Summary

הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses

Published: May 02, 2019
doi:

Summary

פאן-lyssavirus וירוס שעתוק הפוכה התגובה שרשרת פותחה כדי לזהות במיוחד את כל lyssavirus ידוע. אימות באמצעות דגימות מוח של כלבת ממינים שונים של בעלי חיים הראו כי שיטה זו יש רגישות וספציפיות שוות ערך לבדיקת נוגדן הפלורסנט הסטנדרטית וניתן להשתמש בה לאבחון כלבת שגרתית.

Abstract

כדי לזהות וירוס כלבת ומינים אחרים של הסוג Lyssavirus בתוך המשפחה התמס שריר, הפאן-lyssavirus מקונן הפוך תגובת שרשרת פולימראז (מקונן RT-PCR) פותחה כדי לזהות את האזור שימור של הגנים הנואופלפרוטאין (N) של ליסביזירוסים. השיטה מחילה הפוכה שעתוק (RT) באמצעות RNA ויראלי כמו תבנית ו oligo (dT)15 ו הבוחנים אקראיים כמו התחל לסנתז את ה-DNA המשלים ויראלי (cdna). לאחר מכן, cDNA ויראלי משמש תבנית כדי להגביר 845 bp N מקטע גנים בסיבוב הראשון של ה-PCR באמצעות התחל החיצוני, ואחריו ה-PCR מקונן השני להגביר את הסופי 371 bp קטע באמצעות התחל הפנימי. שיטה זו יכולה לזהות שיטות גנטיות שונות של וירוסי כלבת (RABV). האימות, שימוש 9,624 דגימות מוח של שמונה מינים בעלי חיים ביתיים ב 10 שנים של אבחון כלבת קלינית ומעקב בסין, הראו כי השיטה יש 100% רגישות ו 99.97% ספציפיות בהשוואה עם פלורסנט ישירה מבחן נוגדן (FAT), השיטה הסטנדרטית זהב המומלצת על ידי ארגון הבריאות העולמי (מי) והארגון העולמי לבריאות בעלי חיים (OIE). בנוסף, השיטה יכולה במיוחד להגביר את המוקד המיועד N גן של 15 מאושרים אחרים ושני מינים lyssavirus הרומן בדוח 10 של הוועד הבינלאומי על טקסונומיה של וירוסים (ICTV) כפי שוערך על ידי זיהוי חיקוי של מסונתז . גן הפלזמה של כל הנגיפים השיטה מספקת חלופה נוחה ל-FAT עבור אבחון כלבת ואושרה כסטנדרט לאומי (GB/T36789-2018) של סין.

Introduction

כלבת היא מחלה zoonotic עולמית הנגרמת על ידי וירוסים בתוך הסוג Lyssavirus1. Lyssaviruses (משפחה תמסשליליות) הם חד שליליים וירוסי RNA עם הגנום כ 12 kb המקודד חמישה חלבונים: N, פוספופפרוטאין (P), חלבון מטריצה (M), גליקופרוטאין (G), וחלבון גדול או פולימראז (L). מבוסס על רצפי נוקלאוטיד של N הגן, המרחק הגנטי, ודפוסי אנטיגניים, lyssaviruses חולקו 16 מינים, המורכב וירוס כלבת הקלאסי (RABV) ואת הקשורים לכלבת וירוסים (RRV): לאגוס וירוס בת (LBV), וירוס Duvenhage (DUVV ), וירוס מוקדי (מוקדי), העטלף האירופי lyssavirus 1 (EBLV-1), העטלף האירופי lyssavirus 2 (EBLV-2), העטלף האוסטרלי lyssavirus (ABLV), וירוס (ARAV), וירוס Ikoma (IKOV), Bokeloh בת lyssavirus (BBLV), בובת ליסביו וירוס (GBLV), Irkut וירוס (IRKUT), קוג’וירוס (ח’ו), וירוס עטלף קווקזי מערבי (WCBV), וירוס שמעוני בת (שימב), וליידה בת ליסביסוירוס (לואלין)2. לאחרונה, שתי lyssaviruses נוספים זוהו: Kotalahti בת lyssaviruses (KBLV) בודד מן העטלף של ברנדט (Myotisברנטי) בפינלנד ב 20173 ו-lyssaviruses ירוס בת טייוואן (twblv) מבודד pipistrellllllllllllllll Pipistrellus abramus) בטייוואן, סין בשנת 2016 – 20174.

כל היונקים רגישים לכלבת; עם זאת, לא נגעים פתוגנוניים ברוטו או שלטים קליניים ספציפיים לאפשר זיהוי שלה, ואבחון יכול להתבצע רק במעבדה5. השיטה הנפוצה ביותר לאבחון כלבת היא השומן, שנחשב לסטנדרט הזהב של האדם והשני, שניהם5,6. אף על פי כן, השומן יכול לייצר תוצאות לא מהימנות על בדיקות רקמה במוח בירידה/אוטומטית. בנוסף, לא ניתן להשתמש בו כדי לאבחן דגימות נוזלים ביולוגיים כגון נוזל שדרתי (שדרתי), רוק ושתן, ובכך מנעה במידה רבה את התעסוקה שלו באבחון הנתיחה7. בדיקות האבחון הקונבנציונליות המקובלות, כגון בדיקת הזיהום בתרבות רקמת הכלבת (RTCIT) ובדיקת החיסון לעכבר (MIT), דורשות מספר ימים6, חיסרון גדול כאשר אבחון מהיר חיוני.

בדיקות אבחון מולקולריות שונות (לדוגמה, זיהוי רנ א ויראלי על-ידי RT-PCR, התפקוד החיסוני המקושר ל-pcr, בתוך היברידיזציה, ו-PCR בזמן אמת) משמשים כטכניקות מהירות ורגישות לאבחון כלבת8. RT-PCR מומלץ כיום על ידי OIE עבור אבחון כלבת שגרתית, ו המופילו (ח נ) PCR מתואר במדריך OIE של בדיקות אבחון וחיסונים עבור חיות יבשתי כדי לזהות את כל lyssaviruses5. כאן אנו מתארים הפאן-lyssavirus מקונן RT-PCR, אשר מאפשר זיהוי ספציפי ורגיש של כל 18 lyssavirus מינים להשוות או לחרוג שהושג על ידי השומן. העיקרון של השיטה הוא RT של RNA היעד (אזור שימור של גן lyssavirus N) לתוך cDNA, ואחריו הגברה של cDNA על ידי שני סיבובים של ה-PCR. CDNA עובר את ה-PCR העגול הראשון עם התחל החיצוני כדי להגביר רסיס bp 845; לאחר מכן, ה-PCR העגול השני משתמש במוצר ה-PCR העגול הראשון כתבנית כדי להגביר רסיס של 371 bp עם התחל הפנימי. שני סיבובים של ה-PCR מגבירים באופן משמעותי את רגישות הצורה.

Protocol

השימוש בעכברים בפרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המנהלית לרווחת בעלי חיים של המכון לרפואה וטרינרית צבאית, האקדמיה למדעי הרפואה הצבאית, סין (טיפול בבעלי חיים מעבדה ושימוש באישור הוועדה, היתר מספר JSY-DW-2010-02). כל ההנחיות המוסדיים והמנחים הלאומיים לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים הופעלו. <p cla…

Representative Results

תוצאות של RT-PCR מקונן כדי לזהות 18 lyssavirus מינים מוצגים באיור 1. כל הפקדים החיוביים של ה-PCR הראו את התוצאה הצפויה 845 bp ב-1-ו-371 bp בהגברה השנייה של הסיבוב, ללא להקה בשליטה השלילית. כל 18 lyssaviruses הפיק 845 ו/או 371 להקות bp, המציין כי RT-PCR מקונן זיהה את כל 18 lyssaviruses. הגברה יעילה של שישה כדורים בשני …

Discussion

כיום, RABV הוא וירוס מרכזי האחראי על כמעט כל כלבת האדם והחיה בסין, כמו גם במדינות אחרות. בנוסף, משתנה IRKV זוהה לראשונה מ- Murina leucogaster במחוז ג’ילין בצפון מזרח סין ב 201210, והיא דווחה כדי לגרום למותו של כלב במחוז ליאונינג ב 201711. לאחרונה, הרומן lyssavirus, TWBLV, זוהה גם מתוך ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר היה נתמך על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי (גרנט no. 2016YFD0500401) ואת הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (גרנט no. 31302043).

Materials

50 × TAE Various Various
6 × loading buffer TakaRa 9156
Agarose US Everbright® Inc A-2015-100g
ddH2O Various Various
DL 2,000 Marker Takara 3427A
dNTPs (10 mM) TakaRa 4019
dNTPs (2.5 mM) TakaRa 4030
Electrophoresis System Tanon EPS300
Ex-Taq (5 U/μL) TakaRa RR001
Gel Imaging System UVITEC Fire Reader
Microcentifuge tubes Various Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) TakaRa 2641A 
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermoscientific ND1000
Oligo (dT)15 TakaRa 3805
PCR Machine BIO-RAD T100
PCR Tubes Various Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase NEW ENGLAND BioLabs M0530S
Pipettors Various Various
Random Primer TakaRa 3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL) TakaRa 2313A
RNase-free ddH2O TakaRa 9102
Taq Buffer (10×) TakaRa 9152A
Tips Various Various
Vortex mixer Various Various

References

  1. Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1 (2), 101-109 (2002).
  2. Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163 (8), 2283-2294 (2018).
  3. Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).
  4. Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).
  5. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. , 74-195 (2018).
  6. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86 (10), 1804-1812 (2014).
  7. Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3 (9), 530 (2009).
  8. Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136 (4), 504-508 (2008).
  9. Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69 (3), 687-693 (2013).
  10. Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31 (2), 146-148 (2018).
  11. Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143 (6), 1287-1291 (2015).
  12. Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161 (10), 2851-2854 (2016).

Play Video

Cite This Article
Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).

View Video