Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

אורתובנושא חולדה השתלת כליה: מגישת רומן וכירורגית פשוטה

Published: May 7, 2019 doi: 10.3791/59403
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

מטרת כתב היד והפרוטוקול היא להסביר ולהדגים בפרוטרוט את ההליך הכירורגי של השתלת כליות אורתוגרפית בחולדות. שיטה זו היא פשוטה כדי להשיג את הפרזיה הנכונה של כליה התורם ולקצר את הזמן הreperfusion באמצעות שימוש בטכניקת ורידי השרוול וההשקה.

Abstract

השתלת כליות מציעה שיעורי הישרדות מוגברת ואיכות חיים משופרת עבור חולים עם מחלת כליות בשלב הסופי, לעומת כל סוג של טיפול החלפת כליות. במהלך העשורים האחרונים, מודל השתלת כליות חולדה שימש לחקר התופעות האימונולוגיים של דחייה וסובלנות. מודל זה הפך להיות כלי הכרחי כדי לבדוק תרופות אימונומודולטוריים החדש משטרי לפני ההליך עם מחקרים יקרים בעלי חיים מראש גדול פרה.

פרוטוקול זה מספק סקירה מפורטת של כיצד לבצע באופן אמין השתלת כליה אורתוגרפית בחולדות. פרוטוקול זה כולל שלושה צעדים מיוחדים המגבירים את ההסתברות להצלחה: הפרזיה של כליה התורם על ידי שטיפה דרך וריד השער ושימוש במערכת חפתים כדי להפעיל את ורידים הכליות והשופכה, ובכך להקטין קר וחמים פעמים של איסכמיה באמצעות טכניקה זו, השגנו שיעורי הישרדות מעבר ל 6 חודשים עם קריאטינין סרום רגיל בבעלי חיים עם השתלת כליה תחבירית או סובלנית. בהתאם למטרה של המחקר, מודל זה יכול להיות שונה על ידי טיפול טרום או פוסט השתלת ללמוד את אקוטי, כרונית, הסלולר, או נוגדנים בתיווך דחייה. זהו מודל בעלי חיים, אמין וחסכוני לחקר היבטים שונים של השתלת כליה.

Introduction

מבחינה היסטורית, המחקרים הראשונים של דחיית ההשתלה בוצעו על ידי ברנט ו Medawar באמצעות השתלות עור במכרסמים1. במהרה התברר כי העור יש תכונות אימונולוגיים ברורים, מה שהופך אותו לאיבר חיסוני מאוד כי הוא שונה בדחייה של איברים אחרים מוצק vascularized2. לימודי חולדה של דחייה השתלת איברים מוצק מוגבלים לטיפול ללב, לכבד, ולהשתלת כליה. למרות שכל אחד מאברים אלה מתאים ללימוד דחייה, יש יתרונות וחסרונות לכל אחד מהם. השתלות לב מושתלים לעתים קרובות לתוך הבטן ומנומת אל העורקים והבנה קאווה, עם הלב הטבעי של המטופל במקום3. זה אינו משחזר את התנאים הקליניים, האנטומיים האנושיים והפיזיולוגיים. בנוסף, לבבות רגישים מאוד איסכמיה קר צריך להיות מוכן מחדש בתוך 1 h כדי להיות מסוגל לשחזר את תפקידם4. השתלות כבד נחשבות בדרך כלל להיות בניתוח מאתגר יותר זמן רגיש לבצע. לאחר הסרת הכבד הטבעי, יש להשתיל את כבד התורם ולהתחמש בתוך 30 דקות משום שהנמענים אינם יכולים להימשך זמן רב יותר ללא הכבד הפועל5. עורק הכבד, וריד השער, ובמיוחד השחזור צינור המרה דורש כישורי ניתוח מעודן. מלבד האתגרים כירורגי, הכבד ידוע בעלי מאפיינים tolerogenic ומכרסמים ובני אדם יכולים להיות עמידים מבחינה מבצעית6,7,8. הכליה, בניגוד האיברים הנ ל, יכול להיות מושתלים בצורה אורתודפית, ידוע להיות איבר חיסוני עם עקביות, הדחייה פרקים מנוגדות (אם לא החיסונית), ומאפשר תקופות של איסכמיה קר ממושכת של מספר שעות. זה הופך את כליה העכברוש להשתלות מודל אידיאלי ללמוד דחייה אלושתל וסובלנות.

השתלת כליה (KT) היא הבחירה המועדפת של טיפול בחולים עם מחלת כליות בשלב הסופי. במהלך העשורים האחרונים, תוצאות ההישרדות לטווח קצר לאחר KT השתפרו באופן דרמטי, אבל התוצאות לטווח ארוך הישרדות הם הקפואה9. המדכא הקונבנציונלי משטרי להישאר טיפול סטנדרטי נגד דחייה. עם זאת, השימוש הכרוני בטיפולים אימונומדכאים גורם לתחלואה ותמותה משמעותיים, כגון נפרורעילות, סוכרת, ממאירות משנית10,11,12. ב-לטווח ארוך, נוגדן כרונית, מתווך הסלולר דחייה מאיימים הישרדות השתל, עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות זמין.

מטרה עיקרית בהשתלה היא אינדוקציה של סובלנות השתלה כדי לסדר את הצורך בדיכוי חיסוני כרונית. מודל KT החולדה הוא כלי חזק כדי לחקור את תהליך הדחייה החיסונית ולהעריך גישות חדשות החיסונית וסובלנות השתלה. עכברוש משמש גם מודל מתאים כדי ללמוד מתווכת תא ונוגדן בתיווך כרונית,13,14,15,16,17. מודל זה כירורגי הוכיחה להיות אמין, הניתנים לשימוש, וחסכוני בכלי כדי ללמוד היבטים שונים של דחייה השתלת וסובלנות. הוא משמש לעתים קרובות כדי לבדוק את הפרוטוקולים הרומן לגרימת סובלנות לפני התחייבות יקר ומסורבל בעלי חיים גדולים מחקרים. ביצוע KT ב חולדות דורש הכשרה כירורגית נרחבת מומחיות כדי להגיע לשיעורי הישרדות של > 90%. בכתב יד זה ובסרטון ההדרכה הנלווה, אנו מספקים מיתאר צעד-אחר-צעד לנושא אורתוקט KT בחולדה, כפי שבוצעה בהצלחה במשך שנים רבות במוסד שלנו.

לפני הפעלת כל הליך, בחירת התורם והנמען היא קריטית ותלויה באופי הניסוי. באופן אידיאלי, תורמים ומטופלים צריכים לשקול בין 220 ל-260 גר' ולהיות בין הגילאים 8 עד 12 שבועות. בעלי חיים מתחת 220 g כוללים עורקים בקוטר קטן, ורידים וורידים, העושים את ההשקה בתוך המטופל באופן מאתגר במיוחד. איבוד דם קטן יכול לגרום להיפובולמיה. ולגרום למוות בחיות קטנות יותר בעלי חיים כבדים יותר 260 g להציג שומן יותר סביב הכלים שלהם, ואת בידוד כלי ידרוש יותר זמן פעיל ולהגדיל את הזמן הקר איסכמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

לואיס (RT11) והעכברושים הכהים (RT1Aa) נרכשו מיצרנים מסחריים (ראו את שולחן החומרים). אלה מלאה MHC הזנים לא תואמים משמשים לעתים קרובות כדי ללמוד דחייה הכליות הכליה חריפה. כל החיות היו שוכנו ומתוחזקים על פי הנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH) במתקן מסוים האנטי-פתוגן באוניברסיטת ג'ונס הופקינס. כל ההליכים אושרו על ידי הטיפול המוסדי בעלי חיים והוועדה השתמש.

1. הליך תורם

  1. להכין ו האוטוקלב כל המכשירים כירורגי לשמש בהליך זה כאמצעי עיקור ולהשתמש כפפות סטרילי חד פעמי כדי למנוע סיבוכים זיהומיות.
  2. השאיפה את החולדה התורמת על ידי אינהלציה של השאיפה (אינדוקציה ב -3% – 4% ואחזקה ב-1% – 2%) לשאר ההליכים תן את כל חיות התורמים והנמען בעלי חיים מונעת בופרנורפין תת-עורי ב 0.1 מ"ג/ק"ג משקל הגוף עבור כאבים.
  3. ומשתק את הגפיים. בקלטת מיסוך סטרילית
  4. השתמש בקוצץ מכני כדי להסיר שיער מאזור הבטן.
    1. להחיל סיכה העין ולהשתמש גזה סטרילית ספוגה povidone-יוד, ואחריו גזה ספוגה באלכוהול איזופרופיל, כדי לחטא את השדה כירורגי.
    2. לפני החתך הראשון, לוודא את העכברוש מורדם כראוי על ידי בדיקת העדר של הבוהן צביטה לסגת רפלקס.
  5. באמצעות מספריים, להתחיל על ידי ביצוע גדול האורך באמצע העור וחתך שרירים מתוך העצם הפופיזיס של xiphoid, ולהיכנס חלל הצפק.
  6. הכנס שני טרקטורים משני צדי דופן הבטן כדי לחשוף את חלל פנים-הבטן.
  7. לכסות את המעי עם גזה סטרילי לח ולהעביר אותו לצד הצדדי הימני של הבטן, חשיפת העורקים, הבנה קאווה, וכליה שמאל. החל 1 מ ל של מלח מחומם מראש עם מזרק 1 cc כדי לשמור על המעיים ואת אברי הבטן לחות ובטמפרטורה נורמלית.
    1. להחיל גזה לחות שנייה כדי לכסות ולהניע את הקיבה ואת הגולגולת הטחול לכליה ו גזה לח קטן כדי לכסות את הכליה החשופה (איור 1א).
  8. השתמש מלקחיים מנתחים כירורגית כדי לבודד ולהניע את עורק הכליה השמאלי ואת הווריד מרקמת החיבור אחד את השני. לבודד את הווריד הכליה השמאלית על ידי הוספת וריד הווריד השמאלי ולבודד את עורק הכליה השמאלית על ידי שצרוב את עורק יותרת הכליה. לאחר מכן, להניע את אב העורקים ואת שבנה קאבה מעולה ונחותים של כליות שמאל על ידי מבתר את רקמת החיבור עם מלקחיים מריעון (איור 1B).
  9. לחלק ולגייס את השופכה מרקמת החיבור באמצעות מלקחיים מבתר, ולעשות חתך אלכסוני באורך של 2 ס"מ נמדד מאגן הכליה, באמצעות מיקרו מספריים. הכנס חפתים פוליאמיד (ראה טבלת חומרים) בחצי הדרך לתוך השופכה ולאבטח את השרוול על ידי הצבת קשר עם 8-0 תפר משי (איור 1ג).
    הערה: חשוב לא להסיר את כל רקמת השומן והחיבור מן ureter, כפי שהם מספקים הגנה מפני חסימה הנגרמת על ידי הדלקת, וההסרה שלהם עלול לגרום נמק השופכה. שים לב יותר כדי לשמר את כלי הקיבול אספקת חמצן לתוך השופכה.
  10. להניע את הכליה השמאלית על ידי הפרדת השומן מהנקבים בעזרת מלקחיים או מיקרומספריים. השאירו את כמוסת האדיפוז של הכליה המצורפת והשתמשו באתר לטיפול בכליה.
    1. . לחשוף את האובורד הנחות
  11. לנהל 200 יחידות של הפארין בעזרת מזרק עם מחט של 27 גר' דרך הווריד של הפין. לחץ על האתר של הזרקה עם משטח כותנה לפחות 1 דקות כדי למנוע דימום.
  12. זיהוי וריד השער (pv) והוריד הורד הנחות (איור 1ד). ריקון הכליה על ידי הזרקת 50 mL של מלוחים קרים מעורבב עם 500 יחידות של הפארין לתוך וריד הפורטל באמצעות מחט G 16 (איור 1E). לפני השטיפה, לחתוך את הווריד הנחות ברמה ברמת הכבד ואת וריד הפורטל caudal באתר הכנסת המחט כדי לאפשר לדם לצאת מהמחזור. התחל לרוקן את הכליה בהדרגה. באמצעות החדרת התמיסה לתמיסת מלח שים לב לשינוי הצבע של הכליה מאדום כהה לצבע אפור אחיד ובהיר (איור 1F).
  13. לאחר השטיפה, להציב את עורק הכליה ואת הווריד האבובית לעורק העורקים ולבנה קאווה ולהניח את הכליה הסמוק בצלחת פטרי בתמיסת מלח קר על הקרח. איור 2 A מייצגת את הסקירה הסכימטית של הליך התורם.
  14. לאחר הכליה היא בתמיסת מלח קר, לתקן ולשתק את ידית השרוול של הווריד (לראות את שולחן החומרים) ולמשוך בעדינות את וריד הכליה דרך השרוול. ואז, לתקן את הווריד הכליות על השרוול על ידי הצבת שלושה קשרים באמצעות שמונה אפס התפר משי (איור 2B).
    הערה: יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לכיוון הווריד תוך כדי הידוק הנעילה במקומה. ורידים מסובבים גורמים לחסימה של זרימת הדם ולהוביל לפקקת.

2. הליך הנמען

  1. חזור על שלבים 1.1 – 1.11 מהליך התורם.
  2. מניחים שני מלחציים מיקרו-כלי המגמטיים על עורק הכליה השמאלי והווריד הראשי של אב העורקים והבנה קאווה (איור 3א).
  3. לישער את וריד כליות המטופל האבויה של הכליה. לשטוף את וריד הכליות עם המלח heparinized כדי להסיר את כל הדם שנותר מתוך כלי.
  4. החלק את הווריד כליות ליגולי על הווריד כליות אזוקות בעבר ממוקם בכליה התורם ולאבטח אותו עם 8-0 תפר משי (איור 3ב'). לשמור על כיוון זהה כאשר לאבטח את הווריד הכליות על השרוול.
  5. הורד את השופכה במפלס הקוטב התחתון של הכליה השמאלית. להניע את הכליה. משומן הנקבים
  6. לישער את עורק הכליה האבובי אל הכניסה של כליה הנמען. . כדי להסיר דם עודף בכלי בצע השקה מקצה לקצה של עורק הכליה עם 8 עד 10 תפרים מקוטע באמצעות תפר 10-0 ניילון (איור 3ג). תמרון העורק באמצעות השכבה האדואדאני.
  7. מסירים את התפסים כדי להפעיל מחדש את הreperfusion של הכליה. התחל על ידי הסרת התפס על הווריד ואחריו את המלחציים על העורק (איור 3ד). השתמש בספוגית כותנה סטרילית כדי ללחוץ בקלות על כל האזורים הנזילה סביב אזור ההשקה. כמה דקות צריך להספיק כדי להשיג השקה פטנט.
  8. צפו בקצרה בכליה כדי להעריך את הפרזיה הנאותה. מיד לאחר reperfusion, הכליה צריך לשנות את הצבע ובהדרגה להחזיר את הצבע הטבעי כהה שלה אדום לאחר כמה דקות (איור 3E). הפריסטלזיס הגלויות של השופכה וייצור השתן באתר נצפו לעיתים.
  9. סיום על-ידי הוספת הקצה החשוף של השרוול ureteral לתוך המטופל שופכן ולאבטח את שופכן הנמען עם 8-0 תפר משי (איור 2C ואיור 3F).
  10. על מנת להשאיר את התורמים והמקבל בעמדה, לקשור את קצות כל אחד מהצדדים.
  11. באופן אופציונלי, הכליה הנכונה יכולה להיות לנפרוזציה על ידי קשירת עורק הכליה הימני והווריד עם תפר משי 4-0 והסרת הכליה.
  12. להסיר את כל הגוזים מן חלל הבטן, להחזיר את כל האיברים למצב הטבעי שלהם, להתיז 1 מ ל של מלוחים על המעיים כדי לשמור אותם לח, ולסגור את הבטן באמצעות תפר הנספג 4-0 על השריר rectus ותפר משי 4-0 לסגור את העור לשכב . בצורה מופרעת

3. טיפול פוסט-פעיל

  1. מניחים את החיה בכלוב נקי עם גישה למים libitum ומזון ולאפשר שחזור על משטח חימום 37 ° c.
  2. הכנס 0.1 מ"ג/ק"ג בופרינורטין תת-עורי לחוסר כאבים ונטר את בעל החיים להתאוששות. ייתכן שיהיה צורך בניהול משככי כאבים נוספים בימים הקרובים, בהתאם לסימנים של אי נוחות או כאב. אנטיביוטיקה לא מנוהלים באופן שגרתי, כמו סיבוכים זיהומיות הם נדירים.
  3. שימו לב להתאוששות של 1 – 2 לפני שתחזיר את החיה למתקן החי. בדוק את בעל החיים 2x – 3x ביום עבור 24 h הראשון, ואחריו בדיקה יומית. שים לב סימנים של כאב ומצוקה, צריכת אוראלי, ופלט השתן.
  4. הסר את התפרים 7 – 10 ימים לאחר הפעולה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ביצעת סינגנמית (n = 5) והשתלות כליות אלוגנאית (n = 5). בעלי חיים עם השתלת סינגנאית השיגו הישרדות ארוכת טווח ללא כל טיפול חיסוני מדכא. בעלי חיים שקיבלו השתלת אלוגנמית ללא דיכוי חיסוני דחו את ההשתלה שלהם ונכנעו לכישלון כליות עם הישרדות חציון של 8 ימים (איור 4א). מרושע קריאטינין סרום גדל צנוע בקבוצה syngeneic בעוד הוא גדל על ידי מקפלים 14 בקבוצה allogeneic (0.5 mg/dL לעומת 7.0 mg/dL, p < 0.01) (איור 4ב). עם ההסבר, ההשקפה המאקרוסקופית של השתלת הכליות הסינגנאית לא הראה חריגות כלשהן. צבע הכליות והמבנים הפנימיים נותרו ללא פגע. לעומת זאת, שתלי כליות של בעלי חיים שנדחו הציגו תיקוני מדמם אדומים בהשמדת המבנים הפנימיים (איור 4ג). המטאוקסילין והכתמים האאוזין של שתלי הסינגנאריים הראו לולאות קפיאליות דקות עם מספר רגיל של תאים אנדותל וmesangial. אלושתלים נדחים הציג הרסו מבנים פקריפיות עם סימנים של דלקת ומתקני טובולטיס (איור 4ד). כדי לאשר את הדחייה T-cell בתיווך, ביצעת CD8 + כתמים. בעוד אלושתלי הסינגנאית הראו מעט מאוד חיובי CD8 + T תאים, האלושתלים שנדחו הראו מספר גבוה יותר באופן משמעותי של CD8 + תאים בתוך ומסביב הפקאולי ו tubuli (איור 4E), מאשרת T-cell בתיווך דחייה.

Figure 1
איור 1 : כריתת התורם לנפרוטומיה. (א) בעת פתיחת הבטן, הכליה השמאלית מבודדת בגוזים לחים. (ב) עורק הכליה השמאלי והווריד מבודדים ומתגייסות מן השומן שמסביב. (ג) השופכה מגורמת, אזוקות ומאובטחת בתפר משי אחד. (ד) וריד השער (pv) והווריד הוריד הנחות (ivc) מזוהים והכליה מזוהה דרך וריד השער. (ה) perfusion מבוצע בהצלחה כמו הכליה הימנית והכבד הם הופכים להיות חיוורים על ידי שטיפה של החיה וריד הפורטל. (ו) זלוף מוצלחת מדגים כליה בהיר כלי מוכן להשתלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : סקירה סכימטית של הליך השתלת כליה. (א) תרשים סכימטי של הליך התורמים. (ב) תרשים סכימטי של וריד התורם האזוק. (ג) תרשים סכימטי של ההשקה של המטופל ושל הווריד התורם האזוק והחיבור של השופכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3 : השתלת כליה במטופל. (א) העורק והווריד של המטופל מתגייסות מן השומן המקיף ומהודק לאחר ההפרדה. (ב) כלייה של התורם מוצגת, והורידים מחוברים באמצעות טכניקת השרוול ומאובטחים ב8-0 תפר. (ג) העורקים מסושמים בצורה מקצה לקצה. (ד) התפסים מוסרים. (ה) הכליה מחדש ומשחזרת את צבעו הטבעי ללא כל דימום. (ו) בסופו של דבר, הureters הם באמצעות השרוול הניח בעבר מאובטח עם 8-0 תפר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4 : הישרדות השתלת כליה. (א) הדמות של קפלן-מאייר ממחישה את ההישרדות של חולדות עם השתלת כליה syngeneic או אלוגנמית לאורך זמן. (ב) מדידה והשוואה של קריאטינין סרום בחולדות עם השתלות כליה syngeneic או אלוגנאית לעומת חיות לא מושתלים. (ג) מקרוסקופי סקירה של כליות הסבר של השתלת סינגנמית (למעלה) ואלוגנמית (למטה) ביום 8. בעלי חיים היו מלוחים עם תמיסת מלח לפני ההסבר. שני הפאנלים האחרונים מראים סקירה מיקרוסקופית של (ד) המטאוקסילין ואאוזין ביים ו-(E) CD8 + של מתקני syngeneic (למעלה) ואלוגנמית (למטה). התמונות נלקחים תחת הגדלה 200x. * תוצאות נחשבו משמעותיים סטטיסטית אם p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5 : כלי ניתוח דרושים . (1) מספריים ישרים. (2) מספריים בסדר. (3) מספריים מיקרו-אביבי 1 (הארכה). (4) מספריים מיקרו-קפיץ 2. (5) מספריים מיקרו-קפיץ 3. (6) מרקטרקטורים כירורגיים בעלי חיים קטנים. (7) מלקחיים. (8) מיקרומלקחיים, ישר, חלק. (9) לבתר מלקחיים, מעוקל. (10) בעל מחט מיקרו. (11) מחזיק מחט. (12) 8-0 תפר ממשי קלוע ללא מחט. (13) 4-0 תפר משי. (14) מלחציים מיקרו-כלי (זוג אחד). (15) הקשחת מהדק כלי מיקרו. (16) מהדק טיפ דק. (17) הפארין. (18) מהדק כלי (גודל בינוני). (19) מהדק כלי (גדול). (20) מטליות כותנה סטריליים. (21) 10-0 מיקרו תפר עם מחט. (22) גזה סטרילית. (23) הפרניזד מזרק מלוחים לניקוי. (24) 60 cc מזרק עם מחט. (25) 10 cc מזרק. (26) 1 cc מזרק. (27) 25 גרם 5/8 מחטים בגודל אינץ '. (28) מחטים של 19 גר'. (29) קוצץ. (30) מערכת הקבאטרי דו-קוטבית. (31) קלטת. (32) צלחת פטרי עם 0.9% תמיסת מלח רגילה. (33) 60 cc מזרק עם 50 cc heparinized עבור perfusion. (34) 10 סמ ק עם מזרק 5 cc heparinized מלוחים. (35) שופטר. (36) וריד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בכתב יד זה, אנו מתארים את השיטה כירורגית עבור מט KT בחולדות בפירוט, כולל את כל הציוד הדרוש כדי לבצע את ההליך הזה (איור 5). ב 1965, פישר ולי פרסמה את הדו ח הראשון על KT בחולדות, אשר הפך לתחילתו של שדה חקירה מרגש18. מאז, שינויים רבים הוכנסו כדי לשפר את השגות של המודל הזה. הוא שימש כמודל חיה יעיל לחקר איסכמיה-reperfusion פציעה השתלת כליות דחייה וסובלנות, תודות לזמינות של זנים מסוג מדומה ומלא התאמה עם שילובים חלקיים ומלאים של MHC אי-התאמה19. מודל KT החולדה יכול לשמש כלי כדי לבדוק השערות לפני הרחבת חקירות לחזירים מודלים הפרימטים האנושית של KT. אפשרויות לחקר דחייה השתלת כליה או סובלנות מכרסמים מוגבלים. המודל להשתלת כליה בעכברים הוא מאוד מאתגר מאוד ודורש תקופת הכשרה ארוכה כדי להשיג שיעורי הישרדות של > 80%20. מגבלה נוספת של מודל העכבר היא הקבלה הספונטנית הכליות להשתלה ללא צורך בדיכוי חיסוני ב 30% מהנמענים. עם זאת, השתלות איברים אחרים בעכברים, כגון העור והלב, נדחים בתוך 10 ימים, מציע כי דחיית האלושתלים בכליות באופן מלא MHC לא תואם עכברים הוא חלש ולא מייצג את המצב הקליני21. עם זאת, אם האתגר הטכני יכול להיות להתגבר, מודלים עכברים עדיפים עבור מחקרים מנגנון דחייה השתלת בגלל הזמינות של שונה מבחינה גנטית לנקוש או לנקוש עכברים.

KT בחולדות ניתן לבצע במספר דרכים. נדון בכמה יתרונות וחסרונות של השיטות השונות הללו. ללא קשר לטכניקה המועדפת, זה תמיד קריטי כדי להפחית את זמן האיסכמיה חם כדי למנוע פציעה בלתי הפיכה לשתל ולנמען.

כליה נגד שמאל
אנטומית הבטן של חולדות דומה מאוד לזה של בני אדם. הכליה השמאלית ממוקם מעולה לעומת הכליה הימנית בגלל המיקום האנטומי של הכבד. אחד היתרונות בשימוש בכליה השמאלית הוא אורך כלי הדם. בדרך כלל, עורק הכליה השמאלי והווריד הם פי שניים אורך כלי הכליה הימני. הדבר מועיל במיוחד כשאתה מבצע השקה כאשר אורך הכלים אינו גורם מגביל. עם זאת, הדיווחים קיימים של שליפת כליה ימנית צדדית והשתלת22,23. הגישות באמצעות שתי הכליות להשתלה גם תוארו24.

שטיפה כליה של תורם דרך וריד השער
אחד השלבים העיקריים של הליך זה הוא perfusion כליה התורם. Perfusion הוא הכרחי כדי להסיר את כל הדם התורם מן הכלים כליה ולצנן את האיבר למטה להתדרדרות ביולוגית איטית. ישנן שיטות שונות המתוארות לשם הבעת הכליה. יש לנו ניסויים עם שטיפה את הכליה בדרכים שונות ולהסיק כי שטיפה את הכליה דרך וריד הפורטל מציע יתרונות ובעקביות מוביל להשלים את שילוב של כליה וכלי הכלים. הגישות הקונבנציונליות המתוארות בספרות כרוכות בריקון כלייה של התורמים לאחר לליגפת עורק הכליה והווריד או נסיגה דרך העורקים הראשי24,25,26,27 , 28. גישות אלה עלולות להוביל לפגיעה אנדותל והכליות כליות בגלל הגדלת לחצים מקומיים או לפרזיה לא מלאה בשל לחץ הפרפיוז נמוך29,30.

על ידי שטיפה הכליה דרך הווריד הפורטל, הלחץ מנוהל על ידי הלב. במהלך זלוף, הלב הוא עדיין פעיל ומשאבות את הנוזל זלוף בצורה נורמלית העורקים והכליה עם זרימת פועמת, מניעת נזק נימים ופקולי בגלל זרימת הלחץ הטיה. כאשר השתלת כליות בגוש או באמצעות הכליה הימנית עבור השתלת, שיטה זו מתאימה להשיג זלוף אחיד לקצור את שתי הכליות באותו זמן.

השקה בעורק ובורידים
אחד השלבים הקריטיים ביותר במודל ה-KT חולדה מבצע השקה מיקרוכלי אמין באופן חסכוני בזמן. עורק הכליה של התורם יכול להיות מאוכך לעורק הכליה של המטופל או לבעל העורקים. אנסטומסינג כלי התורם לעורקים ולאובקאווה הנחותים גורמת לפגיעה באיברי המטופל. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את החיבור מקצה לקצה של עורקי הכליות, כאשר היא נמנעת מפגיעה באיברים אחרים. במהלך החיבור העורקי, חשוב לא לפגוע במשטח האנדותל של הלוומן בעת טיפול בכלי. כדי לצמצם את הזמן החמים. ולקצר את ההליך המבצעי זה הוכח להיות שיטה אמינה מאוד עמיד כדי להבטיח זרימת ורידים נאותה. כדי להבטיח זרימת ורידים נאותה, זה הכרחי לוורידים לא להיות מקוטע או מעוות כאשר אלה מאובטחים יחד. לחילופין, ניתן לחיבור מקצה לקצה או לחיבור מהסוף לקצה, בהתאם להעדפה של המנתח. באופן אידיאלי, החיבור של כלי העורקים והורידים אמור להימשך בין 20 ל -30 דקות.

מלבד השיטה המבוססת על הקרנת ספרות31. אחד הסיבוכים העיקריים שעלולים להתרחש לאחר החיבור כל כלי מיקרו כירורגי הוא פקקת. הארכה ושטיפה נאותה של כלי המקבל להפחית באופן משמעותי את היווצרות פקקת, וזה בהחלט לא סיבוך שנצפה לעתים קרובות. סיבוכים אחרים הם דליפה או קרע של ההשקה אחרי reperfusion. זה קשור לטכניקה מיקרוכירורגית מספקת או טיפול מספיק של כלי הדם.

השקה שופקל
השופכה צריך להיות מטופל בזהירות רבה, במיוחד בזמן הבידוד של השופכה בתורם. פגיעה במבנים periureteric יכול לגרום איסכמיה שמובילה הקפדנות וחסימה ו, בתרחיש הגרוע ביותר, מקרה של נמק. הספרות מדווחת על שיטות שונות לחיבור השופכה. קצה לקצה, בסיוע השרוול קצה לקצה, תיקון שלפוחית השתן, ואת החדרת שלפוחית השתן הם הנפוצים ביותר19,32,33. במחקרים קודמים, השתמשנו השרוול עם קצוות אלכסוניים על שני הקצוות כדי להקל על הכניסה לתוך השופכה בשני הקצוות. לא התבוננו בדליפת שתן או בתצורות של קריש דם. עם זאת, סיבוכים לטווח ארוך (> 30 ימים) של טכניקה זו כוללים הידרנרופזיס ולעתים כנפוליאזיס, אשר ניתן להסביר על ידי היווצרות שלקצ'ור, נקע, או חסימה של השרוול בשל אבני ureteral. ממצא זה מתאים לדיווחים אחרים ולממצאים שלנו בביצוע ההשקה עם השרוול. סיבוכים ureteral מבחינים לעתים קרובות משככי אופן משמעותי לאחר פגיעה משמעותית בכליה, הם בלתי ניתנים להצלה, ודורשים את בעל החיים להיות מורדמים.

טיפול שלאחר הניתוח והישרדות
טיפול postאופרטיבית של בעלי חיים מושתלים דורש ניהול כאב הולם תצפיות מפורטות של הפעילות הכללית של בעלי חיים, תצפיות משקל, וייצור שתן. סיבוכים נפוצים לאחר הניתוח כוללים דימום מתוך החיבור העורקי או הורידים, דליפת שתן, חסימה ureteral, או פונקציית השתל מתעכב בגלל הזמן איסכמיה ממושכת. בעלי חיים עם סיבוכים אלה להראות פעילות צנועה ובדרך כלל להישאר בתנוחה השכפופות ללא פלט השתן ואת צריכת המזון. באופן כללי, זה נוח לנהל עד 1 – 5 מ ל של מלוחים לבעלי חיים משככי שיתוף כדי להאיץ את ההחלמה שלהם ולמנוע התייבשות. בעלי חיים שאינם מקבלים דיכוי חיסוני יכולים לשרוד בין 7 ל -10 ימים, דבר המאפשר לחלון תרפויטי מספיק לבחון תרופות מספר או שיטות אחרות. אם בעלי חיים הם חיסוני מספקת (1.0 mg/ק"ג/day FK506 תת-עורי) או סובלנית, הם יכולים להיות מנוטרים לטווח ארוך 6 חודשים כפי שדווח בעבר13. המודל להשתלת כליה החולדה איפשר את ההגדרה של מנגנוני הסובלנות הנגרמת באמצעות גישה ייחודית של הגיוס תאי גזע לפני המאשרת תופעה זו בעלי חיים גדולים34. עכברוש KT סיפק מידע חיוני לחוקרים במשך עשורים, וזה ימשיך לעשות זאת בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו ממומנת על ידי מתנה נדיבה מאחוזת בומבק.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buprenorphine HCL Reckitt Benckiser Healthcare UK NDC12496-0757-5
Dissecting forceps, curved Zhenbang, China 11cm Flat handle 
Heparin sodium injection USP Sagent Pharmaceuticals  NDC25021-400-10
Micro-forceps, straight, smooth Jingzhong, China WA3010
Micro needle holder Jingzhong, China WA2010
Micro vessel clamps Jingzhong, China WA40120
Micro spring sciccor 1 ROBOZ RS-5620
Micro spring sciccor 2 F.S.T. 91501-09
Micro spring sciccor 3 Zhenbang, China 8.5cm Vannas,curved
Prograf (Tacrolimus/FK506) Astellas
Rats Charles River & Taconic Biosciences  LEW/Crl & DA-M 
Shaver Wahl 79600-2101
Suture 4-0 Ethicon J304H
Suture, 4-0  Ethicon 683G
Suture, 10-0  Ethicon 2820G
Syringes & Needles BD
Thread, 8-0 Ashaway 75290
Ureteral cuff Microlumen 160-1 Polymide Tubing, Diameter 0.41 mm 
Venous cuff Intramedic BD 7441 PE-200 Non-radiopaque polyethylene tubing ID: 1.4 mm, OD: 1.9 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Billingham, R. E., Brent, L., Medawar, P. B. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature. 172 (4379), 603-606 (1953).
  2. Murray, J. E. Organ transplantation (skin, kidney, heart) and the plastic surgeon. Plastic and Reconstructive Surgery. 47 (5), 425-431 (1971).
  3. Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (6), e238 (2007).
  4. Ruzza, A., et al. Heterotopic heart transplantation in rats: improved anesthetic and surgical technique. Transplant Proceedings. 42 (9), 3828-3832 (2010).
  5. Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. Journal of Visualized Experiments. (65), e4143 (2012).
  6. Lang, K. S., et al. Immunoprivileged status of the liver is controlled by Toll-like receptor 3 signaling. Journal of Clinical Investigation. 116 (9), 2456-2463 (2006).
  7. Sun, Z., et al. Recruitment of host progenitor cells in rat liver transplants. Hepatology. 49 (2), 587-597 (2009).
  8. Orlando, G., Soker, S., Wood, K. Operational tolerance after liver transplantation. Journal of Hepatolgy. 50 (6), 1247-1257 (2009).
  9. Lodhi, S. A., Lamb, K. E., Meier-Kriesche, H. U. Solid organ allograft survival improvement in the United States: the long-term does not mirror the dramatic short-term success. American Journal of Transplantation. 11 (6), 1226-1235 (2011).
  10. Engels, E. A., et al. Spectrum of cancer risk among US solid organ transplant recipients. Journal of the American Medical Association. 306 (17), 1891-1901 (2011).
  11. Kasiske, B. L., Snyder, J. J., Gilbertson, D., Matas, A. J. Diabetes mellitus after kidney transplantation in the United States. American Journal of Transplantation. 3 (2), 178-185 (2003).
  12. de Mattos, A. M., Olyaei, A. J., Bennett, W. M. Nephrotoxicity of immunosuppressive drugs: long-term consequences and challenges for the future. American Journal of Kidney Diseases. 35 (2), 333-346 (2000).
  13. Hu, X., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell-Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: A Study in Rats. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2055-2065 (2016).
  14. Shrestha, B., Haylor, J. Experimental rat models of chronic allograft nephropathy: a review. International Journal of Nephrology and Renovascular Disease. 7, 315-322 (2014).
  15. Fu, Y., et al. Successful transplantation of kidney allografts in sensitized rats after syngeneic hematopoietic stem cell transplantation and fludarabine. American Journal of Transplantation. 14 (10), 2375-2383 (2014).
  16. Grau, V., et al. Immune Complex-Type Deposits in the Fischer-344 to Lewis Rat Model of Renal Transplantation and a Subset of Human Transplant Glomerulopathy. Transplantation. 100 (5), 1004-1014 (2016).
  17. Vogelbacher, R., et al. Bortezomib and sirolimus inhibit the chronic active antibody-mediated rejection in experimental renal transplantation in the rat. Nephrology Dialysis Transplantation. 25 (11), 3764-3773 (2010).
  18. Fisher, B., Lee, S. Microvascular surgical techniques in research, with special reference to renal transplantation in the rat. Surgery. 58 (5), 904-914 (1965).
  19. Mahabir, R. N., Guttmann, R. D., Lindquist, R. R. Renal transplantation in the inbred rat. X. A model of "weak histoincompatibility" by major locus matching. Transplantation. 8 (4), 369-378 (1969).
  20. Wang, J. J., Hockenheimer, S., Bickerstaff, A. A., Hadley, G. A. Murine renal transplantation procedure. Journal of Visualized Experiments. (29), e1150 (2009).
  21. Bickerstaff, A. A., Wang, J. J., Pelletier, R. P., Orosz, C. G. Murine renal allografts: spontaneous acceptance is associated with regulated T cell-mediated immunity. Journal of Immunology. 167 (9), 4821-4827 (2001).
  22. Silber, S. J., Crudop, J. Kidney transplantation in inbred rats. American Journal of Surgery. 125 (5), 551-553 (1973).
  23. D'Silva, M., et al. Rat kidney transplantation update with special reference to vesical calculi. Microsurgery. 11 (2), 169-176 (1990).
  24. Yin, M., Booster, M. H., Bogaard, A. E. J. M., Kootstra, G. A simple technique to harvest two kidneys from one donor rat for transplantation. Lab Animal. 28 (4), 387-390 (1994).
  25. Lopez-Neblina, F., Toledo-Pereyra, L. H., Suzuki, S. Ultrarapid orthotopic technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 15 (4), 274-278 (1994).
  26. Blom, D., Orloff, M. S. A more versatile and reliable method for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 18 (4), 267-269 (1998).
  27. Engelbrecht, G., Kahn, D., Duminy, F., Hickman, R. New rapid technique for renal transplantation in the rat. Microsurgery. 13 (6), 340-344 (1992).
  28. Kline, R., Churchill, M., Churchill, P., Bidani, A., Schwartz, M. High osmolality-low pH flush solutions improve renal transplant function in rats. Urology Research. 19 (2), 81-86 (1991).
  29. Fray, J. C. Mechanism by which renin secretion from perfused rat kidneys is stimulated by isoprenaline and inhibited by high perfusion pressure. The Journal of Physiology. 308, 1-13 (1980).
  30. Fry, D. L. Acute vascular endothelial changes associated with increased blood velocity gradients. Circulation Research. 22 (2), 165-197 (1968).
  31. Pahlavan, P. S., Smallegange, C., Adams, M. A., Schumacher, M. Kidney transplantation procedures in rats: assessments, complications, and management. Microsurgery. 26 (5), 404-411 (2006).
  32. Savas, C. P., et al. Renal transplantation in the rat--a new simple, non-suture technique. Urology Research. 13 (2), 91-93 (1985).
  33. Fabre, J., Lim, S. H., Morris, P. J. Renal transplantation in the rat: details of a technique. The Austalian and New Zealand Journal of Surgery. 41 (1), 69-75 (1971).
  34. Cameron, A. M., et al. Chimeric Allografts Induced by Short-Term Treatment With Stem Cell Mobilizing Agents Result in Long-Term Kidney Transplant Survival Without Immunosuppression: II, Study in Miniature Swine. American Journal of Transplantation. 16 (7), 2066-2076 (2016).

Tags

רפואה סוגיה 147 כליה השתלת אורתודפית חולדה הישרדות דחייה סובלנות
אורתובנושא חולדה השתלת כליה: מגישת רומן וכירורגית פשוטה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmadi, A. R., Qi, L., Iwasaki, K.,… More

Ahmadi, A. R., Qi, L., Iwasaki, K., Wang, W., Wesson, R. N., Cameron, A. M., Sun, Z. Orthotopic Rat Kidney Transplantation: A Novel and Simplified Surgical Approach. J. Vis. Exp. (147), e59403, doi:10.3791/59403 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter