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Medicine

Orthotopic चूहा गुर्दा प्रत्यारोपण: एक उपंयास और सरलीकृत सर्जिकल दृष्टिकोण

Published: May 7, 2019 doi: 10.3791/59403
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

इस पांडुलिपि और प्रोटोकॉल का उद्देश्य समझा और विस्तार से चूहों में orthotopic गुर्दा प्रत्यारोपण की शल्य प्रक्रिया को प्रदर्शित करने के लिए है । इस विधि दाता गुर्दे के सही छिड़काव को प्राप्त करने और शिरापरक और ureteral कफ एनास्टोरोसिस तकनीक का उपयोग करके reperfusion समय छोटा करने के लिए सरल है ।

Abstract

गुर्दे प्रत्यारोपण वृद्धि हुई जीवित रहने की दर और अंत चरण गुर्दे की बीमारी के साथ रोगियों के लिए जीवन की गुणवत्ता में सुधार प्रदान करता है, के रूप में गुर्दे रिप्लेसमेंट थेरेपी के किसी भी प्रकार की तुलना में । पिछले कुछ दशकों में, चूहा गुर्दा प्रत्यारोपण मॉडल अस्वीकृति और सहिष्णुता की प्रतिरक्षा घटना का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस मॉडल के लिए एक अनिवार्य उपकरण बन गया है नए इम्यूनोमॉड्यूलेटरी फार्मास्यूटिकल्स और regimens महंगी पूर्व नैदानिक बड़े पशु अध्ययन के साथ आगे बढ़ने से पहले परीक्षण करने के लिए ।

इस प्रोटोकॉल कैसे मज़बूती से चूहों में orthotopic गुर्दा प्रत्यारोपण करने के लिए की एक विस्तृत सिंहावलोकन प्रदान करता है । इस प्रोटोकॉल तीन विशिष्ट कदम है कि सफलता की संभावना को बढ़ाने में शामिल हैं: पोर्टल नस के माध्यम से निस्तब्धता और एक कफ प्रणाली का उपयोग गुर्दे की नसों और मूत्रवाहिनी anastomose द्वारा दाता गुर्दे का छिड़काव, जिससे ठंड और गर्म कम ischemia टाइंस । इस तकनीक का उपयोग करते हुए, हम 6 महीने से परे जीवित रहने की दर प्राप्त की है सामान्य सीरम क्रिएटिनिन के साथ syngeneic या सहिष्णु गुर्दा प्रत्यारोपण के साथ जानवरों में. अध्ययन के उद्देश्य पर निर्भर करता है, इस मॉडल के द्वारा संशोधित किया जा सकता है पूर्व या posttransplant उपचार तीव्र, जीर्ण, सेलुलर, या एंटीबॉडी-mediated अस्वीकृति का अध्ययन करने के लिए. यह गुर्दा प्रत्यारोपण के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक पुनरुद्भणीय, विश्वसनीय, और लागत प्रभावी पशु मॉडल है ।

Introduction

ऐतिहासिक, पहले प्रत्यारोपण अस्वीकृति अध्ययन ब्रेंट और Medawar द्वारा कृंतकों1में त्वचा प्रत्यारोपण का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । यह जल्द ही स्पष्ट हो गया है कि त्वचा विशिष्ट प्रतिरक्षा विशेषताएं है, यह एक उच्च प्रतिरक्षाविज्ञानी अंग है कि अन्य vascularized ठोस अंगों2से अस्वीकृति में अलग है बना रही है । ठोस अंग प्रत्यारोपण अस्वीकृति के चूहे अध्ययन दिल, जिगर, और गुर्दे प्रत्यारोपण करने के लिए आदतन सीमित हैं । हालांकि इन अंगों में से प्रत्येक अस्वीकृति का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, उनमें से प्रत्येक के लिए फायदे और नुकसान हैं । हृदय प्रत्यारोपण अक्सर पेट में प्रत्यारोपित किया जाता है और महाधमनी और शिरा cava के लिए anastomosed, स्थान3में प्राप्तकर्ता के मूल के दिल के साथ । यह मानव नैदानिक, शारीरिक, और शारीरिक स्थितियों विश्राम नहीं करता है । इसके अतिरिक्त, दिल बहुत ठंडा ischemia के प्रति संवेदनशील है और 1 के भीतर अधिमान्य reperfused किया जा करने के लिए अपने4समारोह को ठीक करने में सक्षम होने के लिए ज. लिवर प्रत्यारोपण आमतौर पर शल्य चिकित्सा के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण और प्रदर्शन करने के लिए समय के प्रति संवेदनशील माना जाता है । मूल जिगर को हटाने के बाद, दाता जिगर को प्रत्यारोपित और 30 मिनट के भीतर reperfused के रूप में प्राप्तकर्ताओं अब एक कार्य जिगर5के बिना पिछले नहीं कर सकते है किया जाना है । यकृत धमनी, पोर्टल शिरा, और विशेष रूप से पित्त वाहिनी पुनर्निर्माण परिष्कृत शल्य चिकित्सा कौशल की आवश्यकता है । शल्य चुनौतियों के अलावा, जिगर को सहन करने की संपत्तियों और कृंतकों के अधिकारी और मानव परिचालनिक दृष्टि से दृष्टि से सहिष्णु6,7,8बन सकता है जाना जाता है । गुर्दे, aforementioned अंगों के विपरीत, एक orthotopic फैशन में प्रत्यारोपित किया जा सकता है, सुसंगत, reproducible अस्वीकृति एपिसोड (यदि नहीं immunoदबाया) के साथ एक immunogenic अंग होने के लिए जाना जाता है, और लंबे समय तक ठंडा कई के ischemia बार के लिए अनुमति देता है घंटे. यह चूहा गुर्दा प्रत्यारोपण एक आदर्श मॉडल के लिए allograft अस्वीकृति और सहिष्णुता के अध्ययन के लिए बनाता है ।

गुर्दे प्रत्यारोपण (केटी) अंत चरण गुर्दे की बीमारी के साथ रोगियों के लिए उपचार के पसंदीदा विकल्प है । पिछले कुछ दशकों में, अल्पावधि उत्तरजीविता परिणामों के बाद KT नाटकीय रूप से सुधार हुआ है, लेकिन लंबे समय तक जीवित रहने के परिणाम9स्थिर रहे हैं । पारंपरिक immunosuppressive रेजिडेंस मानक विरोधी अस्वीकृति चिकित्सा रहते हैं । हालांकि, immunosuppressive चिकित्सा के पुराने उपयोग गुर्दे की विषाक्तता, मधुमेह, और माध्यमिक maligcies10,11,12के रूप में महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु का कारण बनता है । लंबी अवधि में, पुरानी एंटीबॉडी और सेलुलर मध्यस्थता अस्वीकृति, सीमित चिकित्सकीय विकल्प उपलब्ध के साथ, भ्रष्टाचार अस्तित्व की धमकी ।

प्रत्यारोपण में एक प्रमुख लक्ष्य प्रत्यारोपण सहिष्णुता के प्रेरण के क्रम में क्रोनिक immunosuppression की आवश्यकता को कम करने के लिए है । चूहा KT मॉडल प्रतिरक्षाविज्ञानी अस्वीकृति प्रक्रिया की जांच करने के लिए और immunomodulation और प्रत्यारोपण सहिष्णुता के लिए नए दृष्टिकोण का मूल्यांकन करने के लिए एक मजबूत उपकरण है । चूहा भी एक उपयुक्त मॉडल के रूप में कार्य करता है तीव्र और जीर्ण सेल का अध्ययन और एंटीबॉडी मध्यस्थता अस्वीकृति13,14,15,16,17। इस शल्य चिकित्सा मॉडल के लिए एक विश्वसनीय, reproducible, और लागत प्रभावी उपकरण के लिए allograft अस्वीकृति और सहिष्णुता के विभिंन पहलुओं का अध्ययन साबित हो गया है । यह अक्सर उपंयास सहिष्णुता का परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है, महंगा और बोझिल बड़े जानवर अध्ययन उपक्रम से पहले प्रोटोकॉल inducing । चूहों में KT प्रदर्शन व्यापक शल्य चिकित्सा प्रशिक्षण और विशेषज्ञता > 90% की जीवित रहने की दर तक पहुंचने की आवश्यकता है । इस पांडुलिपि में और साथ अनुदेशात्मक वीडियो में, हम एक कदम-द्वारा चूहे में orthotopic KT के लिए कदम रूपरेखा प्रदान करते हैं, के रूप में सफलतापूर्वक हमारे संस्थान में कई वर्षों के लिए प्रदर्शन किया ।

किसी भी प्रक्रिया को शुरू करने से पहले, दाता और प्राप्तकर्ता चयन महत्वपूर्ण है और प्रयोग की प्रकृति पर निर्भर करता है । आदर्श रूप में, दाताओं और प्राप्तकर्ताओं 220 के बीच वजन-260 जी और 8 के बीच होना चाहिए-12 उंर के सप्ताह । २२० g के तहत जानवरों में छोटे व्यास की धमनियों, नसों और मूत्रवाहिनी होते हैं, जिससे प्राप्तकर्ता में एनास्टोनोसिस विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण होता है । मामूली खून की कमी के कारण hypovolemia हो सकता है और छोटे जानवरों में मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । पशुओं से भारी २६० जी अपने जहाजों के आसपास अधिक वसा प्रदर्शन, और पोत अलगाव अधिक ऑपरेटिव समय की आवश्यकता होगी और ठंड ischemia समय वृद्धि हुई है ।

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Protocol

लुईस (RT11) और डार्क Agouti (डीए) (RT1Aक) चूहे वाणिज्यिक विक्रेताओं से खरीदे गए ( सामग्री की तालिकादेखें) । ये पूरी तरह से एमएचसी बेमेल उपभेदों अक्सर तीव्र गुर्दे allograft अस्वीकृति का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है । सभी जानवरों को जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय में एक विशिष्ट रोगजनक-मुक्त सुविधा में राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के दिशा-निर्देशों के अनुसार रखे गए थे और बनाए रखे गए थे । सभी प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. दाता प्रक्रिया

  1. तैयार करने और आटोक्लेव सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों नसबंदी के एक साधन के रूप में इस प्रक्रिया में इस्तेमाल किया जा करने के लिए और संक्रामक जटिलताओं को रोकने के लिए डिस्पोजेबल बाँझ दस्ताने का उपयोग करें.
  2. एनेस्थेटिक आइसोफ्लूरेन साँस लेना (3%-4% और 1% पर रखरखाव-2%) प्रक्रिया के बाकी के लिए । सभी दानदाताओं और प्राप्तकर्ता पशु रिक्तिपूर्व बुप्रेनोमॉर्फिन ०.१ मिलीग्राम/किग्रा शरीर के वजन में दर्दनाशक दवाओं के लिए subcuतापूर्वक दे ।
  3. अब, चूहे एक लापरवाह स्थिति में जगह और बाँझ मास्किंग टेप के साथ अंग स्थिर ।
  4. उदर क्षेत्र से बाल निकालने के लिए यांत्रिक क्लिपर का प्रयोग करें ।
    1. एक आंख स्नेहक लागू करते हैं और बाँझ जाली povidone-आयोडीन में लथपथ का उपयोग करें, धुंध isopropyl शराब में लथपथ द्वारा पीछा किया, शल्य चिकित्सा क्षेत्र करने के लिए ।
    2. पहले चीरा करने के लिए, सुनिश्चित करें कि चूहा पर्याप्त रूप से पैर की अंगुली चुटकी वापसी पलटा की अनुपस्थिति की जाँच करके anesthetized है.
  5. कैंची का उपयोग कर, एक बड़ी अनुदैर्ध्य मिडलाइन त्वचा और मांसपेशियों चीरा से सिफिसिज़ जघनरोम से xiphoid, और पेरिटोनियल गुहा में प्रवेश करने से शुरू करते हैं ।
  6. अंतः उदर गुहा को प्रकट करने के लिए उदर भित्ति के दोनों ओर दो प्रतिट्रैक्टर डालें ।
  7. एक नम बाँझ जाली के साथ आंत को कवर और यह पेट के दाहिने पार्श्व की ओर शिफ्ट, महाधमनी, वेना cava, और बाईं गुर्दे को उजागर । आंतों और पेट के अंगों को नम और सामान्य तापमान पर रखने के लिए 1 सीसी सिरिंज के साथ 1 मिलीलीटर preheated नमकीन लगाएं ।
    1. एक दूसरे नम धुंध को कवर करने के लिए और गुर्दे और एक छोटे से नम धुंध के लिए पेट और तिल्ली कपाल को लागू करने के लिए उजागर गुर्दे को कवर करने के लिए (चित्रा 1) ।
  8. का प्रयोग करें microsurgical विच्छेदन संदंश को अलग और संयोजी ऊतक और एक दूसरे से बाईं गुर्दे धमनी और नस जुटाने । बाएँ गुर्दे की नस को अलग करने के लिए छोड़ दिया जननांगों नस cauterizing और अधिवृक्क धमनी cauterizing द्वारा बाईं गुर्दे धमनी को अलग. उसके बाद, महाधमनी और वेना कावा बेहतर और बाएं गुर्दे वृद्दि विदारक संदंश के साथ संयोजी ऊतक विदारक द्वारा अवर (चित्रा 1बी) ।
  9. विभाजित और संयोजी ऊतक विदारक का उपयोग कर ऊतकों से मूत्रनलिका जुटाने, और 2 सेमी की लंबाई में एक विकर्ण चीरा गुर्दे श्रोणि से मापा बनाने, microscissors का उपयोग कर. एक पॉलियामाइड कफ डालें ( सामग्रियों की तालिकादेखें) आधे रास्ते में मूत्रयंत्र में और 8-0 के साथ एक गाँठ रखकर कफ सुरक्षित रेशम सीवन (चित्र 1ग) ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि सभी वसा और संयोजी ऊतक मूत्रयंत्र से दूर नहीं है, के रूप में वे आसंजन की वजह से बाधा के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करते हैं, और उनके हटाने मूत्रल परिगलन का कारण हो सकता है । मूत्रवाहिनी के लिए ऑक्सीजन की आपूर्ति पोत के संरक्षण पर अतिरिक्त ध्यान देना.
  10. विदारक संदंश या microscissors का उपयोग कर परिवृक्कीय वसा से अलग करके बाईं गुर्दा जुटाने । किडनी से जुड़ी एडिपोज कैप्सूल को छोड़ दें और उस साइट का इस्तेमाल किडनी से निपटने के लिए करें ।
    1. अवर वेना cava बेनकाब ।
  11. Penile नस के माध्यम से एक 27 जी सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग हेपरिन के २०० इकाइयों प्रशासन । खून बह रहा है रोकने के लिए एक कपास झाड़ू के साथ इंजेक्शन की साइट कम से कम 1 मिनट के लिए दबाव ।
  12. पोर्टल शिरा (पीवी) और अवर वेना कावा (ivc) (चित्रा 1डी) की पहचान. 16 ग्राम सुई (चित्र 1ई) का उपयोग करते हुए पोर्टल शिरा में हेपरिन की ५०० इकाइयों के साथ मिश्रित ५० मिलीलीटर कोल्ड नमकीन का इंजेक्शन लगाकर गुर्दे को फ्लश कर देते हैं । निस्तब्धता से पहले, अवर वेना कावा बुनियादी स्तर पर कटौती और पोर्टल नस सुई प्रविष्टि साइट पर पुच्छ रक्त परिसंचरण से बाहर निकलने के लिए अनुमति देने के लिए । धीरे से खारा घोल infusing द्वारा गुर्दे निस्तब्धता शुरू करो । गहरे लाल से एक समान धूसर और पीला रंग में गुर्दे के रंग के परिवर्तन का प्रेक्षण कीजिए (चित्र 1थ्) ।
  13. निस्तब्धता के बाद, गुर्दे की धमनी और शिरा के लिए समीपस्थ महाधमनी और वेना कावा और बर्फ पर ठंडे खारा में एक पेट्री डिश में flushing गुर्दे जगह है । चित्रा 2 एक दाता प्रक्रिया के योजनाबद्ध सिंहावलोकन का प्रतिनिधित्व करता है ।
  14. एक बार गुर्दे ठंड खारा में है, तय करने और नस कफ के हैंडल को स्थिर ( सामग्री की मेजदेखें) और धीरे से कफ के माध्यम से गुर्दे की नस खींच । फिर, आठ-शून्य रेशम सीवन (चित्र 2b) का उपयोग करके तीन गाँठों को रखकर कफ के ऊपर वृक्क शिरा को ठीक करें ।
    नोट: यह जगह में सुरक्षित है, जबकि नस के उंमुखीकरण पर विशेष ध्यान देना । घुमाया नसों रक्त के प्रवाह की एक रुकावट के कारण और घनास्त्रता के लिए सीसा ।

2. प्राप्तकर्ता प्रक्रिया

  1. दाता प्रक्रिया से 1.1 – 1.11 चरणों को दोहराएं ।
  2. दो atraumatic माइक्रो-पोत बाईं गुर्दे धमनी और शिरा के लिए समीपस्थ महाधमनी और वेना कावा पर clamps (चित्रा 3ए) प्लेस ।
  3. प्राप्तकर्ता गुर्दे की शिरा को गुर्दे की प्रवेश के समीपस्थ ligate । गुर्दे की नस को heparinized खारा के साथ फ्लश करने के लिए सभी शेष रक्त पोत से बाहर निकालें ।
  4. पहले दाता गुर्दे में स्थित कफ गुर्दे की नस पर ligated गुर्दे की नस स्लाइड और यह एक 8-0 के साथ सुरक्षित रेशम सीवन (चित्रा 3बी) । कफ के ऊपर गुर्दे की नस सुरक्षित जब एक ही स्थितीय अभिविन्यास बनाए रखें.
  5. बाईं गुर्दे के निचले ध्रुव के स्तर पर मूत्रयंत्र ligate. पेरानेफेट्रिक फैट से किडनी को जुटाएं ।
  6. वृक्क धमनी समीपस्थ प्राप्तकर्ता गुर्दे के प्रवेश करने के लिए ligate. बर्तन में किसी भी अतिरिक्त रक्त को हटाने के लिए इसे heparinized खारा के साथ फ्लश । एक 10-0 नायलॉन सीवन (चित्रा 3ग) का उपयोग कर 8 से 10 बाधित टांके के साथ गुर्दे की धमनी के अंत करने के लिए अंत शाखामिलन प्रदर्शन । Adventitial परत का उपयोग करके धमनी पैंतरेबाज़ी ।
  7. गुर्दे की reperfusion पुनः आरंभ करने के लिए बर्तन clamps निकालें । धमनी (चित्रा 3डी) पर दबाना द्वारा पीछा नस पर शिकंजा हटाने के द्वारा शुरू करो । एक बाँझ कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए हल्के से शाखामिलन क्षेत्र के आसपास किसी भी बह क्षेत्रों दबाव । कुछ मिनट के लिए एक पेटेंट anastomosis प्राप्त करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए ।
  8. पर्याप्त छिड़काव का आकलन करने के लिए गुर्दे का संक्षेप में अवलोकन करें । Reperfusion के तुरंत बाद, गुर्दे रंग बदलने के लिए और धीरे से कुछ ही मिनटों के बाद अपनी प्राकृतिक गहरे लाल रंग हासिल करना चाहिए (चित्रा 3ई) । मूत्रयंत्र के दृश्य क्रमाकुंचन और ऑन-साइट मूत्र उत्पादन कभी-कभार देखा जाता है.
  9. प्राप्तकर्ता मूत्रवाहिनी में ureteral कफ के उजागर टिप डालने और एक 8-0 के साथ प्राप्तकर्ता मूत्रवाहिनी सुरक्षित द्वारा समाप्त रेशम सीवन (चित्रा 2सी और चित्रा 3एफ) ।
  10. इस स्थिति में दाता और प्राप्तकर्ता मूत्रवाहिनी रखने के लिए प्रत्येक मूत्रवाहिनी के सिरों को एक दूसरे से बांध दें ।
  11. वैकल्पिक रूप से, सही गुर्दे एक 4-0 रेशम टांका और गुर्दे को हटाने के साथ सही गुर्दे की धमनी और नस बांधने से nephrectomized किया जा सकता है ।
  12. उदर गुहा से सभी gauzes निकालें, उनके प्राकृतिक स्थिति को सभी अंगों को वापस, धार आंतों पर खारा की 1 मिलीलीटर उन्हें नम रखने के लिए, और रेक्टस मांसपेशियों पर एक 4-0 अवशोषण सीवन का उपयोग करके पेट को बंद करने और एक 4-0 रेशम सीवन त्वचा को बंद करने के लिए एक बाधित फैशन में ईआर ।

3. पश्चात की देखभाल

  1. विज्ञापन libitum पानी और भोजन के लिए उपयोग के साथ एक साफ पिंजरे में पशु प्लेस और एक ३७ डिग्री सेल्सियस हीटिंग पैड पर वसूली के लिए अनुमति देते हैं ।
  2. दर्दनाशक दवाओं के लिए ०.१ मिलीग्राम/किग्रा बुप्रेनोमॉर्फिन का इंजेक्शन लगाकर वसूली के लिए पशु की निगरानी करते हैं । अतिरिक्त दर्दनाशक दवाओं प्रशासन की जरूरत हो सकती है अगले कुछ दिनों में, असुविधा या दर्द के संकेत पर निर्भर करता है । एंटीबायोटिक दवाओं नियमित रूप से प्रशासित नहीं कर रहे हैं, के रूप में संक्रामक जटिलताओं दुर्लभ हैं ।
  3. पशु सुविधा के लिए वापस जानवर लौटने से पहले 1 के लिए वसूली-2 एच निरीक्षण । जानवर 2x निरीक्षण-पहले 24 घंटे के लिए एक दिन 3x, एक दैनिक निरीक्षण के द्वारा पीछा किया । दर्द और कष्ट, मौखिक सेवन, और मूत्र उत्पादन के संकेत पर ध्यान देना ।
  4. टांके 7-10 दिनों के ऑपरेशन के बाद निकालें ।

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Representative Results

हम syngeneic (n = 5) और allogeneic गुर्दा प्रत्यारोपण (n = 5) प्रदर्शन किया । एक syngeneic प्रत्यारोपण के साथ जानवरों को किसी भी immunosuppressive उपचार के बिना दीर्घकालिक अस्तित्व हासिल किया । पशुओं कि प्रतिरक्षादमन के बिना एक allogeneic प्रत्यारोपण प्राप्त उनके भ्रष्टाचार को अस्वीकार कर दिया और 8 दिनों की एक औसत अस्तित्व के साथ गुर्दे की विफलता के लिए झुक (चित्रा 4ए) । मतलब सीरम क्रिएटिनिन विनंती वृद्धि हुई syngeneic समूह में जबकि यह 14 से वृद्धि हुई-allogeneic समूह में गुना (०.५ मिलीग्राम/डीएल बनाम ७.० मिलीग्राम/डीएल, पी < 0.01) (चित्रा 4बी). बहिर्रोपण पर, syngeneic गुर्दा एलोकलम के स्थूल दृश्य किसी भी असामान्यताएं नहीं दिखा । किडनी का रंग और आंतरिक संरचनाएं यथावत रहीं । इसके विपरीत, अस्वीकृत जानवरों के गुर्दे allografts आंतरिक संरचनाओं के विनाश के साथ लाल रक्तस्रावी पैच प्रस्तुत (चित्रा 4सी). Syngeneic grafts के hematoxylin और eosin दाग, endothelial और mesangial कोशिकाओं की सामान्य संख्या के साथ पतली स्तम्भिकीय केशिका छोरों दिखाया. अस्वीकार कर दिया allografts सूजन और ट्यूब्यूलाइटिस के संकेत के साथ नष्ट ग्लोबलर संरचनाओं प्रदर्शित (चित्रा 4डी). टी की पुष्टि करने के लिए सेल मध्यस्थता अस्वीकृति, हम प्रदर्शन किया सीडी 8 + धुंधला. जबकि syngeneic allografts बहुत कुछ सकारात्मक सीडी 8 + टी कोशिकाओं से पता चला, खारिज कर दिया allografts में और ग्लोमेरुली और tubuli (चित्रा 4ई) के आसपास सीडी 8 + कोशिकाओं की एक काफी अधिक संख्या से पता चला, टी सेल मध्यस्थता अस्वीकृति की पुष्टि.

Figure 1
चित्रा 1 : दाता nephrectomy । (क) पेट खोलने पर, बाईं गुर्दे नम gauzes के साथ अलग है । (ख) वाम वृक्क धमनी और शिरा अलग-थलग और आसपास की चर्बी से जुटाए जाते हैं । (ग) मूत्रयंत्र एक एकल रेशम सीवन के साथ लिगलित, कफ और सुरक्षित होता है । (घ) पोर्टल शिरा (पीवी) और अवर वेना कावा (आईवीसी) की पहचान की जाती है और पोर्टल शिरा के माध्यम से गुर्दे को परिष्कृत किया जाता है । (ङ) पशुओं के पोर्टल शिरा को फ्लश करने से सही गुर्दे और यकृत के पीला होने के रूप में छिड़काव सफलतापूर्वक निष्पादित किया जाता है । (च) सफल छिड़काव एक पीला गुर्दा और प्रत्यारोपण के लिए तैयार जहाजों को दर्शाता है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : गुर्दे प्रत्यारोपण प्रक्रिया का योजनाबद्ध सिंहावलोकन। (क) दाता प्रक्रिया का योजनाबद्ध अवलोकन । (ब) एक कफ-दाता शिरा का योजनाबद्ध अवलोकन (ग) प्राप्तकर्ता और कुरूप दाता शिरा तथा मूत्रवाहिनी के एनास्टोमोसिस का योजनाबद्ध अवलोकन । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्राप्तकर्ता में गुर्दा प्रत्यारोपण । (क) प्राप्तकर्ता की धमनी और शिरा आसपास की चर्बी से जुटायी जाती है और पृथक्करण के बाद clamped होती है । (ख) दाता गुर्दा शुरू किया है, और नसों कफ तकनीक के माध्यम से जुड़े हुए है और एक 8-0 के साथ सुरक्षित टांका. (ग) धमनियों का अंत से अंत तक फैशन होता है । (घ) क्लैप्स को हटा दिया जाता है । (ङ) गुर्दे का पुन: उपयोग किया जाता है और बिना किसी रक्तस्राव के प्राकृतिक रंग को ठीक कर दिया जाता है । (च) अंत में, मूत्रवाहिनी पहले से रखा कफ का उपयोग करके anastomosed और एक 8-0 के साथ सुरक्षित कर रहे हैं टांका. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4 : गुर्दा प्रत्यारोपण अस्तित्व । (क) कयोजना-मेयेर का चित्र समय के साथ-साथ सिनाजेनेरिक या एलोजेनेमिक गुर्दा प्रत्यारोपण करने वाले चूहों के अस्तित्व को दर्शाता है । (ख) गैर-प्रतिरोपित पशुओं की तुलना में आनुवंशिक या एलोजेनेरिक गुर्दा प्रत्यारोपण वाले चूहों में सीरम क्रिएटिनिन की माप और तुलना । (ग) 8 दिन में सिंजीन (ऊपर) और एलोजेनेरिक (नीचे) गुर्दा प्रत्यारोपण के प्रत्यारोपित गुर्दे के स्थूल सिंहावलोकन । पशुओं को पौध रोपण से पूर्व लवण से परिपूर्ण किया जाता था । पिछले दो पैनलों (डी) hematoxylin और eosin धुंधला और (ई) syngeneic (ऊपर) और allogeneic (नीचे) गुर्दे की व्याख्या के सीडी 8 + के एक सूक्ष्म सिंहावलोकन दिखा । छवियों 200x इज़ाफ़ा के तहत लिया जाता है । * परिणाम सांख्यिकीय महत्वपूर्ण माना जाता था अगर पी < ०.०५ । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 : आवश्यक शल्य चिकित्सा उपकरणों . (1) सीधे कैंची । (2) बारीक कैंची । (3) माइक्रो स्प्रिंग कैंची 1 (यूरीटर लिटिगेशन) । (4) माइक्रो स्प्रिंग कैंची 2 । (5) माइक्रो स्प्रिंग कैंची 3 । (6) छोटे-जानवर सर्जिकल रिट्रेक्टर । (7) संदंश । (8) माइक्रोफोर्सेप्स, सीधे, चिकनी । (9) विच्छेदन संदंश, घुमावदार । (10) माइक्रो सुई होल्डर । (11) सुई धारक । (12) 8-0 सुई के बिना लट रेशम सीवन । (13) 4-0 रेशम सीवन । (14) माइक्रो-वेसल क्लैम्प्स (एक जोड़ी) । (15) माइक्रो-वेसल क्लैंप एप्पनियर । 16फाइन-टिप क्लैम्प । (17) हेपरिन । (18) पोत क्लैंप (मध्यम आकार) । (19) पोत दबाना (बड़ा) । (20) बंध्य कपास swabs । (21) 10-0 सूक्ष्म सीवन सुई के साथ । 22बाँझ जाली । (23) heparinized खारा फ्लश सिरिंज । (24) ६० सीसी सिरिंज से सुई । (25) 10 सीसी की सिरिंज । (26) 1 सीसी सिरिंज । (27) 25 ग्राम 5/8 इंच की सुई । (28) 19 जी सुई । 29ट्रिमर । (30) द्विध्रुवी कौश प्रणाली । (31) टेप । (३२) पेट्री डिश ०.९% नॉर्मल नमकीन के साथ । (३३) ६० सीसी सिरिंज के साथ ५० सीसी heparinized खारा के लिए छिड़काव । (३४) 10 सीसी सिरिंज के साथ 5 सीसी heparinized खारा फ्लश । (३५) यूरीटर कफ । (३६) शिरा कफ । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस पांडुलिपि में, हम विस्तार से चूहों में orthotopic KT के लिए शल्य चिकित्सा पद्धति का वर्णन, सभी आवश्यक इस प्रक्रिया को करने के लिए जरूरी उपकरणों सहित (चित्रा 5) । १९६५ में, फिशर और ली ने चूहों में KT पर पहली रिपोर्ट प्रकाशित की, जो एक रोमांचक खोजी क्षेत्र18की शुरुआत बन गई । तब से इस मॉडल की पुनरुद्भयता में सुधार के लिए कई संशोधन पेश किए गए हैं । यह ischemia-reperfusion चोट और गुर्दे प्रत्यारोपण अस्वीकृति और सहिष्णुता का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी पशु मॉडल के रूप में सेवा की है, आंशिक और पूर्ण mhc बेमेल संयोजन19के साथ कई अंत: प्रजात और outbred उपभेदों की उपलब्धता के लिए धंयवाद । चूहा केटी मॉडल सूअर और केटी के अमानुषिक रहनुमा मॉडलों के लिए जांच का विस्तार करने से पहले hypotheses का परीक्षण करने के लिए एक उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं । कृंतकों में गुर्दा प्रत्यारोपण अस्वीकृति या सहिष्णुता का अध्ययन करने के लिए विकल्प सीमित हैं । चूहों में गुर्दा प्रत्यारोपण मॉडल तकनीकी रूप से बहुत चुनौतीपूर्ण है और > 80%20के जीवित रहने की दर को प्राप्त करने के लिए एक लंबे समय से प्रशिक्षण की अवधि की आवश्यकता है । माउस मॉडल की एक और सीमा के बारे में प्राप्तकर्ताओं के 30% में प्रतिरक्षादमन के लिए की आवश्यकता के बिना सहज गुर्दे allograft स्वीकृति है । हालांकि, चूहों में अन्य अंग प्रत्यारोपण, जैसे त्वचा और दिल, 10 दिनों के भीतर अस्वीकार कर दिया, पूरी तरह से MHC-बेमेल चूहों में गुर्दे allografts की अस्वीकृति कमजोर है और नैदानिक स्थिति21के प्रतिनिधि नहीं है कि सुझाव दे रहे हैं । तथापि, यदि तकनीकी चुनौती को दूर किया जा सकता है तो एमआईसीई मॉडलों को आनुवंशिक रूप से संशोधित दस्तक-इन या नॉक आउट चूहों की उपलब्धता के कारण एलोकरप्शन अस्वीकृति के तंत्र अध्ययनों के लिए वरीयता दी जाती है ।

केटी चूहों में तरीकों की एक संख्या में किया जा सकता है । हम इन विभिंन तरीकों के कुछ फायदे और नुकसान पर चर्चा करेंगे । पसंदीदा तकनीक के बावजूद, यह हमेशा के लिए गर्म ischemia समय को कम करने और भ्रष्टाचार और प्राप्तकर्ता को अपरिवर्तनीय चोट से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ।

दायां बनाम बायां गुर्दा
चूहों का पेट एनाटॉमी इंसानों से बहुत मिलता-जुलता है । बाईं गुर्दा जिगर की संरचनात्मक स्थिति की वजह से सही गुर्दे की तुलना में बेहतर स्थित है । बाईं गुर्दे का उपयोग करने का एक लाभ वाहिकाओं की लंबाई है । आम तौर पर, बाईं गुर्दे धमनी और नस दो बार सही गुर्दे वाहिकाओं की लंबाई हैं । यह विशेष रूप से फायदेमंद है जब एनास्टोरोसिस है जहां जहाजों की लंबाई एक सीमित कारक नहीं है । हालांकि, रिपोर्ट सही तरफा दाता गुर्दा पुनःप्राप्ति और प्रत्यारोपण22,23मौजूद हैं । प्रत्यारोपण के लिए दोनों गुर्दे का उपयोग कर दृष्टिकोण भी24बताया गया है ।

पोर्टल शिरा के माध्यम से दाता गुर्दे flushing
इस प्रक्रिया के प्रमुख चरणों में से एक दाता गुर्दे perfusion है । Perfusion के लिए जहाजों और गुर्दे से सभी दाता रक्त को हटाने और अंग शांत करने के लिए धीमी गति से जैविक गिरावट के लिए आवश्यक है । वहां विभिंन गुर्दे perfusing के लिए वर्णित तरीके हैं । हम विभिंन तरीकों से गुर्दे की निस्तब्धता के साथ प्रयोग किया है और निष्कर्ष निकाला है कि पोर्टल शिरा के माध्यम से गुर्दे निस्तब्धता लाभ प्रदान करता है और लगातार गुर्दे और जहाजों का पूरा छिड़काव की ओर जाता है । साहित्य में वर्णित पारंपरिक दृष्टिकोण गुर्दे धमनी और शिरा ligating के बाद दाता गुर्दे निस्तब्धता आवश्यक है या infrarenal महाधमनी24,25,26,27 के माध्यम से पतित , 28. इन तरीकों endothelial नुकसान और वृद्धि हुई स्थानीय दबाव की वजह से गुर्दे वाहिकासंकीर्णन के लिए नेतृत्व कर सकते है या अधूरा छिड़काव के कारण कम छिड़काव के दबाव29,30।

पोर्टल शिरा के माध्यम से गुर्दे को फ्लश करके, दबाव दिल द्वारा प्रबंधित किया जाता है । छिड़काव के दौरान, दिल अभी भी सक्रिय है और एक सामांय फैशन में छिड़काव तरल पदार्थ के साथ महाधमनी और गुर्दे के लिए पल्सटाइल प्रवाह, कतरनी दबाव प्रवाह के कारण केशिकाओं और स्तंभी को रोकने के नुकसान । जब वृक्क ब्लॉक या प्रत्यारोपण के लिए सही गुर्दे का उपयोग करते हुए प्रत्यारोपण, इस विधि एक समान छिड़काव प्राप्त करने के लिए और एक ही समय में दोनों गुर्दे फसल के लिए उपयुक्त है ।

धमनी और शिरापरक एनास्टोमोसिस
चूहा केटी मॉडल में सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक एक विश्वसनीय microvascular एक समय में कुशल तरीके से शाखामिलन प्रदर्शन कर रहा है । दाता गुर्दे की धमनी को प्राप्तकर्ता के गुर्दे की धमनी या महापर्वता के लिए अनास्तामोदित किया जा सकता है । एनास्टोमोसिंग महाधमनी और अवर वेना कावा के लिए दाता वाहिकाओं प्राप्तकर्ता के अंगों को इस्केमिक चोट का कारण बनता है. इस प्रोटोकॉल में, हम गुर्दे की धमनियों के अंत करने के लिए अंत शाखामिलन प्रदर्शित, के रूप में यह अंय अंगों को इस्कीमिक चोट से बचा जाता है । धमनी anastomosis के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि जब पोत हैंडलिंग लुमेन की endothelial सतह को नुकसान नहीं है । नस anastomosis के लिए, हम एक कफ तकनीक का उपयोग करने के लिए गर्म ischemia समय को कम करने और ऑपरेटिव प्रक्रिया को छोटा । यह एक बहुत ही विश्वसनीय और टिकाऊ विधि पर्याप्त शिरापरक प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए साबित हो गया है । पर्याप्त शिरापरक प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए, यह एक साथ सुरक्षित कर रहे हैं जब नसों kinked या मुड़ नहीं करने के लिए आवश्यक है । वैकल्पिक रूप से, एक अंत करने के लिए अंत या एक अंत करने वाली साइड नस शाखामिलन सर्जन की वरीयता के आधार पर संभव है । आदर्श रूप में, धमनियों और शिरापरक पोत शाखामिलन के बीच ले जाना चाहिए 20 – 30 मिनट.

Pahlavan एट अल. एक साहित्य स्क्रीनिंग31पर आधारित तकनीक के प्रत्येक प्रकार की जटिलताओं संक्षेप । मुख्य जटिलताओं में से एक है कि किसी भी microsurgical पोत के बाद हो सकता है शाखामिलन घनास्त्रता है । लिगेशन और प्राप्तकर्ता जहाजों की पर्याप्त निस्तब्धता काफी घनास्त्रता गठन को कम, और यह निश्चित रूप से एक उलझन अक्सर नहीं मनाया जाता है । अन्य जटिलताओं रिसाव या reperfusion के बाद शाखामिलन के टूटना कर रहे हैं । यह अपर्याप्त माइक्रोसर्जिकल तकनीक या जहाजों की अपर्याप्त हैंडलिंग से संबंधित है ।

यूरीटेरल एनास्टोमोसिस
विशेष रूप से दाता में मूत्रयंत्र के अलगाव के दौरान, मूत्रयंत्र को अत्यंत सावधानी से संभाला जाना चाहिए । परिसरणीय संरचनाओं के लिए चोट ureteral ischemia निंदा और रुकावट के लिए अग्रणी पैदा कर सकता है और, सबसे खराब स्थिति में, ureteral परिगलन । साहित्य में मूत्रल एनास्टोनोसिस के लिए अलग तरीके बताए गए हैं । अंत करने के लिए अंत, कफ की सहायता से अंत करने के लिए अंत, मूत्राशय पैच, और मूत्राशय प्रविष्टि सबसे अधिक इस्तेमाल किया19,३२,३३हैं । पिछले अध्ययनों में, हम दोनों सिरों पर तिर्यक किनारों के साथ एक कफ का इस्तेमाल किया है दोनों सिरों पर मूत्रयंत्र में प्रवेश की सुविधा । हम किसी भी मूत्र रिसाव या रक्त का थक्का संरचनाओं का पालन नहीं किया । तथापि, इस तकनीक की दीर्घकालिक जटिलताओं (> 30 दिनों) में हाइड्रोनोफ्रेरोसिस और कभी-कभार नेफ्रोलिथिएसिस शामिल हैं, जिसे मूत्रनाल के पत्थरों के कारण स्ट्रिक्चर गठन, अव्यवस्था या कफ की रुकावट से समझाया जा सकता है । यह निष्कर्ष अन्य रिपोर्टों और कफ के साथ मूत्रल एनास्टोसिस के हमारे अपने निष्कर्षों के अनुरूप है । मूत्रवर्धक जटिलताओं अक्सर गुर्दे के लिए महत्वपूर्ण चोट के बाद postoperatively देखा जाता है, असालवणीय हैं, और पशु euthanized की आवश्यकता होती है ।

पश्चात की देखभाल और उत्तरजीविता
प्रतिरोपित पशुओं के पश्चात की देखभाल के लिए पर्याप्त दर्द प्रबंधन और जानवरों की समग्र गतिविधि, वजन टिप्पणियों, और मूत्र उत्पादन की विस्तृत टिप्पणियों की आवश्यकता है । आम जल्दी पश्चात की जटिलताओं धमनी या शिरापरक anastomosis, मूत्र रिसाव, मूत्रल रुकावट, या लंबे समय तक ischemia समय की वजह से भ्रष्टाचार समारोह में देरी से खून बह रहा शामिल हैं । इन जटिलताओं के साथ जानवरों मामूली गतिविधि दिखाने के लिए और आमतौर पर कोई मूत्र उत्पादन और पोषक तत्वों की खपत के साथ एक hunched-वापस स्थिति में रहते हैं । आम तौर पर, यह अप करने के लिए प्रशासित करने के लिए अनुकूल है 5 पशुओं को नमकीन के मिलीलीटर postoperatively उनकी वसूली में तेजी लाने के लिए और निर्जलीकरण को रोकने के । कोई प्रतिरक्षादमन प्राप्त जानवरों 7 से 10 दिनों के बीच जीवित रह सकते हैं, जो उपन्यास दवाओं या अन्य तरीकों का परीक्षण करने के लिए एक पर्याप्त चिकित्सकीय खिड़की के लिए अनुमति देता है. यदि पशुओं को पर्याप्त मात्रा में प्रतिरक्षा (१.० मिलीग्राम/किग्रा/दिन FK506) या सहिष्णु हैं, तो उन्हें पिछले 6 महीनों से लंबे समय तक मॉनिटर किया जा सकता है, जैसाकि पहले बताया गया था । चूहे गुर्दा प्रत्यारोपण मॉडल स्टेम सेल जुटाने का एक अनूठा दृष्टिकोण का उपयोग करके प्रेरित सहिष्णुता के तंत्र की परिभाषा की अनुमति दी३४बड़े पशुओं में इस घटना की पुष्टि करने से पहले । चूहा केटी दशकों के लिए जांचकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान की है, और यह भविष्य में ऐसा करने के लिए जारी रहेगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम Bombeck परिवार एस्टेट से एक उदार उपहार द्वारा वित्त पोषित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buprenorphine HCL Reckitt Benckiser Healthcare UK NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved Zhenbang, China 11cm Flat handle 
Heparin sodium injection USP Sagent Pharmaceuticals  NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth Jingzhong, China WA3010
Micro needle holder Jingzhong, China WA2010
Micro vessel clamps Jingzhong, China WA40120
Micro spring sciccor 1 ROBOZ RS-5620
Micro spring sciccor 2 F.S.T. 91501-09
Micro spring sciccor 3 Zhenbang, China 8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506) Astellas
Rats Charles River & Taconic Biosciences  LEW/Crl & DA-M 
Shaver Wahl 79600-2101
Suture 4-0 Ethicon J304H
Suture, 4-0  Ethicon 683G
Suture, 10-0  Ethicon 2820G
Syringes & Needles BD
Thread, 8-0 Ashaway 75290
Ureteral cuff Microlumen 160-1 Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm 
Venous cuff Intramedic BD 7441 PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm

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References

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दवा मुद्दा १४७ गुर्दे प्रत्यारोपण orthotopic चूहा जीवन रक्षा अस्वीकृति सहिष्णुता
Orthotopic चूहा गुर्दा प्रत्यारोपण: एक उपंयास और सरलीकृत सर्जिकल दृष्टिकोण
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Ahmadi, A. R., Qi, L., Iwasaki, K.,… More

Ahmadi, A. R., Qi, L., Iwasaki, K., Wang, W., Wesson, R. N., Cameron, A. M., Sun, Z. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. J. Vis. Exp. (147), e59403, doi:10.3791/59403 (2019).

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