de diabetes. As células beta mantêm uma capacidade mitocondrial robusta para gerar a energia necessária para o metabolismo da glicose de casal com liberação de insulina. Recentemente, tornou-se evidente que a manutenção da massa mitocondrial funcional é de importância crucial para a função de célula beta ideal1,2,3. A fim de sustentar a massa mitocondrial funcional, as células beta dependem de mecanismos de controle de qualidade para remover mitocôndrias disfuncionais, danificadas ou envelhecendo4. Nós e outros já demonstraram que as células beta dependem de uma forma especializada de rotatividade mitocondrial, chamada autofagia mitocondrial (ou mitophagy), para manter o controle de qualidade mitocondrial em ambos os roedores e ilhotas humanos1, 2,5. Infelizmente, entretanto, não havia nenhum método simples para detectar mitofagia, ou componentes mitofagia endogenamente expressados, em pilhas beta pancreatic humanas.
Nós mostramos recentemente que a regulação ascendente da mitofagia em beta Cells confia na formação de um complexo da proteína que compreende as ligases E3 CLEC16A e NRDP1 e o deubiquitinase USP81. NRDP1 e USP8 foram mostrados de forma independente para afetar a mitofagia através da ação no iniciador de mitofagia chave Parkin6,7. NRDP1 alvos Parkin para ubiquitinação e degradação para desligar mitofagia6, e USP8 especificamente deubiquitinates K6-lig Parkin para promover seu translocação à mitocôndria7. A tecnologia do ensaio da ligadura da proximidade (PLA) foi um avanço recente no campo da biologia8da interação da proteína, permitindo o visualização de interações endógenas da proteína in situ em únicas pilhas, e não é limitada pelo material escasso da amostra. Esta metodologia é particularmente atraente para a biologia de células de Islet/beta humana, devido à escassidade da disponibilidade da amostra, aliada à necessidade de compreensão de complexos proteicos fisiologicamente relevantes dentro de tipos de células heterogêneas.
Utilizando a aproximação do PLA, nós podemos observar complexos mitofagia endógenos chaves em pilhas beta pancreatic humanas preliminares e em linhas de pilha neuronal, e demonstramos os efeitos de um ambiente antidiabetogênico na via de mitofagia1. Em síntese, o objetivo geral deste protocolo é analisar complexos proteicos específicos de mitophagia em tecidos que não possuem material abundante, ou onde estudos convencionais de interação protéica não são possíveis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O uso de ilhotas pancreáticas humanas de doadores desidentificados é através de uma isenção do Conselho de revisão institucional (IRB) e em conformidade com a política da Universidade de Michigan IRB. As ilhotas pancreáticas humanas foram fornecidas pelo NIH/NIDDK-programa integrado de distribuição de ilhotas (IIDP).
1. preparação da amostra da ilíte humana
-
Dissociação de uma única célula
- Cultura de amostras de ilhao humano (4000 – 6000 Islet equivalentes/10 mL Media) por pelo menos 1 dia a 37 ° c em meios de Islet pancreáticos (PIM (S)) meios suplementados com 1 mM de glutamina (PIM (G)), 100 unidades/mL antimicótico-antibiótico, 1 mM piruvato de sódio e 10% fetal bovino soro (FBS) ou soro AB humano.
- Use um microscópio da luz da dissecção na ampliação 3x para contar ilhotas humanas individuais da cultura. Escolha 40 ilhotas por tratamento/condição de interesse (como a glucolipotoxicidade) em tubos de 1,5 mL em suportes de ilhotas.
- Ilhotas do centrifugador em 400 x g por 1 minuto em 10 ° c ao sedimento.
- Amostras de lavagem, por breves inversão de tubos à temperatura ambiente, duas vezes com 1 mL de solução salina tamponada de fosfato (PBS) contendo 50 μM PR619 (um inibidor de deubiquitinase; para preservar as interações protéicas dependentes da ubiquitina), com centrifugação entre cada lavagem a 400 x g por 1 min a 10 ° c.
- Dissociar as ilhotas em células únicas com 125 μL de 0,25% de tripsina contendo 50 μM de PR619 incubando tripsina pré-aquecida (37 ° c) por 3 min com pelotas de ilhotas. Dispersar suavemente ilhotas durante este tempo com pipetagem suave periódica usando uma pipeta de 200 μl.
- Saciar a tripsina com 1 mL aquecido (37 ° c) PIM (S) mídia contendo 50 μM PR619, em seguida, células de sedimentos por centrifugação em 400 x g por 1 min.
- Células de lavagem por centrifugação a 400 x g por 1 min, duas vezes, com PBS + 50 μm PR619.
- Finalmente, reressuscitem as células em 150 μL de PBS contendo 50 μM PR619.
-
Aderência e fixação de células simples
- Após a ressuscição, gire a solução de célula para fosco, carregada, lâminas de microscópio usando um citocentrifugador em 28 x g por 10 min.
- Após a citocentrifugação, delinear a área celular com uma caneta hidrofóbica (ver a tabela de materiais) para minimizar os volumes de solução de anticorpos/PLA necessários. Fixe pilhas com o paraformaldeído de 4% em PBS por 15 minutos na temperatura ambiente.
PRECAUÇÃO: o PFA é perigoso e deve ser manuseado com cuidado. - Para melhores resultados, realize a coloração/PLA imediatamente, ou dentro de 24 h. Se necessário, armazene amostras em PBS a 4 ° c até manchar por não mais de 48 h.
2. imunoistoquímica
-
Bloqueio
- Lave as células duas vezes com 1X PBS por 5 min à temperatura ambiente.
- Solução de célula de bloco, para eliminar a coloração de fundo, com 10% de soro de burro em PBS contendo 0,3% de detergente (ver a tabela de materiais) por 1 h à temperatura ambiente.
-
Mancha
- Incubar células com anticorpos primários de camundongo ou coelho contra USP8 (1:250) e NRDP1 (1:250) respectivamente (ver a tabela de materiais) diluída em soro fisiológico tamponado de fosfato com detergente (PBT, ver tabela de materiais), a 4 ° c durante a noite, para detectam a sinalização complexa do mitofagia através do PLA.
- Coincubar células com um marcador específico para a identificação de células beta que não foi levantada no rato ou coelho de modo a não interferir com o sinal PLA. Neste caso, incubar células com anti-cabra PDX1 (1:500) em PBT. Incubar todos os anticorpos primários durante a noite a 4 ° c, usando filme plástico em cima da solução para evitar a evaporação.
3. ensaio de ligadura de proximidade
- Sonda PLA e contratura
- Prepare a solução de sonda PLA de acordo com as instruções do fabricante, ou seja, fazer 20 μL de solução de sonda por amostra, preparando uma concentração final de 1:5 solução de ambos os anti-rato e anti-Rabbit solução de sonda em PBT, e incubando por 20 min no quarto Temperatura.
- Após a incubação durante a noite, lave as células duas vezes com 1X PBS por 5 min cada, em um rocker.
- Pouco antes da incubação com solução de sonda, adicione Cy5 secundária em uma concentração final de 1:600 à solução de sonda (para detecção de PDX1 endógena). Adicionar 20 μL de solução de sonda a cada condição celular, cubra suavemente com filme plástico e incubar a 37 ° c por 1 h.
- Ligadura
- Lave as células duas vezes, à temperatura ambiente, com o buffer A (ver a tabela de materiais para a receita) por 5 min cada, em um rocker.
- Prepare a solução de ligadura (parte dos reagentes de detecção, consulte a tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante. Para isso, diluir o estoque de ligadura (5x) 1:5 em água tratada com pirocarbonato de dietilo (DEPC). Imediatamente antes da incubação adicionar 0, 25 U/mL ligase. Adicionar 20 μL de solução de ligadura às células. Cubra com filme plástico e incubar a 37 ° c por 30 min.
- Amplificação
- Lave as células duas vezes à temperatura ambiente com o tampão A durante 2 min cada.
- Faça a solução da amplificação (parte dos reagentes da deteção, veja a tabela de materiais) de acordo com instruções do fabricante. Diluir o tampão de amplificação (5x) 1:5 em água tratada com DEPC e manter-se no escuro até ao uso. Adicione uma diluição 1:80 da polimerase (parte dos reagentes de detecção, consulte a tabela de materiais) à solução imediatamente antes de adicionar a solução às células.
- Adicionar 20 μL de solução de amplificação às células. Cubra com filme plástico e coloque no escuro a 37 ° c para entre 1 h 40 min a 2 h para o sinal máximo.
- Preparação para a imagem
- Lave as células duas vezes com o buffer B (veja a tabela de materiais para a receita) por 10 min à temperatura ambiente, em um rocker.
- Finalmente, lave as células uma vez em 0.01 x buffer B, por 2 min à temperatura ambiente em um rocker.
- Monte as amostras adicionando uma gota de suportes de montagem contendo 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e colocando cuidadosamente uma lamínula sobre as amostras usando uma lâmina de bisturi para pressionar as bolhas formadas. Fechamentos do selo usando o lustrador de prego desobstruído em torno das bordas.
- Amostras de imagem em um microscópio capaz de capturar múltiplos planos focais, como um microscópio confocal de varredura a laser, ou um microscópio de fluorescência invertido com capacidades de desvolução, tendo pelo menos 9 imagens de plano focal diferentes.
- Capture imagens com ampliação de 100x, com aproximadamente 0,45 mm de altura de pilha z. Captura PLA em 550 de excitação nm, 570 emissão de nm; contra-mancha em 650 de excitação nm, 670 emissão de nm; e DAPI em 405 de excitação nm, 450 emissão de nm.
- Para garantir sinais de fundo de imagem de fluorescência e luz perdida são minimizados para análise a jusante de eventos de PLA (especialmente em microscópios Widefield), imagens de processo utilizando um algoritmo de desvolução bidimensional (vizinho mais próximo) através de um software de processamento de imagem padrão de escolha.
Nota: para Olympus usar CellSens, Nikon usar NIS-Elements, Leica usar LAS X, Zeiss-ZEN, Metamorph, MATLAB, Huygens software, bem como vários plugins disponíveis através de Image-J. Para análise, o número total de interações em todas as pilhas z deve ser analisado usando o software Image-J, garantindo que apenas as células positivas PDX-1 sejam analisadas (seção 3,5).
- Quantificação das interações do PLA
- Abra o aplicativo de software livre Image-J e abra a imagem PLA. Comece a partir da primeira imagem PLA em foco acentuada.
- Clique na guia imagem e selecione ajustare, em seguida, limite (Figura 1a). Ajuste o limiar para remover todos os sinais de PLA não específicos, anote o ajuste do limiar e tente mantê-lo consistente ao longo da análise.
- Clique na guia processo e selecione binárioe, em seguida, faça binário (Figura 1b). Use a imagem binária para medir as partículas, clicando na guia "Analyze" e pressionando analisar partículas (Figura 1C).
- Para análise, certifique-se de que as configurações são as seguintes: size = 0 – Infinity, circularidade = 0 – 1.0, show = contornos, caixas de seleção para resultados de exibiçãoe resultados claros (Figura 1D). Clique em OK. Anote o número de partículas analisadas em uma planilha que denota a amostra e a posição da pilha z.
- Repita as etapas 3.5.2 – 3.5.4 até que todas as pilhas z em foco para a amostra tenham sido analisadas. Soma o número total de partículas para a amostra na planilha para quantificar o número total de interações.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Realizamos experimentos iniciais na linha de células beta pancreáticas MIN6 e na linha de células de neuroblastoma SH-SY5Y SH-SY5Y, para otimizar e confirmar tanto a especificidade dos anticorpos quanto as interações protéicas visualizadas. As pilhas de MIN6 foram chapeadas em COVERSLIP em 30.000 Cells/mL e deixadas para aderir para 48 h, as pilhas SH-SY5Y foram chapeadas em COVERSLIP em 15.000 Cells/mL e deixadas para aderir para 24 h. O protocolo PLA foi então seguido como acima, começando na etapa 1.2.3. Para assegurar a especificidade dos sinais do PLA, nós executamos primeiramente esta aproximação na presença de (i) nenhum anticorpo preliminar (Figura 2a, Figura 3a), (II) o anticorpo NRDP1 sozinho (Figura 2b, Figura 3B), (III) USP8 anticorpo sozinho ( Figura 2C, Figura 3C) e (IV) anticorpos NRDP1 e USP8 (Figura 2D, Figura 3D). Para facilitar a configuração da amostra, a tabela 1 denota como configurar adequadamente os controles experimentais. Notàvel, nós observamos nenhum sinal punctate do PLA no único anticorpo preliminar ou em nenhumas condições preliminares do controle do anticorpo, assim confirmando que as interações in situ são observadas especificamente entre NRDP1 e USP8 na presença de ambos os anticorpos preliminares, em MIN6 e Células SH-SY5Y.
Em seguida, adaptamos essa abordagem para uso com ilhotas humanas para analisar interações complexas de mitofagia especificamente nas células beta humanas primárias. As ilhotas humanas são compostas por uma população heterogénea de células funcionalmente distintas, incluindo alfa, beta, Delta e PP-Cells9. Em contraste com as ilhotas do mouse, onde as células beta respondem por ~ 80% da massa de ilhotas, as células beta compreendem uma faixa proporcionalmente menor dentro das Ilhas humanas (entre 28-75%)10,11,12. Assim, procurou-se usar a tecnologia PLA para nos permitir observar a presença de complexos de mitophagia NRDP1-USP8 especificamente dentro de células beta e garantir que não observamos observações confundimento de outros tipos de células de ilhas (que podem ocorrer a partir de estudos de coimunoprecipitação de lisados de Islet). Assim, é importante assegurar a dispersão adequada e uniforme da Ilíada a tal nível que as únicas pilhas podem facilmente ser discriminadas e analisadas mais. Como observado na Figura 4, o protocolo de dispersão (seção 1) é altamente eficiente para garantir células únicas no campo de visão do microscópio para análise a jusante. Para identificar as células beta, realizamos a cocoloração com PDX1 específicos anti-soros durante o processo de PLA. PDX1 é um fator de transcrição específico da célula beta vital, que é encontrado em células beta produtoras de insulina maduras principalmente dentro do núcleo13. A coloração PDX1 foi mantida após NRDP1: USP8 PLA em ilhotas humanas primárias (Figura 4). É importante ressaltar que utilizamos os anti-soros de cabra PDX1 para evitar reatividade cruzada com anticorpos primários usados para PLA (coelho anti-NRDP1 e mouse anti-USP8, respectivamente). Assim, a adição de PDX1 permite a avaliação específica de complexos de mitofagia endógenos dentro das células beta humanas primárias.
Utilizando essas abordagens, podemos compilar um instantâneo da retenção do complexo mitofagia NRDP1: USP8 para inferir a competência da via mitofagia dentro das células beta. Para expandir esta aproximação para o uso dentro das condições ambientais que emulam aquelas do tipo-2 diabetes14, nós tratamos linhas de pilha beta e as ilhotas humanas preliminares com palmitato e glicose elevada para induzir o glucolipotoxicity. De fato, verificou-se que a interação entre NRDP1 e USP8 foi diminuída após uma exposição de 48 h a palmitato e alta glicose em ambas as linhagens beta, bem como células beta humanas primárias por PLA (Figura 5 e referência1). Este resultado destaca a viabilidade deste ensaio para avaliar fatores mitofagia endógenos chaves que seguem estímulos antidiabetogênico.
Figura 1: Workflow da análise da imagem J para quantificação das interações do PLA. Os passos importantes da análise são destacados aqui. (A) ajuste do limiar da imagem para garantir uma análise de sinal PLA específica. (B) conversão de imagem em dados binários para permitir a quantificação fácil. (C-D) Como finalizar a análise analisando as partículas reconhecidas pelo software ImageJ. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: NRDP1 e USP8 interagem especificamente em células beta pancreáticas. As imagens elevadas da ampliação (100x) da linha celular pancreatic do rato, MIN6, são mostradas. (A-D) O sinal do PLA para NRDP1: USP8 a interação é mostrada no vermelho, e os núcleos são delineados por DAPI no azul. (A-C) Nenhum sinal punctate específico para a interação NRDP1: USP8 é visto se ambos (a) ou um (B, C) dos anticorpos preliminares da proteína for omitido durante o processo do PLA. Entretanto, a interação de ambas as proteínas é visível pelo PLA em beta pilhas pancreatic (D) quando ambos os anticorpos são incluídos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: NRDP1 e USP8 interagem especificamente em células de neuroblastoma. As imagens elevadas da ampliação (100x) da linha de pilha humana do neuroblastoma, SH-SY5Y, são mostradas. (A-D) O sinal do PLA para NRDP1: USP8 a interação é mostrada no vermelho, e os núcleos são delineados por DAPI no azul. (A-C) Nenhum sinal punctate específico para a interação NRDP1: USP8 é visto se ambos (a) ou um (B, C) dos anticorpos preliminares da proteína for omitido durante o processo do PLA. Entretanto, a interação de ambas as proteínas é visível pelo PLA (D) quando ambos os anticorpos são incluídos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: os complexos de mitofagia da pilha beta podem ser identificados em ilhotas pancreatic humanas preliminares no situ pelo pla. Imagens de alta ampliação (100x) de ilhotas humanas dispersas são mostradas. Células individuais são delineadas por coloração nuclear com DAPI (azul), as células beta são observadas com coloração PDX1 (magenta), e os complexos de mitofagia podem ser observados em ambas as células beta e células não-beta (vermelho). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: o complexo mitofagia NRDP1: USP8 é destabilizado em células beta por glucolipotoxicidade.
Imagens de alta ampliação (100x) de MIN6 células tratadas por 48 h com controle (25 mM de glicose + 0,82% BSA) ou alta glicose + palmitato (25 mM de glicose + 0,4 mM palmitato/0,82% BSA) são mostrados. (A-B) O sinal PLA (NRDP1: USP8) é observado em ambos os grupos de tratamento. O sinal do PLA diminui em células beta MIN6 após a glucolipotoxicidade (B) quando comparada aos controles (a). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Amostra | ANTICORPO 1 (mouse anti-NRDP1) | ANTICORPO 2 (coelho anti-USP8) | Anticorpo 3 (cabra anti-PDX1) (Contratura opcional) |
| CONTROLE 1: Nenhum anticorpo preliminar (40 ilhotas) | - | - | + |
| CONTROLE 2: NRDP1 sozinho (40 ilhotas) | + | - | + |
| CONTROLE 3: USP8 sozinho (40 ilhotas) | - | + | + |
| EXPERIMENTAL 1-x: todas as condições experimentais (40 ilhotas cada) | + | + | + |
Tabela 1: exemplo de configuração de experimento experimental.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aqui nós descrevemos uma abordagem simples e eficiente para usar NRDP1: USP8 PLA em tecidos/células de interesse para quantificar a formação de complexos de mitofagia upstream. Nós confirmamos previamente a formação do complexo do mitofagia de CLEC16A-NRDP1-USP8 em pilhas beta pancreatic por diversas metodologias, incluindo experimentos da coimunoprecipitação, estudos Cell-Free da interação, e in vitro assim como o Cell-Based ensaios de ubiquitinação e demonstraram como esse complexo impulsiona o fluxo mitofágico1,15. Os estudos do PLA que nós relatamos e descrevemos aqui permitem uma vista rápida, quantitativa, e Cell-specific da via mitofagia que é altamente adaptável às pilhas beta humanas preliminares. Adicionalmente, nós mostramos que o Pla de NRDP1: USP8 pode ser adaptado para o uso fora da biologia de célula beta em pilhas do neuroblastoma sh-SY5Y, destacando a viabilidade potencial desta técnica para monitorar complexos de mitofagia em sistemas neuronal também.
O PLA é uma aproximação direta; no entanto, certas etapas dentro do protocolo são de extrema importância para garantir resultados claros e específicos. Estes incluem: (1) garantir o procedimento de dispersão para ilhotas humanas é suficientemente leve para evitar a lise celular/danos para otimizar imagens, (2) adição do inibidor da deubiquitinase, PR619, imediatamente antes da fixação e durante as lavas para preservar a Estado de ubiquitinação (e assim encadernação) do complexo NRDP1-USP8 para a observação máxima do sinal pelo PLA, e (3) a quantificação objetiva de eventos do PLA por ImageJ para assegurar uma avaliação imparcial de complexos de mitofagia e para permitir também a determinação de condições em que as alterações na mitophagia podem não estar completas, mas ainda estatisticamente significativas/biologicamente relevantes.
Um desafio conhecido dentro dos estudos do Islet humano é a preocupação para a população heterogênea de pilhas beta e de pilhas non-beta. Nosso uso da contratura PDX1 permite a avaliação da formação complexa de mitofagia dentro das células beta (assim como PDX1 células não-beta negativas). Uma preocupação potencial utilizando PDX1 como uma contratura é a sua expressão em células delta pancreáticas16,17,18, embora a um grau muito menor do que em células beta, como outros marcadores (ou seja, nkx 6.1) poderia ser empregado para células alvo beta mais especificamente. Dispersando ilhotas intactas em pilhas únicas imediatamente antes da citocentrifugação e da fixação, nós podemos igualmente executar estudos da mitofagia da única pilha com somente o rompimento mínimo do microambiente da ilhotas durante o curso de tratamentos da droga e/ou exposição glucolipotóxica. No entanto, não podemos excluir a possibilidade de que a dispersão da ilífica possa interferir com os complexos mitofágicos dentro das células, independentemente dos tratamentos relevantes.
Embora os estudos de interação proteína-proteína mais tradicionais possam ser empregados em ilhotas pancreáticas humanas, como a coimunoprecipitação e/ou abordagens proteômicas, esses procedimentos geralmente exigem uma grande quantidade de lisado de ilhotas, o que pode revelar-se desafiador dada a escassez de material de ilhao humano disponível. Adicionalmente, a preocupação do tipo de célula-especificidade durante essas técnicas tradicionais torna-se mais aparente ou requer otimização adicional de métodos de citometria de fluxo para classificar as populações de células beta puras19,20, 21,22. Assim, nossa aproximação do PLA fornece uma alternativa atrativa e prática para estudos da interação da proteína-proteína da via mitofagia em pilhas humanas do beta. Notavelmente, a capacidade de usar tão poucos como 40 ilhotas/condição total por experimento para quantificar a formação de complexo mitofagia em milhares de beta-células individuais permite que os pesquisadores ilhotas a capacidade de conservar os seus preparativos de ilhós para outras avaliações do mesmo doador.
Como NRDP1 e USP8 são expressados ubiquitously, nós especulamos que esta técnica pode ter o valor para a avaliação da mitofagia em tipos da pilha além das pilhas beta. As possibilidades incluem outros tipos da pilha da Ilíada (com countermanchas relevantes para pilhas alfa ou pilhas do Delta) ou os tipos da pilha que confiam pesadamente na mitophagy, tal como neurônios. Para tanto, nossa observação da transferibilidade dessa técnica para as células de neuroblastoma sh-SY5Y (Figura 2) ou células de Illet PDX1-negativas (Figura 4) poderia sugerir a utilidade de nossa técnica para a via mitofagia em outros tipos de células.
Apesar da facilidade e da simplicidade da aproximação do PLA de NRDP1: USP8, há os desafios que poderiam confundir os resultados deste ensaio. Quando o PLA puder verificar interações da proteína-proteína na proximidade muito próxima (40 nanômetro), não exclui a possibilidade que determinadas circunstâncias experimentais poderiam manter a proximidade NRDP1-USP8 ao interromper a interação, que seria faltada pelo Abordagem PLA. Além disso, embora tenhamos demonstrado que NRDP1: USP8 formação complexa é um leitura válido para o caminho canônico de CLEC16A/Parkin-mitofagia em células beta pancreáticas, estudos recentes têm observado papéis para a mitophagia independente de Parkin em mitocondrial controle de qualidade23,24. Nós ainda não sabemos como NRDP1: USP8 formação complexa é modificada pelo rompimento de mitophagy independente de PARKIN. Assim, o uso de uma aproximação complementar além daquelas descritas aqui para o ensaio mitofagia em pilhas beta seria aconselhável. Finalmente, a estabilidade deste complexo mitofagia é dependente do ubiquitinação das proteínas do componente, tais que a adição de um inibidor largo PR619 do deubiquitinase do espectro é crítica para manter o ubiquitinação durante a preparação da amostra. Novamente, manipulações de células beta que podem indiretamente interromper a ubiquitinação de componentes do complexo NRDP1-USP8 precisam ser consideradas ao analisar NRDP1: USP8 como uma leitura para a formação complexa de mitofagia.
Como o papel do controle de qualidade mitocondrial é cada vez mais apreciado em não apenas a função de célula beta, mas também outros tipos de células altamente metabólicas, a avaliação rigorosa da mitofagia pode revelar-se desafiador e demorado para grupos que desejam um mais rápido avaliação de componentes de mitofagia cruciais. A abordagem de PLA que descrevemos é uma técnica de visualização de nível molecular relativamente baixo custo, que pode fornecer análise quantitativa da formação complexa de mitofagia com resolução de células únicas em amostras de ilhas humanas de pequena quantidade e pode ser amplamente aplicada a uma variedade de tipos de células, tratamentos ou condições de doença.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o apoio ao financiamento da JDRF (CDA-2016-189 e SRA-2018-539), o Instituto Nacional de diabetes e doenças digestivas e renais, institutos nacionais de saúde (R01-DK-108921), a família Brehm e a família Anthony. O prêmio JDRF de desenvolvimento de carreira da S.A.S. é parcialmente apoiado pela Academia dinamarquesa de diabetes, que é apoiada pela Fundação Novo Nordisk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA 1X | Life Technologies | 25200-056 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Block solution | Homemade | Use 1X PBS, add 10 % donkey serum, and 0.3% Triton X-100 detergent. | |
| Buffer A | Homemade | To make 1L: Mix 8.8g NaCl, 1.2g Tris base, 500ul Tween-20, with 750mL ddH20. pH to 7.5 with HCl, and fill to 1L. Filter solution and store at 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Buffer B | Homemade | To make 1L: Mix 5.84g NaCl, 4.24g Tris base, 26g Tris-HCl with 500mL ddH20. pH to 7.5, and fill to 1L. Filter solution and store a 4C. Bring to RT before experimental use | |
| Cy5-conjugated AffiniPure donkey anti-goat | Jackson Labs | 705-175-147 | |
| Detection Reagents Red | Sigma- Aldrich | DU092008-100RXN | Kit containing: ligation solution stock (5X), ligase, amplification solution stock (5X) and polymerase. |
| DuoLink PLA probe anti-mouse MINUS | Sigma- Aldrich | DU092004-100RXN | |
| DuoLink PLA probe anti-rabbit PLUS | Sigma- Aldrich | DU092002-100RXN | |
| Fetal bovine serum | |||
| Goat polyclonal anti-PDX1 (clone A17) | Santa Cruz | SC-14664 | RRID: AB_2162373 |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MIN6 pancreatic cell line | Gift from D. Stoffers | Mouse insulinoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Mouse monoclonal anti-USP8 antibody (clone US872) | Sigma- Aldrich | SAB200527 | |
| Pap-pen | Research Products International | 195505 | |
| Parafilm | Use to seal antibody and probe solutions on your cells to prevent evaporation when using small solution volumes. | ||
| PBT (phosphate buffered saline with triton) | Homemade | To make 50mL: 43.5mLddH2O, 5mL 10X PBS, 0.5mL 10X BSA(100mg/mL solution), 1mL 10% triton X-100 solution in ddH20) | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline, 10X | Fisher Scientific | BP399-20 | |
| PIM(ABS) Human AB serum | Prodo Labs | PIM-ABS001GMP | |
| PIM(G) (glutamine) | Prodo Labs | PIM-G001GMP | |
| PIM(S) media | Prodo Labs | PIM-S001GMP | |
| PR619 | Apex Bio | A812 | |
| Prolong Gold antifade reagent with DAPI | Life Technologies (Molecular Probes) | P36935 | |
| Rabbit polyclonal anti-FLRF/RNF41 (Nrdp1) | Bethyl Laboratories | A300-049A | RRID: AB_2181251 |
| SH-SY5Y cells | Gift from L. Satin | Human neuroblastoma cell line, utilized for cell-based assays. | |
| Sodium Pyruvate (100X) | Life Technologies | 11360-070 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Water for RNA work (DEPC water) | Fisher Scientific | BP361-1L |
References
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 Form a Ubiquitin-Dependent Tripartite Complex That Regulates beta-Cell Mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: Maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. (0), (2015).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Soleimanpour, S. A., et al. Diabetes Susceptibility Genes Pdx1 and Clec16a Function in a Pathway Regulating Mitophagy in beta-Cells. Diabetes. 64 (10), 3475-3484 (2015).
- Zhong, L., Tan, Y., Zhou, A., Yu, Q., Zhou, J. RING Finger Ubiquitin-Protein Isopeptide Ligase Nrdp1/FLRF Regulates Parkin Stability and Activity. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9425-9430 (2005).
- Durcan, T. M., et al. USP8 regulates mitophagy by removing K6-linked ubiquitin conjugates from parkin. The EMBO Journal. 33 (21), 2473-2491 (2014).
- Gauthier, T., Claude-Taupin, A., Delage-Mourroux, R., Boyer-Guittaut, M., Hervouet, E. Proximity Ligation In situ Assay is a Powerful Tool to Monitor Specific ATG Protein Interactions following Autophagy Induction. PLoS ONE. 10 (6), e0128701 (2015).
- Silva Xavier, D. a, G, The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
- Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2334 (2006).
- Brissova, M., et al. Assessment of Human Pancreatic Islet Architecture and Composition by Laser Scanning Confocal Microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
- Babu, D. A., Deering, T. G., Mirmira, R. G. A feat of metabolic proportions: Pdx1 orchestrates islet development and function in the maintenance of glucose homeostasis. Molecular Genetics and Metabolism. 92 (1), 43-55 (2007).
- Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochimica Biophysica Acta. 1801 (3), 289-298 (2010).
- Pearson, G., Soleimanpour, S. A. A ubiquitin-dependent mitophagy complex maintains mitochondrial function and insulin secretion in beta cells. Autophagy. 14 (7), 1160-1161 (2018).
- Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
- DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5 (7), 449-458 (2016).
- Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type–specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
- Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of β cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
- Dorrell, C., et al. Isolation of major pancreatic cell types and long-term culture-initiating cells using novel human surface markers. Stem Cell Research. 1 (3), 183-194 (2008).
- Jayaraman, S. A novel method for the detection of viable human pancreatic beta cells by flow cytometry using fluorophores that selectively detect labile zinc, mitochondrial membrane potential and protein thiols. Cytometry Part A. 73 (7), 615-625 (2008).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human ß-Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Allen, G. F. G., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
- Villa, E., Marchetti, S., Ricci, J. -E. No Parkin Zone: Mitophagy without Parkin. Trends in Cell Biology. , (2018).
