Summary
El propósito de este manuscrito y el protocolo es explicar y demostrar en detalle el procedimiento quirúrgico de trasplante ortotópico de riñón en ratas. Este método se simplifica para lograr la correcta perfusión del riñón del donante y acortar el tiempo de reperfusión mediante el uso de la técnica de anastomosis del manguito venoso y ureteral.
Abstract
El trasplante de riñón ofrece mayores tasas de supervivencia y una mejor calidad de vida para los pacientes con enfermedad renal terminal, en comparación con cualquier tipo de terapia de reemplazo renal. En las últimas décadas, el modelo de trasplante de riñón de rata se ha utilizado para estudiar los fenómenos inmunológicos de rechazo y tolerancia. Este modelo se ha convertido en una herramienta indispensable para probar nuevos fármacos inmunomoduladores y regímenes antes de proceder con costosos estudios preclínicos de animales grandes.
Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo realizar de forma fiable el trasplante de riñón ortotópico en ratas. Este protocolo incluye tres pasos distintivos que aumentan la probabilidad de éxito: la perfusión del riñón del donante mediante el lavado a través de la vena porta y el uso de un sistema de manguito para anastomozar las venas renales y los uréteres, disminuyendo así el frío y el calor tiempos de isquemia. Usando esta técnica, hemos logrado tasas de supervivencia más allá de 6 meses con creatinina sérica normal en animales con trasplantes de riñón singénicos o tolerantes. Según el objetivo del estudio, este modelo puede modificarse mediante tratamientos previos o posteriores al trasplante para estudiar el rechazo agudo, crónico, celular o mediado por anticuerpos. Es un modelo animal reproducible, fiable y rentable para estudiar diferentes aspectos del trasplante de riñón.
Introduction
Históricamente, los primeros estudios de rechazo de trasplantes fueron realizados por Brent y Medawar usando trasplantes de piel en roedores1. Pronto se hizo evidente que la piel tiene rasgos inmunológicos distintos, por lo que es un órgano altamente inmunogénico que es diferente en el rechazo de otros órganos sólidos vascularizados2. Los estudios de rata sobre el rechazo del trasplante de órganos sólidos se limitan habitualmente a los trasplantes de corazón, hígado y riñón. Aunque cada uno de estos órganos es adecuado para estudiar el rechazo, hay ventajas y desventajas para cada uno de ellos. Los trasplantes de corazón a menudo se trasplantan en el abdomen y se anastomizadas a la aorta y la vena cava, con el corazón nativo del receptor en el lugar3. Esto no recrea las condiciones clínicas, anatómicas y fisiológicas humanas. Además, los corazones son muy sensibles a la isquemia fría y tienen que ser reperfusionados preferentemente dentro de 1 h con el fin de poder recuperar su función4. Los trasplantes de hígado se consideran generalmente para ser quirúrgicamente más desafiantes y sensibles al tiempo para realizar. Después de extirpar el hígado nativo, el hígado del donante tiene que ser implantado y reperfusionado dentro de 30 minutos, ya que los receptores no pueden durar más tiempo sin un funcionamiento del hígado5. La arteria hepática, la vena porta, y especialmente la reconstrucción del conducto biliar requiere habilidades quirúrgicas refinadas. Además de los desafíos quirúrgicos, el hígado es conocido por poseer propiedades tolerogénicas y los roedores y los seres humanos pueden llegar a ser operativamente tolerantes6,7,8. El riñón, a diferencia de los órganos antes mencionados, puede ser trasplantado de forma ortotópica, se sabe que es un órgano inmunogénico con episodios de rechazo consistentes y reproducibles (si no inmunosuprimidos), y permite la isquemia prolongada en frío de varios Horas. Esto hace que el trasplante de riñón de rata sea un modelo ideal para estudiar el rechazo de aloinjertos y la tolerancia.
El trasplante de riñón (KT) es la elección preferida de tratamiento para pacientes con enfermedad renal terminal. En las últimas décadas, los resultados de supervivencia a corto plazo después de KT han mejorado drásticamente, pero los resultados de supervivencia a largo plazo están estancado9. Los regímenes inmunosupresores convencionales siguen siendo la terapia antirechazo estándar. Sin embargo, el uso crónico de terapias inmunosupresoras provoca una morbilidad y mortalidad significativas, como nefrotoxicidad, diabetes y tumores malignos secundarios10,11,12. A largo plazo, el rechazo crónico de anticuerpos y mediado por celulares amenaza la supervivencia del injerto, con opciones terapéuticas limitadas disponibles.
Un objetivo importante en el trasplante es la inducción de la tolerancia al trasplante con el fin de obviar la necesidad de inmunosupresión crónica. El modelo KT de rata es una herramienta robusta para investigar el proceso de rechazo inmunológico y evaluar nuevos enfoques para la inmunomodulación y la tolerancia al trasplante. La rata también sirve como un modelo adecuado para estudiar el rechazo agudo y crónico mediado por células y anticuerpos13,14,15,16,17. Este modelo quirúrgico ha demostrado ser una herramienta fiable, reproducible y rentable para estudiar diversos aspectos del rechazo y la tolerancia a los aloinjertos. A menudo se utiliza para probar nuevos protocolos inductores de tolerancia antes de emprender estudios costosos y engorrosos de animales grandes. La realización de KT en ratas requiere una amplia formación quirúrgica y experiencia para alcanzar tasas de supervivencia de > 90%. En este manuscrito y en el video instructivo que acompaña, proporcionamos un esquema paso a paso para el ortotópico KT en la rata, como se realizó con éxito durante muchos años en nuestra institución.
Antes de iniciar cualquier procedimiento, la selección de donantes y receptores es fundamental y depende de la naturaleza del experimento. Idealmente, los donantes y los beneficiarios deben pesar entre 220 – 260 g y tener entre 8 – 12 semanas de edad. Los animales de menos de 220 g tienen arterias, venas y uréteres de diámetro pequeño, lo que hace que la anastomosis en el recipiente sea particularmente desafiante. La pérdida de sangre leve puede causar hipovolemia y provocar la muerte en animales más pequeños. Los animales más pesados que 260 g muestran más grasa alrededor de sus vasos, y el aislamiento del recipiente requerirá más tiempo operativo y aumentar el tiempo de isquemia fría.
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Protocol
Lewis (RT11) y Dark Agouti (da) (RT1Aa) las ratas fueron compradas a vendedores comerciales (ver la tabla de materiales). Estas cepas totalmente no coincidentes de MHC se utilizan a menudo para estudiar el rechazo agudo de aloinjerto renal. Todos los animales fueron alojados y mantenidos de acuerdo con las pautas de los institutos nacionales de salud (NIH) en una instalación específica libre de patógenos en la Universidad Johns Hopkins. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité institucional de cuidado y uso de animales.
1. procedimiento de donante
- Prepare y esterilice todos los instrumentos quirúrgicos que se utilizarán en este procedimiento como medio de esterilización y utilice guantes estériles desechables para prevenir complicaciones infecciosas.
- Anestesiar la rata donante por inhalación de isoflurano (inducción al 3% – 4% y mantenimiento al 1% – 2%) para el resto del procedimiento. Dar a todos los animales donantes y receptores la buprenorfina preventiva por vía subcutánea a 0,1 mg/kg de peso corporal para la analgesia.
- Ahora, coloque la rata en posición supina e inmovilizar las extremidades con cinta adhesiva estéril.
- Utilice una cortadora mecánica para eliminar el vello de la zona abdominal.
- Aplicar un lubricante para los ojos y utilizar gasa estéril empapado en povidona-yodo, seguido de gasa empapada en alcohol isopropílico, para esterilizar el campo quirúrgico.
- Antes de la primera incisión, asegúrese de que la rata esté adecuadamente anestesiada comprobando la ausencia del reflejo de retirada de pellizco del dedo del pie.
- Usando las tijeras, comience haciendo una gran piel longitudinal de la línea media y la incisión muscular de la sínfisis pubis al xiphoid, y entrar en la cavidad peritoneal.
- Inserte dos retractores a cada lado de la pared abdominal para exponer la cavidad intra abdominal.
- Cubra el intestino con una gasa húmeda estéril y cambie a la parte lateral derecha del abdomen, exponiendo la aorta, la vena cava y el riñón izquierdo. Aplicar 1 mL de solución salina precalentada con una jeringa de 1 CC para mantener los intestinos y los órganos abdominales húmedos y a una temperatura normal.
- Aplicar una segunda gasa húmeda para cubrir y movilizar el estómago y el bazo craneal al riñón y una pequeña gasa húmeda para cubrir el riñón expuesto (figura 1a).
- Utilice fórceps de disección microquirúrgica para aislar y movilizar la arteria renal izquierda y la vena del tejido conjuntivo y entre sí. Aísla la vena renal izquierda cauterizando la vena gonadal izquierda y aísla la arteria renal izquierda cauterizando la arteria suprarrenal. Después de eso, movilizar la aorta y la vena cava superior e inferior del pedículo renal izquierdo Diseccionando el tejido conjuntivo con fórceps diseccionante (figura 1B).
- Divida y movilice el uréter del tejido conectivo usando fórceps Diseccionando, y haga una incisión diagonal a una longitud de 2 cm medida desde la pelvis renal, utilizando microtijeras. Inserte un manguito de poliamida (ver tabla de materiales) a mitad de camino en el uréter y asegure el manguito colocando un nudo con 8-0 sutura de seda (figura 1C).
Nota: es importante no eliminar toda la grasa y el tejido conjuntivo del uréter, ya que proporcionan protección contra la obstrucción causada por adherencias, y su extirpación puede causar necrosis ureteral. Preste especial atención a preservar el recipiente que suministra oxígeno al uréter. - Moviliza el riñón izquierdo separándolo de la grasa perinédrica usando fórceps Diseccionando o microtijeras. Deje la cápsula adiposa del riñón unida y use ese sitio para manipular el riñón.
- Exponer la vena cava inferior.
- Administrar 200 unidades de heparina usando una jeringa con una aguja de 27 G a través de la vena del pene. Presionar el sitio de inyección con un hisopo de algodón durante al menos 1 minuto para prevenir el sangrado.
- Identificar la vena porta (PV) y la vena cava inferior (IVC) (figura 1D). Enjuague el riñón inyectando 50 mL de solución salina fría mezclada con 500 unidades de heparina en la vena porta utilizando una aguja de 16 G (figura 1E). Antes de enjuagar, corte la vena cava inferior a nivel infrahepático y la vena porta caudal en el sitio de inserción de la aguja para permitir que la sangre salga de la circulación. Empiece a enjuagar el riñón gradualmente infunde la solución salina. Observar un cambio de color del riñón de rojo oscuro a un gris uniforme y color pálido (figura 1F).
- Después del lavado, ligar la arteria renal y la vena proximal a la aorta y la vena cava y coloca el riñón enrojecido en una placa de Petri en solución salina fría sobre hielo. Figura 2 A representa la visión esquemática del procedimiento de donante.
- Una vez que el riñón está en solución salina fría, fije e inmovilizar el mango del manguito de la vena (ver la tabla de materiales) y tire suavemente de la vena renal a través del manguito. A continuación, fije la vena renal sobre el manguito colocando tres nudos usando sutura de seda de ocho ceros (figura 2B).
Nota: Preste especial atención a la orientación de la vena mientras la protege en su lugar. Las venas rotadas causan una obstrucción del flujo sanguíneo y conducen a la trombosis.
2. procedimiento del receptor
- Repita los pasos 1.1 – 1.11 del procedimiento del donante.
- Colocar dos abrazaderas de microrecipiente atraumática en la arteria renal izquierda y la vena proximal a la aorta y la vena cava (figura 3A).
- Ligar la vena renal del receptor proximal a la entrada del riñón. Enjuague la vena renal con solución salina heparinizada para extraer toda la sangre restante del recipiente.
- Deslice la vena renal ligada sobre la vena renal con manguito colocada previamente en el riñón del donante y fíjla con un 8-0 sutura de seda (figura 3B). Mantenga la misma orientación posicional al fijar la vena renal sobre el manguito.
- Ligate el uréter a nivel del polo inferior del riñón izquierdo. Movilizar el riñón de la grasa perinédrica.
- Ligate la arteria renal proximal a la entrada del riñón receptor. Lávelos con solución salina heparinizada para eliminar el exceso de sangre en el recipiente. Realizar una anastomosis de extremo a extremo de la arteria renal con 8 a 10 suturas interrumpidas utilizando una sutura de nylon 10-0 (figura 3C). Maniobra la arteria usando la capa adventicial.
- Retire las abrazaderas del recipiente para reiniciar la reperfusión del riñón. Empiece quitando la abrazadera en la vena seguida de la abrazadera en la arteria (figura 3D). Utilice un bastoncillo de algodón estéril para presionar ligeramente las áreas de supreación alrededor de la región de anastomosis. Unos minutos deberían ser suficientes para lograr una anastomosis de patente.
- Observe brevemente el riñón para evaluar la perfusión adecuada. Inmediatamente después de la reperfusión, el riñón debe cambiar de color y recuperar gradualmente su color rojo oscuro natural después de unos minutos (figura 3E). A veces se observan peristalsis visible del uréter y de la producción de orina in situ.
- Termine insertando la punta expuesta del manguito ureteral en el uréter receptor y asegure el uréter receptor con un 8-0 sutura de seda (figura 2C y figura 3F).
- Con el fin de mantener los uréteres donantes y receptores en posición, atar los extremos de cada lado del uréter entre sí.
- Opcionalmente, el riñón derecho puede ser nefrectomizado atando la arteria y la vena renal derecha con una sutura de seda 4-0 y quitando el riñón.
- Remover todas las gasas de la cavidad abdominal, devolver todos los órganos a su posición natural, chorro 1 ml de solución salina sobre los intestinos para mantenerlos húmedos, y cerrar el abdomen mediante el uso de una sutura absorbible 4-0 en el músculo del recto y una sutura de seda 4-0 para cerrar la piel yacía ER de manera interrumpida.
3. la atención postoperatoria
- Coloque el animal en una jaula limpia con acceso a agua y alimentos ad libitum y permita la recuperación en una almohadilla térmica de 37 ° c.
- Inyectar 0,1 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea para la analgesia y vigilar al animal para su recuperación. La administración de analgésicos adicionales puede ser necesaria en los próximos días, dependiendo de los signos de malestar o dolor. Los antibióticos no se administran rutinariamente, ya que las complicaciones infecciosas son raras.
- Observar la recuperación durante 1 – 2 h antes de devolver el animal a la instalación animal. Inspeccione el animal 2x – 3x al día durante las primeras 24 h, seguido de una inspección diaria. Preste atención a los signos de dolor y angustia, la ingesta oral y la producción urinaria.
- Retire los puntos 7 – 10 días después de la operación.
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Representative Results
Realizamos trasplantes de riñón singénicos (n = 5) y alogénicos (n = 5). Los animales con un trasplante singénico lograron una supervivencia a largo plazo sin ningún tratamiento inmunosupresor. Los animales que recibieron un trasplante alogénico sin inmunosupresión rechazaron su injerto y sucumbió a la insuficiencia renal con una mediana de supervivencia de 8 días (figura 4a). La creatinina sérica media aumentó modestamente en el grupo singénico, mientras que aumentó 14 veces en el grupo alogénico (0,5 mg/dL frente a 7,0 mg/dL, p < 0.01) (figura 4B). Tras la explantación, la visión macroscópica del aloinjerto renal singénico no muestra ninguna anomalía. El color del riñón y las estructuras internas permanecieron intactas. En cambio, los aloinjertos renales de animales rechazados presentaron parches hemorrágicos rojos con la destrucción de las estructuras internas (figura 4C). Las manchas de hematoxilina y eosina de los injertos singénicos mostraron bucles capilares glomerulares delgados con un número normal de células endoteliales y mesangiales. Los aloinjertos rechazados muestran estructuras glomerulares destruidas con signos de inflamación y tubulitis (figura 4D). Para confirmar el rechazo mediado por células T, realizamos manchas CD8 +. Mientras que los aloinjertos singénicos mostraron muy pocas células T CD8 + positivas, los aloinjertos rechazados mostraron un número significativamente mayor de células CD8 + en y alrededor de los glomérulos y los túnicos (figura 4E), confirmando el rechazo mediado por células t.
Figura 1 : Nefrectomía de donante. (A) al abrir el abdomen, el riñón izquierdo se aísla con gasas húmedas. (B) la arteria y la vena renal izquierda se aíslan y se movilizan desde la grasa circundante. (C) el uréter se ligaba, se cuece y se asegura con una única sutura de seda. (D) se identifican la vena porta (PV) y la vena cava inferior (IVC) y se perfunde el riñón a través de la vena porta. (E) la perfusión se ejecuta con éxito a medida que el riñón y el hígado correctos se están poniendo pálidos al enjuagar la vena porta del animal. (F) la perfusión exitosa demuestra un riñón pálido y vasos listos para el trasplante. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Descripción esquemática del procedimiento de trasplante de riñón. (A) Resumen esquemático del procedimiento de donación. (B) Descripción esquemática de una vena de donante esposado. (C) Descripción esquemática de la anastomosis del receptor y la vena de donante esposado y la anastomosis de los uréteres. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Trasplante de riñón en el recipiente. (A) la arteria y la vena del receptor se movilizan desde la grasa circundante y se sujetan tras la separación. (B) se introduce el riñón del donante, y las venas se conectan a través de la técnica del manguito y se fijan con un 8-0 Sutura. (C) las arterias se suturan en un extremo a extremo de la moda. (D) se retiran las abrazaderas. (E) el riñón está reperfusionado y recupera su color natural sin ningún sangrado. (F) finalmente, los uréteres están anastomizadas usando el brazalete previamente colocado y asegurados con un 8-0 Sutura. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Supervivencia del trasplante de riñón. (A) la figura de Kaplan-Meyer demuestra la supervivencia de las ratas con trasplantes de riñón singénicos o alogénicos a lo largo del tiempo. (B) medición y comparación de la creatinina sérica en ratas con trasplantes de riñón singénicos o alogénicos en comparación con animales no transplantados. (C) Resumen macroscópico de riñones explicados de trasplante de riñón singénico (superior) y alogénico (inferior) en el día 8. Los animales se perfusionaron con solución salina antes de explicar. Los dos últimos paneles muestran una visión microscópica de (D) la tinción de hematoxilina y eosina y (E) CD8 + de explantas de riñón singeneicas (superiores) y alogénicas (inferiores). Las imágenes se toman bajo magnificación 200x. * Los resultados se consideraron estadísticamente significativos si p < 0,05. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Instrumentos quirúrgicos requeridos . (1) tijeras rectas. (2) tijeras finas. (3) tijeras de Micro-resorte 1 (ligadura de uréter). (4) tijeras Micro-resorte 2. (5) tijeras Micro-resorte 3. (6) retractores quirúrgicos de animales pequeños. (7) fórceps. (8) microfórceps, recto, liso. (9) Diseccionando fórceps, curvados. (10) Soporte micro-aguja. (11) soporte de agujas. (12) 8-0 sutura de seda trenzada sin aguja. (13) 4-0 sutura de seda. (14) abrazaderas de microrecipiente (un par). (15) aplicador de abrazadera micro-recipiente. (16) abrazadera de punta fina. (17) Heparin. (18) abrazadera del recipiente (tamaño mediano). (19) abrazadera del recipiente (grande). (20) hisopos estériles de algodón. (21) 10-0 micro sutura con aguja. (22) gasa estéril. (23) jeringa de descarga salina heparinizada. (24) jeringa de 60 cc con aguja. (25) jeringa de 10 cc. (26) jeringa de 1 cc. (27) agujas de 25 G 5/8 pulgadas. (28) 19 G agujas. (29) trimmer. (30) sistema de cauterización bipolar. (31) cinta. (32) placa de Petri con un 0,9% de solución salina normal. (33) jeringa de 60 cc con solución salina heparinizada de 50 cc para perfusión. (34) jeringa de 10 cc con descarga salina heparinizada de 5 cc. (35) puño de uréter. (36) manguito de las venas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este manuscrito, describimos el método quirúrgico para el ortotópico KT en ratas en detalle, incluyendo todo el equipo necesario para llevar a cabo este procedimiento (figura 5). En 1965, Fisher y Lee publicaron el primer informe sobre KT en ratas, que se convirtió en el inicio de un emocionante campo de investigación18. Desde entonces, se han introducido muchas modificaciones para mejorar la reproducibilidad de este modelo. Ha servido como un modelo animal eficaz para el estudio de la lesión isquemia-reperfusión y el rechazo y tolerancia del trasplante renal, gracias a la disponibilidad de varias cepas incriadas y afloradas con combinaciones de discordancía de MHC parciales y completas19. El modelo KT de rata puede servir como una herramienta para probar hipótesis antes de extender las investigaciones a los modelos de primates cerdos y no humanos de KT. las opciones para estudiar el rechazo de trasplante de riñón o la tolerancia en roedores son limitadas. El modelo de trasplante de riñón en ratones es técnicamente muy desafiante y requiere un período de entrenamiento largo para lograr tasas de supervivencia de > 80%20. Otra limitación del modelo de ratón es la aceptación espontánea de aloinjertos renales sin la necesidad de inmunosupresión en aproximadamente el 30% de los receptores. Sin embargo, otros trasplantes de órganos en ratones, como la piel y el corazón, se rechazan en un plazo de 10 días, lo que sugiere que el rechazo de los aloinjertos renales en ratones completamente emparejados con MHC es débil y no representativo de la situación clínica21. Sin embargo, si se puede superar el desafío técnico, se preferían los modelos de ratones para los estudios de mecanismo de rechazo de aloinjerto debido a la disponibilidad de ratones de knock-in o Knock-out modificados genéticamente.
KT en ratas se puede realizar de varias maneras. Vamos a discutir algunas ventajas y desventajas de estos diversos métodos. Independientemente de la técnica preferida, siempre es fundamental reducir el tiempo de isquemia tibia y evitar lesiones irreversibles en el injerto y el receptor.
Derecho versus riñón izquierdo
La anatomía abdominal de las ratas es muy similar a la de los humanos. El riñón izquierdo se encuentra superior en comparación con el riñón derecho debido a la posición anatómica del hígado. Una de las ventajas de usar el riñón izquierdo es la longitud de los vasos. En general, la arteria y la vena renal izquierda son el doble de la longitud de los vasos renales correctos. Esto es especialmente beneficioso cuando se realiza la anastomosis donde la longitud de los recipientes no es un factor limitante. Sin embargo, existen informes de recuperación del riñón del donante derecho y trasplante22,23. Los enfoques que utilizan ambos riñones para el trasplante también se han descrito24.
Lavado del riñón del donante a través de la vena porta
Uno de los pasos clave de este procedimiento es la perfusión renal de donantes. La perfusión es necesaria para eliminar toda la sangre del donante de los vasos y los riñones y enfriar el órgano para reducir el deterioro biológico. Hay varios métodos descritos para el perfundiendo el riñón. Hemos experimentado con el lavado del riñón de diferentes maneras y concluyó que el lavado del riñón a través de la vena porta ofrece ventajas y conduce consistentemente a la perfusión completa del riñón y los vasos. Los enfoques convencionales descritos en la literatura implican enjuagar el riñón del donante después de ligar la arteria renal y la vena o retrógrada a través de la aorta infrarrenal24,25,26,27 , 28. estos enfoques pueden conducir al daño endotelial y vasoconstricción renal debido al aumento de las presiones locales o a la perfusión incompleta debido a la baja presión de perfusión29,30.
Al enjuagar el riñón a través de la vena porta, la presión es gestionada por el corazón. Durante la perfusión, el corazón sigue activo y bombea el fluido de perfusión de forma normal a la aorta y al riñón con flujo pulsátil, evitando daños a los capilares y glomérulos debido al flujo de presión de corte. Al trasplantar los riñones en bloque o utilizar el riñón adecuado para el trasplante, este método es adecuado para lograr una perfusión uniforme y para cosechar ambos riñones al mismo tiempo.
La anastomosis arterial y venosa
Uno de los pasos más críticos en el modelo de rata KT es la realización de una anastomosis microvascular fiable de una manera eficiente en el tiempo. La arteria renal del donante puede ser anastomizadas a la arteria renal del receptor o a la aorta. Anastomosing los vasos donantes a la aorta y la vena cava inferior causa lesión isquémica en los órganos del receptor. En este protocolo, demostramos la anastomosis end-to-end de las arterias renales, ya que evita lesiones isquémicos a otros órganos. Durante la anastomosis arterial, es importante no dañar la superficie endotelial del lumen al manipular el recipiente. Para la anastomosis venosa, utilizamos una técnica de manguito para reducir el tiempo de isquemia caliente y acortar el procedimiento operativo. Esto ha demostrado ser un método muy fiable y duradero para garantizar un flujo venoso adecuado. Para garantizar un flujo venoso adecuado, es imperativo que las venas no se torcer o retorcerse cuando se fijan juntas. Alternativamente, es posible una anastomosis de una vena de extremo a extremo o de extremo a lado, dependiendo de la preferencia del cirujano. Idealmente, la anastomosis de los vasos arteriales y venosos debe tomar entre 20 – 30 min.
Resumiendo las complicaciones de cada tipo de técnica en base a una revisión de la literatura31. Una de las principales complicaciones que pueden ocurrir después de cualquier anastomosis del recipiente microquirúrgico es la trombosis. La ligadura y el lavado adecuado de los recipientes receptores reducen significativamente la formación de la trombosis, y ciertamente no es una complicación observada con frecuencia. Otras complicaciones son la fuga o ruptura de la anastomosis después de la reperfusión. Esto se relaciona con una técnica microquirúrgica inadecuada o un manejo inadecuado de los recipientes.
La anastomosis ureteral
El uréter debe manipularse con sumo cuidado, especialmente durante el aislamiento del uréter en el donante. La lesión en las estructuras periuretéricas puede causar isquemia ureteral que conduce a estenosis y obstrucción y, en el peor de los casos, necrosis ureteral. La literatura reporta diferentes métodos para la anastomosis ureteral. De extremo a extremo, asistido por manguito de extremo a extremo, parche de la vejiga, y la inserción de la vejiga son los más comúnmente utilizados19,32,33. En estudios previos, hemos utilizado un manguito con bordes oblicuos en ambos extremos para facilitar la entrada en el uréter en ambos extremos. No observamos ninguna fuga de orina o formaciones de coágulos de sangre. Sin embargo, las complicaciones a largo plazo (> 30 días) de esta técnica incluyen hidronefrosis y ocasionalmente nefrolitiasis, que puede explicarse por la formación de estenosis, dislocación u obstrucción del manguito debido a las piedras ureterales. Este hallazgo es consistente con otros informes y nuestros propios hallazgos de la realización de anastomosis ureterales con un brazalete. Las complicaciones ureterales se notan a menudo después de la operación después de una lesión significativa en el riñón, son insalvables, y requieren que el animal sea eutanasia.
El cuidado postoperatorio y la supervivencia
La atención postoperatoria de los animales trasplantados requiere un manejo adecuado del dolor y observaciones detalladas de la actividad general de los animales, observaciones de peso y producción de orina. Las complicaciones postoperatorias tempranas comunes incluyen sangrado de la anastomosis arterial o venosa, fuga de orina, obstrucción ureteral, o función retardada del injerto debido a un tiempo prolongado de isquemia. Los animales con estas complicaciones muestran una actividad modesta y por lo general permanecen en una posición de espalda encorvada sin salida urinaria ni ingesta de nutrientes. Generalmente, es favorable administrar hasta 1 – 5 mL de solución salina a los animales en el postoperatorio para acelerar su recuperación y prevenir la deshidratación. Los animales que no reciben inmunosupresión pueden sobrevivir entre 7 a 10 días, lo que permite una ventana terapéutica suficiente para probar nuevos fármacos u otros métodos. Si los animales están adecuadamente inmunodeprimidos (1,0 mg/kg/día FK506 por vía subcutánea) o tolerantes, pueden ser monitoreados a largo plazo pasados los 6 meses como se informó anteriormente13. El modelo de trasplante de riñón de rata permitió la definición de los mecanismos de tolerancia inducidos por el uso de un enfoque único de movilización de células madre antes de confirmar este fenómeno en animales grandes34. Rat KT ha proporcionado información crucial a los investigadores durante décadas, y continuará haciéndolo en el futuro.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por un generoso regalo de Bombeck Family Estate.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine HCL | Reckitt Benckiser Healthcare UK | NDC12496-0757-5 | |
| Dissecting forceps, curved | Zhenbang, China | 11cm Flat handle | |
| Heparin sodium injection USP | Sagent Pharmaceuticals | NDC25021-400-10 | |
| Micro-forceps, straight, smooth | Jingzhong, China | WA3010 | |
| Micro needle holder | Jingzhong, China | WA2010 | |
| Micro vessel clamps | Jingzhong, China | WA40120 | |
| Micro spring sciccor 1 | ROBOZ | RS-5620 | |
| Micro spring sciccor 2 | F.S.T. | 91501-09 | |
| Micro spring sciccor 3 | Zhenbang, China | 8.5cm Vannas,curved | |
| Prograf (Tacrolimus/FK506) | Astellas | ||
| Rats | Charles River & Taconic Biosciences | LEW/Crl & DA-M | |
| Shaver | Wahl | 79600-2101 | |
| Suture 4-0 | Ethicon | J304H | |
| Suture, 4-0 | Ethicon | 683G | |
| Suture, 10-0 | Ethicon | 2820G | |
| Syringes & Needles | BD | ||
| Thread, 8-0 | Ashaway | 75290 | |
| Ureteral cuff | Microlumen | 160-1 | Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm |
| Venous cuff | Intramedic BD | 7441 | PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm |
References
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