Lipidomik och transkriptomik vid neurologiska sjukdomar
Summary
Denna artikel presenterar ett modulärt protokoll för vävnad lipidomics och transkriptomics och plasma lipidomics i neurologiska sjukdom mus modeller som riktar sig till lipider underliggande inflammation och neuronal aktivitet, membran lipider, nedströms budbärare och mRNA-kodning enzymer/receptorer underliggande lipid funktion. Provtagnings-, provbearbetnings-, extraktions- och kvantifieringsförfaranden beskrivs.
Abstract
Lipider fungerar som det primära gränssnittet till hjärnförolämpningar eller stimuli som främjar neurologiska sjukdomar och är en reservoar för syntes av lipider med olika signalerings- eller ligandfunktion som kan understryka uppkomsten och progressionen av sjukdomar. Lipider förändras ofta på presymtomatisk nivå och är en framväxande källa till läkemedelsmål och biomarkörer. Många neurologiska sjukdomar uppvisar neuroinflammation, neurodegeneration och neuronal excitabilitet som vanliga kännetecken, delvis modulerade av specifika lipidsignaleringssystem. Det ömsesidiga beroendet och sambandet mellan syntes av olika lipider föranleder en multilipid, multienzym och multireceptor analys för att härleda commonalities och specificiteter av neurologiska sammanhang och att påskynda upplösningen av mekanistiska aspekter av sjukdom debut och progression. Att tillskriva lipidroller till distinkta hjärnregioner främjar bestämningen av lipidmolekylär fenotyp och morfologi i samband med en neurologisk sjukdom.
Presenteras här är ett modulärt protokoll som lämpar sig för analys av membran lipider och nedströms lipid signaler tillsammans med mRNA av enzymer och medlare som ligger till grund för deras funktionalitet, extraheras från diskreta hjärnregioner som är relevanta för en viss neurologisk sjukdom och /eller villkor. För att säkerställa korrekt jämförande lipidomisk profilering optimerades och standardiserades arbetsflöden och driftskriterier för: i) hjärnprovtagning och dissekering av regioner av intresse, ii) samextraktion av flera lipidsignaler och membranfetter, iii) dubbel lipid/mRNA-extraktion, iv) kvantifiering genom vätskekromatografi multipla reaktionsövervakning (LC/MRM) och v) standard mRNA-profilering. Detta arbetsflöde är mottagligt för de låga vävnadsmängder som erhålls genom provtagning av de funktionellt diskreta hjärnans subregioner (dvs. genom hjärnslagning), vilket förhindrar partiskhet i multimolekylär analys på grund av vävnads heterogenitet och/eller djurvariation. För att avslöja perifera konsekvenser av neurologiska sjukdomar och upprätta translationella molekylära avläsningar av neurologiska sjukdom stater, perifera organ provtagning, bearbetning och deras efterföljande lipidomic analys, liksom plasma lipidomics, också eftersträvas och beskrivs. Protokollet demonstreras på en akut epilepsi mus modell.
Introduction
De senaste framstegen i lipidernas funktion och deras roll i uppkomsten och progressionen av neurologiska sjukdomar öppnar nya forsknings- och utvecklingsplatser för nya terapeutiska mål och sjukdomsmekanismer klargörande1. Dokumenterade skillnader i lipidsammansättning i olika hjärnregioner, betonade av moderna molekylära bildframställningstekniker som masspektrometri imaging och avancerad masspektrometri profilering, skiftar paradigmet för lipid undersökning från hela hjärnan mot funktionellt distinkta och diskreta hjärnregioner. Det faktum att lipidsammansättning varierar i olika hjärnregioner föranleder ny konceptualisering av både membranfettkänslighet och nedströms lipidsignalering som svar på en hjärnförolämpning eller stimuli över de funktionellt distinkta hjärnregionerna. Därför kräver lipidprotokoll ny utveckling för att ta itu med utmaningen med låga vävnadsmängder för högre rumslig upplösning upptäckt och kvantifiering, och samtidigt analys av flera lipidkomponenter i cellmembran och signalvägar. Också, bestämning av enzymer, lipid ligands, och receptorer som är involverade i regleringen av deras nivåer och funktion är av största vikt för att klargöra signalvägarna som påverkas i en neurologisk sjukdom och vägleda nya mekanistiska undersökningar i ett patofysiologiskt sammanhang.
Förutom den ökade hjärnans rumsliga upplösning finns det två stora svårigheter som utmanar utvecklingen av nya neurolipidomic metoder. För det första är lipidsignaleringsmolekylerna vanligtvis av mycket lågt överflöd jämfört med membrankonstituerande lipider. För det andra uppvisar lipidomet en hög strukturell heterogenitet, svår att dissekera med ett enda analytiskt tillvägagångssätt. Därför är extraktions- och analysmetoder skräddarsydda för olika lipidkategorier och utförs ofta i distinkta vävnadsprover2. Hagelgevär lipidomiska metoder3 är utmärkta verktyg för att snabbt avslöja en bred profil av membranfetter, medan ökad känslighet och selektivitet som erbjuds av de riktade metoderna för upptäckt och kvantifiering av masspektrometri utnyttjas för undersökning av låga rikliga signallipider inklusive: i) inflammatoriska lipider och ii) lipider som är involverade i modulering av neuronal aktivitet, såsom endocannabinoider (eCBs), aminosyralänkade lipider, etc.4,5. För att omfatta lipidförändringar vid både cellmembranet och signalnivån som förekommer i hjärnregioner av neurologiska sjukdomsmodeller utförs vanligtvis lipidutvinning och analys i distinkta vävnadsprover, erhållna från distinkta djurpartier eller från olika halvklot, eller genom att dissekera en större vävnadsregion i flera bitar. När mRNA-nivåer av enzymreceptorer också är av intresse, kräver deras undersökning vanligtvis upphandling av ett distinkt vävnadsprov. Till exempel skulle undersökningen av membranfetter, endogena cannabinoider och mRNA kräva tre olika vävnadsprover (t.ex. två prover för de två lipidutvinningsmetoderna-membranlipider och signalerande lipider – och efterföljande två lipidanalysmetoder – och ett prov för mRNA-analys). Undersökning av inflammatoriska lipider och endogena cannabinoider kräver två distinkta vävnadsprover, extraktionsmetoder respektive analysmetoder. Ett annat exempel är undersökningen av mRNA och av alla lipidkategorier i en hjärnstans eller lasermikrodissectionprov som följaktligen kräver två distinkta djur för att anskaffa två prover per hjärna (sub)region. En betydande grad av variabilitet och/eller dålig reproducerbarhet av resultaten förekommer ofta i sådana fall, med ursprung i biologisk variabilitet och/eller vävnads heterogenitet. Vägledd av dessa praktiska begränsningar av multimolekylär analys, som förekommer särskilt vid hög rumslig upplösning i hjärnan, utformades ett tremoduls neurolipidomics protokoll som omfattar: 1) samextring och samanalys av LC/MRM av inflammatoriska lipider (t.ex. eicosanoids (ecs)) och lipider som är involverade i modulering av neuronal aktivitet, såsom eCBs2; 2) samextraktion av fosfolipider (PLs) och eCBs med efterföljande multiscan LC/MRM och analys av prekursor/neutral förlustskanning2; och 3) dubbel extraktion av membran (fospho)lipider och eCB samt mRNA, med efterföljande LC/MRM och qPCR- eller RNA-sekvenseringsanalys6. Beroende på den biologiska fråga som ska tas upp vid en neurologisk sjukdom och hjärnregionen av intresse kan en kombination av det första och det andra protokollet, eller det första och det tredje protokollet, tillämpas på samma vävnadsprov för vävnader som väger cirka 4 mg. Det första och tredje protokollet kan tillämpas självständigt för vävnader runt 2 mg. Det andra protokollet kan tillämpas för vävnader som väger så lite som 0,5 mg. Oavsett vilken neurolipidomisk protokollmodul som valts är vävnadsprovtagning och föranalysbehandling, hjärnisolering och region dissekering, liksom förfarandet för att offra djurmodellen standardiserade och identiska för alla tre modulerna i protokollet. I vår undersökning av neurologiska sjukdomar samlas perifera organ som är relevanta för sjukdomens patologiska konsekvenser alltid också in och analyseras med hjälp av dessa modulära protokoll. Dessutom provtas blod regelbundet för plasmafetter för att fungera som ett avläsningsverktyg för neurologiska sjukdomar med tanke på framtida translationella tillämpningar. Det här presenterade modulära lipidomics protokollet är mycket mångsidigt: skalbar till större vävnad mängder och lätt tillämplig för praktiskt taget alla vävnad typ och sjukdomar. För tillämpning av modulprotokollet (Bild 1) vid neurologiska sjukdomar är alla standardiserade gnagare modeller av debut och progression av neurologiska störningar, såsom traumatisk hjärnskada, Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom eller epilepsi mottagliga.
Dessa protokoll har tillämpats i stor utsträckning för att studera förändringar i vävnadsfettsom och/eller transkriptom i den akuta fasen av epilepsi i kainisk syra (KA)-inducerad musmodell av epilepsi2,7, en modell som ofta används i prekliniska studier på grund av likheten med human temporallob epilepsi (TLE)8,9,10,11. Med hjälp av dessa protokoll bedömdes den terapeutiska potentialen hos läkemedel som Palmitoylethanolamide (PEA)12,13 i samma musmodell av epilepsi. Studien identifierade lipid- och mRNA-förändringar vid hög och låg rumslig upplösning i hjärnan och periferin, vid tidpunkten för maximal akut anfallsintensitet (vid 60 min posteizureinduktion) och vid subkronisk och akut behandling med PEA vid fyra olika tidpunkter (20, 60, 120 och 180 min) efter KA-anfallsinduktion, ett tidsfönster som täcker den akuta fasen av epilepsi. Plasma, hjärnor och perifera organ hos obehandlade KA-injicerade möss, akut och subkroniskt PEA-behandlade möss, liksom fordon och PEA-fordon kontroll möss, samlades in vid varje tidpunkt12,13, och undersöktes med denna molekylära analys. De molekylära data var korrelerade med beteendemässiga fenotyper som erhållits genom beslag poäng, liksom med immunohistochemistry-härledda data om neurodegenerativa processer, för att nysta upp progressionen av den akuta epilepsi fasen och PEA potential att lindra det.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den neurolipidomic och transkriptomic metodik beskrivs här är ett livskraftigt sätt att undersöka någon sjukdom eller hälsosam utveckling vid hög och låg rumslig upplösning i hjärnan och perifera organ. På grund av de optimerade plasmaprovtagnings- och hanteringsförfarandena kan plasmalipidsanalys också utföras från samma djur som offrats för vävnadslipis och transkriptomik, vilket förbättrar tillförlitligheten hos vävnadsblodmolekyler och biomarkörupptäckt. Tillhandahållandet av en bred uppsättn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tillägnar den här artikeln till Dr. Ermelinda Lomazzo. Under färdigställandet av detta manuskript gick Dr. Ermelinda Lomazzo bort. Hon är förkroppsligandet av passion för vetenskap och osjälviskt engagemang i teamarbete för att uppfylla ett meningsfullt forskningsändamål. Hon drömde alltid om att bidra meningsfullt till människors större välbefinnande. Hennes godhjärtade natur komprometterades aldrig av vetenskapens och livets ansträngande vägar. Hon kommer att förbli ovärderlig, och för evigt, i våra hjärtan.
Julia M. Post finansierades av Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) vid University Medical Center vid Johannes Gutenberg University Mainz och finansieras för närvarande av SPP-2225 EXIT-projektet till LB. Raissa Lerner finansierades delvis av DZHK-projektet 81X2600250 till LB och Lipidomics Core Facility. Partiell finansiering för dessa studier tillhandahölls av Lipidomics Core Facility, Institute of Physiological Chemistry och Intramural fonder (till LB) från University Medical Center vid Johannes Gutenberg University Mainz.
Materials
| 12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
| 12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
| 1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
| 5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
| ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
| Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
| Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
| Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
| Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
| Bino | Zeiss | Microscopy | |
| cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
| Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
| CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
| Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
| EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
| EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
| Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
| Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
| Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
| Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
| Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
| Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
| LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
| Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
| Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
| Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
| Motic Camara | Motic | Microscopy | |
| MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
| MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
| NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
| PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
| PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
| Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
| PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
| PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
| PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
| PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
| PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
| PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
| Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
| Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
| Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
| Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
| Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
| Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
| Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
| PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
| Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
| Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
| Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
| Rneasy Mini Kit – RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
| Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
| Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
| Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
| SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
| SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
| Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
| Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
| T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
| Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
| Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
| Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
| Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
| Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
| Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
| Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |
References
- Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
- Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
- Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
- Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
- Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
- Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
- Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
- Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. Microglia-Neuron Communication in Epilepsy. Glia. 65 (1), 5-18 (2017).
- Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).
- Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
- Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).
- Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
- Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
- Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
- Konsman, J. P. The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
- Spijker, S., Li, K. W. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. 57, 13-27 (2011).
- Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
- Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
- Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
- Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
