Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses

doi: 10.3791/59428 Published: May 2, 2019
* These authors contributed equally

Summary

פאן-lyssavirus וירוס שעתוק הפוכה התגובה שרשרת פותחה כדי לזהות במיוחד את כל lyssavirus ידוע. אימות באמצעות דגימות מוח של כלבת ממינים שונים של בעלי חיים הראו כי שיטה זו יש רגישות וספציפיות שוות ערך לבדיקת נוגדן הפלורסנט הסטנדרטית וניתן להשתמש בה לאבחון כלבת שגרתית.

Abstract

כדי לזהות וירוס כלבת ומינים אחרים של הסוג Lyssavirus בתוך המשפחה התמס שריר, הפאן-lyssavirus מקונן הפוך תגובת שרשרת פולימראז (מקונן RT-PCR) פותחה כדי לזהות את האזור שימור של הגנים הנואופלפרוטאין (N) של ליסביזירוסים. השיטה מחילה הפוכה שעתוק (RT) באמצעות RNA ויראלי כמו תבנית ו oligo (dT)15 ו הבוחנים אקראיים כמו התחל לסנתז את ה-DNA המשלים ויראלי (cdna). לאחר מכן, cDNA ויראלי משמש תבנית כדי להגביר 845 bp N מקטע גנים בסיבוב הראשון של ה-PCR באמצעות התחל החיצוני, ואחריו ה-PCR מקונן השני להגביר את הסופי 371 bp קטע באמצעות התחל הפנימי. שיטה זו יכולה לזהות שיטות גנטיות שונות של וירוסי כלבת (RABV). האימות, שימוש 9,624 דגימות מוח של שמונה מינים בעלי חיים ביתיים ב 10 שנים של אבחון כלבת קלינית ומעקב בסין, הראו כי השיטה יש 100% רגישות ו 99.97% ספציפיות בהשוואה עם פלורסנט ישירה מבחן נוגדן (FAT), השיטה הסטנדרטית זהב המומלצת על ידי ארגון הבריאות העולמי (מי) והארגון העולמי לבריאות בעלי חיים (OIE). בנוסף, השיטה יכולה במיוחד להגביר את המוקד המיועד N גן של 15 מאושרים אחרים ושני מינים lyssavirus הרומן בדוח 10 של הוועד הבינלאומי על טקסונומיה של וירוסים (ICTV) כפי שוערך על ידי זיהוי חיקוי של מסונתז . גן הפלזמה של כל הנגיפים השיטה מספקת חלופה נוחה ל-FAT עבור אבחון כלבת ואושרה כסטנדרט לאומי (GB/T36789-2018) של סין.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כלבת היא מחלה zoonotic עולמית הנגרמת על ידי וירוסים בתוך הסוג Lyssavirus1. Lyssaviruses (משפחה תמסשליליות) הם חד שליליים וירוסי RNA עם הגנום כ 12 kb המקודד חמישה חלבונים: N, פוספופפרוטאין (P), חלבון מטריצה (M), גליקופרוטאין (G), וחלבון גדול או פולימראז (L). מבוסס על רצפי נוקלאוטיד של N הגן, המרחק הגנטי, ודפוסי אנטיגניים, lyssaviruses חולקו 16 מינים, המורכב וירוס כלבת הקלאסי (RABV) ואת הקשורים לכלבת וירוסים (RRV): לאגוס וירוס בת (LBV), וירוס Duvenhage (DUVV ), וירוס מוקדי (מוקדי), העטלף האירופי lyssavirus 1 (EBLV-1), העטלף האירופי lyssavirus 2 (EBLV-2), העטלף האוסטרלי lyssavirus (ABLV), וירוס (ARAV), וירוס Ikoma (IKOV), Bokeloh בת lyssavirus (BBLV), בובת ליסביו וירוס (GBLV), Irkut וירוס (IRKUT), קוג'וירוס (ח'ו), וירוס עטלף קווקזי מערבי (WCBV), וירוס שמעוני בת (שימב), וליידה בת ליסביסוירוס (לואלין)2. לאחרונה, שתי lyssaviruses נוספים זוהו: Kotalahti בת lyssaviruses (KBLV) בודד מן העטלף של ברנדט (Myotisברנטי) בפינלנד ב 20173 ו-lyssaviruses ירוס בת טייוואן (twblv) מבודד pipistrellllllllllllllll Pipistrellus abramus) בטייוואן, סין בשנת 2016 – 20174.

כל היונקים רגישים לכלבת; עם זאת, לא נגעים פתוגנוניים ברוטו או שלטים קליניים ספציפיים לאפשר זיהוי שלה, ואבחון יכול להתבצע רק במעבדה5. השיטה הנפוצה ביותר לאבחון כלבת היא השומן, שנחשב לסטנדרט הזהב של האדם והשני, שניהם5,6. אף על פי כן, השומן יכול לייצר תוצאות לא מהימנות על בדיקות רקמה במוח בירידה/אוטומטית. בנוסף, לא ניתן להשתמש בו כדי לאבחן דגימות נוזלים ביולוגיים כגון נוזל שדרתי (שדרתי), רוק ושתן, ובכך מנעה במידה רבה את התעסוקה שלו באבחון הנתיחה7. בדיקות האבחון הקונבנציונליות המקובלות, כגון בדיקת הזיהום בתרבות רקמת הכלבת (RTCIT) ובדיקת החיסון לעכבר (MIT), דורשות מספר ימים6, חיסרון גדול כאשר אבחון מהיר חיוני.

בדיקות אבחון מולקולריות שונות (לדוגמה, זיהוי רנ א ויראלי על-ידי RT-PCR, התפקוד החיסוני המקושר ל-pcr, בתוך היברידיזציה, ו-PCR בזמן אמת) משמשים כטכניקות מהירות ורגישות לאבחון כלבת8. RT-PCR מומלץ כיום על ידי OIE עבור אבחון כלבת שגרתית, ו המופילו (ח נ) PCR מתואר במדריך OIE של בדיקות אבחון וחיסונים עבור חיות יבשתי כדי לזהות את כל lyssaviruses5. כאן אנו מתארים הפאן-lyssavirus מקונן RT-PCR, אשר מאפשר זיהוי ספציפי ורגיש של כל 18 lyssavirus מינים להשוות או לחרוג שהושג על ידי השומן. העיקרון של השיטה הוא RT של RNA היעד (אזור שימור של גן lyssavirus N) לתוך cDNA, ואחריו הגברה של cDNA על ידי שני סיבובים של ה-PCR. CDNA עובר את ה-PCR העגול הראשון עם התחל החיצוני כדי להגביר רסיס bp 845; לאחר מכן, ה-PCR העגול השני משתמש במוצר ה-PCR העגול הראשון כתבנית כדי להגביר רסיס של 371 bp עם התחל הפנימי. שני סיבובים של ה-PCR מגבירים באופן משמעותי את רגישות הצורה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השימוש בעכברים בפרוטוקול זה אושר על ידי הוועדה המנהלית לרווחת בעלי חיים של המכון לרפואה וטרינרית צבאית, האקדמיה למדעי הרפואה הצבאית, סין (טיפול בבעלי חיים מעבדה ושימוש באישור הוועדה, היתר מספר JSY-DW-2010-02). כל ההנחיות המוסדיים והמנחים הלאומיים לטיפול ולשימוש בבעלי חיים מעבדתיים הופעלו.

1. הפקת רנ א

  1. לחלץ RNA מרקמת המוח החשודה, העור ביופסיות, רוק, או שדרתי או מתרבות תא הנגועים RABV, באמצעות guanidinium isothiocyanate-פנול-כלורופורם מבוססי שיטות מיצוי או מסחרית ויראלי מסחרי הפקת ערכות. השתמש ב-RNA המוכן מיד או אחסן אותו ב-80 ° c עד הצורך.

2. שעתוק הפוכה של ה-RNA הנגיפי

  1. הסר את הריאגנטים RT המפורטים בטבלה 1 מן המקפיא, לשמור אותם על הקרח, להפשיר ומערבולת אותם לפני השימוש.
  2. הכינו 12 μL של שילוב התגובה RT בצינור 0.2 mL PCR עם ריאגנטים המפורטים בטבלה 1. אפשר וריאציות ליטוף על ידי הכנת נפח של מיקס מאסטר לפחות גודל תגובה אחד גדול מהנדרש.
  3. הוסף 8 μL לדוגמה, RNA שליטה חיובית או שליטה שלילית בתמהיל התגובות RT בתוך תחנת עבודה PCR בחדר תבנית. השליטה החיובית RT הוא RNA שחולצו מן התרבות התאית נגוע במתח RABV קבוע קורות חיים -11 (האתגר וירוס רגיל -11) ומאוחסן ב-80 ° c. הפקד השלילי מכיל RNase-חינם ddH2O.
  4. מערבבים את התוכן של צינורות RT על ידי vortexing; לאחר מכן, צנטריפוגה בקצרה.
  5. לטעון את הצינורות התגובה לתוך הציקלאה תרמית. הגדר את תוכנית הסינתזה של cDNA בתנאים הבאים: 42 ° c עבור 90 דקות, 95 ° c עבור 5 דקות, ו-4 ° c בהמתנה. הגדר את עוצמת התגובה ל -20 μL. הפעל את הפעלת RT.

3. ה-PCR העגול הראשון

  1. שמרו על החומרים המולקולארית המפורטים בטבלה 2 על הקרח בחדר נקי עד השימוש; אז, להפשיר ולערבולת אותם.
  2. הכינו את המיקס הראשון של ה-PCR בצינור 0.2 mL עם הריאגנטים הרשום בטבלה 2.
  3. הוסף מדגם 2 μL של cDNA או פלבאמצע לתערובת ה-PCR העגולה הראשונה בתוך תחנת עבודה של PCR בחדר תבנית. הבקרה החיובית של ה-PCR מהווה את קורות החיים 11 cDNA שהוכנו כאמור בשלב 2.3 עבור שיטת RT לעיל. הבקרה השלילית של ה-PCR היא.
  4. העבירו את הצינורות החתומים לציקלור תרמי של PCR ומחזור באמצעות הפרמטרים המפורטים בטבלה 3.

4. PCR הסיבוב השני

  1. הכינו את שילוב ה-PCR השני בסיבוב בצינור 0.2 mL באמצעות הריאגנטים הרשום בטבלה 4.
  2. הוסף 2 μL של מוצר ה-PCR הראשון בסיבוב לתוך המיקס השני של PCR. בנוסף, הכללת ddH2O כפקד שלילי של ה-PCR העגול השני.
  3. בצע את הרכיבה התרמית PCR באמצעות אותם פרמטרים כפי שניתן בשלב 3.4.

5. ניתוח מוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה על ג'ל לצמח

  1. להכין 1.5% agarose ג'ל על ידי הוספת 1.5 g של agarose ל 100 mL של טריס-אצטט-EDTA (טה) והמסת אותו ביסודיות על ידי חימום אותו במיקרוגל.
  2. הוסף אתידיום ברומיד (EB) (בריכוז סופי של 0.01%) או החלפת EB מסחרית אחרת. יוצקים את ג'ל לתוך העובש ולהשאיר אותו לגבש בטמפרטורת הסביבה לפחות 30 דקות.
  3. הכן את דגימות הטעינה על ידי ערבוב 5 μL של כל מוצר PCR עם 1 μL של מאגר טעינת 6x.
  4. טען את הדגימות ואת סמן ה-DNA המתאים בנפרד לתוך הבארות ולהפעיל את ג'ל עבור כ 30-45 דקות ב 120 V עד קו הצבע הוא כ 75%-80% למטה את הג.
  5. כבה את החשמל, נתק את האלקטרודות ממקור החשמל ולאחר מכן, הוצא את הג בזהירות מהתיבה ג'ל.
  6. השתמש ג'ל UV המתעד המכשיר כדי להמחיש ולצלם את קטעי ה-DNA.

6. אפיון מקונן-PCR

  1. 6.1. ספציפיות ורגישות לגילוי של 18 ליסביסווירוסים
    1. הזמנת 18 מסחרי הפלסטיק המכיל את כל N הגן המלא של כל lyssavirus (16 מינים ICTV ושני מינים הרומן) עבור ה-PCR.
    2. חשב את מספר ההעתק של הפלסמיד באמצעות המספר של אבוגדרו (NA) והנוסחה הבאה.
      [(g/μL באמצע DNA)/(אורך פלארמיד ב bp x 660)] x 6.022 x 1023 = מספר מולקולות/μl
    3. הכנת פתרונות מניות (2.24 x 109 מולקולות/μl) של כל 18 הפלמידים ב ddh2O.
    4. בצע 9 10-מדלל סידוריים מקפלים של כל 18 הפלמידים ב ddH2O. לדלל 10 μl של כל מלאי פלסטלינה עם 90 Μl של ddh2O. מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר.
    5. בצע הגברה של ה-PCR כמתואר בסעיפים 3-5.
    6. לנתח את הספציפיות ואת הרגישות של ה-PCR המקונן על ידי זיהוי סדרה של הפלמידים lyssavirus ירוס.
  2. קביעת הממד מילת הזווית ל איזה
    1. כוונן את סיכוייו של זן וירוס כלבת קורות חיים 11 התרבות תא כדי 105.5 tcid50/ml (וירוס סיכוייו נקבע על פי המדריך oie)5.
    2. ביצוע 5 10-מדלל סידוריים מקפלים של קורות חיים -11 (פתרון המניה הוא 105.5 tcid50/ml) כפי שמתואר בשלב 6.1.4.
    3. בצע את חילוץ ה-RNA ואת הליכי הגברה מקוננים RT-PCR של כל מדלל ויראלי כפי שמתואר בסעיפים 1-5.
  3. Compar סון מ את ה RT-PCR מקונן עם "תקן זהב" שומן
    1. בדוק את כל הדגימות הקליניות על ידי מקונן RT-PCR, ולאחר מכן, לאשר את התוצאות עם השומן5 ו-N גן שרשור רצף9.
    2. השתמש בנתונים מנורמל עבור ניתוח סטטיסטי עם SAS 9.1. השתמש במבחן קאפה ובמבחן צ'י-בריבוע של מק להשוואה סטטיסטית של בדיקות האבחון (הפקודה SAS: הליך freq; שולחן/מסכים). חשב רווחי ביטחון בהנחה abinomial הפצה.
  4. הערכת היעילות בבדיקת דגימות מירידה
    1. לחשוף שתי דגימות מוח קליני מאושרות של כלבים בכלבת בשעה 37 ° c.
    2. מטפל בשתי הדגימות בכל יום של חשיפה ב 37 ° c על ידי מקונן RT-PCR, FAT, ו-MIT5.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תוצאות של RT-PCR מקונן כדי לזהות 18 lyssavirus מינים מוצגים באיור 1. כל הפקדים החיוביים של ה-PCR הראו את התוצאה הצפויה 845 bp ב-1-ו-371 bp בהגברה השנייה של הסיבוב, ללא להקה בשליטה השלילית. כל 18 lyssaviruses הפיק 845 ו/או 371 להקות bp, המציין כי RT-PCR מקונן זיהה את כל 18 lyssaviruses. הגברה יעילה של שישה כדורים בשני סיבובים של ה-PCR, אבל שניים, כלומר ARAV ו-IKOV, הגברה באחד או בשני של ה-PCR. הרגישות של השיטה מגוונת בזיהוי של הפלמידים lyssavirus שונים, עם מגבלות החל 2.24 x 100 כדי 2.24 x 105 מולקולות/μl, כפי שמוצג בטבלה 6. הבדלים אלה יכולים להיות מיוחסים לחוסר התאמות בין התחל ותבניות בשל הגיוון רצף ויראלי. יתר על כן, הרגישות של גילוי וירוס כלבת קורות חיים 11 בתרבות התא היה 102.5 tcid50/ml.

סך של 9,624 רקמות מוח מדגימות קליניות נבדקו על ידי מקוננים RT-PCR בהשוואה ל-FAT והתוצאות מסוכמות בטבלה 7, אשר מראה כי מקונן RT-pcr היה 100% רגישות (CI, 97.75% כדי 100%) ו 99.97% ספציפיות (CI, 99.91% עד 99.99%). ההתאמה בין שתי השיטות הייתה 99.07%. שלוש בדיקות שהיו חיוביות על ידי מקונן RT-PCR אבל שלילי על ידי השומן היו של חומר קליני מאוד התפורר. שלושת הדגימות האלה אושרו כ-RABV חיובי באמצעות רצף גנים N.

השוואה של ביצועי הבדיקה בזיהוי של שני דגימות המוח מודבטים ב 37 ° צ' (שלב 6.4.1 של הפרוטוקול) ציין כי RT-PCR מקונן יכול לזהות וירוס ברקמות המוח הנרקב לפחות 17 ימים השפלה, אשר הוא עבור פרק זמן ארוך יותר בהשוואה ל -7 ימים בלבד על ידי ה-FAT ואף לא יום אחד על ידי ה-MIT. תוצאה זו מראה כי מקונן RT-PCR רגיש יותר באיתור של דגימות שאינן מרגישות מאשר ה-FAT ו-MIT.

כדי להמשיך ולאמת את הקינון של RT-PCR, 10 מעבדות כלבת בסין הוזמנו לערוך בדיקות על מערכת של דגימות. מתוך אלה, שמונה מעבדות סופקו מערכת של 10 רקמות מוח בעלי חיים עיוור מהמעבדה שלנו, כולל הדגמים החיוביים והשליליים של RABV. שתי המעבדות האחרות. השתמשו בדגימות שלהם כל הדגימות אוחסנו בארכיון ואושרו על ידי ה-FAT בעבר. כל 10 מעבדות השיגו את התוצאות על ידי מקונן RT-PCR ב 100% בהתאם ל-FAT, ללא שלילי או שליליות חיוביות (שולחן 8), המציין כי RT-PCR מקונן היה מגוון גבוה ומהווה הודעה.

רכיבים נפח לתגובה (μL)
dNTPs (2.5 מ"מ) 4
תחל אקראי (50 μM) 1.5
אוליגו (dT) 15 (50 μm) 0.5
מאגר M-MLV (5x) 4
M-MLV הפוכה הטרנסקריפטאז (200 IU/μL) 1
RNasin (40 IU/μL) 1
נפח כולל 12

טבלה 1: ריאגנטים שעתוק הפוכה לסינתזה של דנ א .

רכיבים נפח לתגובה (μL)
dNTPs (10 ממ) 1
לשעבר-Taq (5 U/μL) 0.3
מאגר taq (10x) מיכל 5
N127 (20 μM) 1
N829 (20 μM) 1
dd H2O 39.7
נפח כולל 48

טבלה 2: ריאגנטים מתוך ה-PCR העגול הראשון.

טמפרטורה זמן מחזורי
94 ° c 2 דקות 1
94 ° c שלושים בנות 35
56 ° c שלושים בנות 35
72 ° c 40 ס 35
72 ° c 10 דקות 1
4 ° c

שולחן 3: ג ידבקים פרמטרים של הראשון וכן . PCR בסיבוב השני

רכיבים נפח לתגובה (μL)
dNTPs (10 ממ) 1
לשעבר-Taq (5 U/μL) 0.3
מאגר taq (10x) מיכל 5
N371F (20 μM) 1
N371R (20 μM) 1
dd H2O 39.7
נפח כולל 48

שולחן 4: ריאגנטים מתוך ה-PCR העגול השני.

שם תחל פרטים כיוון רצף (5 '-3 ') מיקום נוקלאוטיד גודל המוצר
N127 הסיבוב הראשון של ה-PCR קדימה מיכל בננוב -19 ~ 0 845bp
N829 הסיבוב הראשון של ה-PCR פוך מיכאל ברקת 807 ~ 825 845bp
N371F הסיבוב השני של ה-PCR קדימה השכרת מאג -6 ~ 15 371bp
N371R הסיבוב השני של ה-PCR פוך מיכל האור 345 ~ 367 371bp

שולחן 5: תחל שוויון ה הראשון וכן בסיבוב השני ה- PCR . בסיסים מנוונת: N (A/T/C/G), K (G/T), R (A/G), Y (C/T), WV (G/A/C).

מיני וירוס ליססביו זן פלאמצע תבנית (מולקולות/μL)
הרב שלמה לייב מ918139.1 קיו 2.24 x 101
מיכל בע 293110.1 האיחוד האירופי 2.24 x 102
מוקדי המבקרים KF 155005.1 2.24 x 101
DUVV 293119.1 האיחוד האירופי 2.24 x 101
EBLV-1 157976.1 EF 2.24 x 101
בלייב-2 KF 155004.1 2.24 x 101
מיכל שהרבני גו 992312.1 2.24 x 100
מיכל בע NC_020809.1 2.24 x 101
מיכל בע NC_025377.1 2.24 x 101
ח'מוב NC_025385.1 2.24 x 103
הרב NC_020808.1 2.24 x 102
שיBV NC_025365.1 2.24 x 101
מיכל בלייב NC_025251.1 2.24 x 101
מיכל הייקוב NC_018629.1 2.24 x 105
מיכל בע NC_031955.1 2.24 x 103
מיכל בלייב NC_031988.1 2.24 x 105
KBLV MF 960865.1 2.24 x 101
שרון בלייב MF 472710.1 2.24 x 101

שולחן 6: מגבלת זיהוי של RT-PCR מקונן o f 18 l yssavirus es.

שיטה סטנדרטית ותוצאה המשך
חיובי
המשך
שלילי
מתאם (%)
שמן חיובי
שלילי
162
3
0
9459
99.07

שולחן 7: קורלציה בין RT-PCR מקונן והשומן בתוך ה זיהוי של ראמול בדגימות קליניות.

Table 8
שולחן 8: תוצאות אימות מקוננות של RT-PCR על-ידי 10 מעבדות.

Figure 1
איור 1 : זיהוי של 18 lyssavirus es על ידי מקונן-PCR (א) התוצאה של ה-PCR העגול הראשון. (ב) תוצאה של ה-PCR העגול השני. M = DL 2000 סימן DNA. מסלולים 1 – 18 = RABV, LBV, מוקדי, DUVV, EBLV-1, EBLV-2, ABLV, ARAV, IKOV, BBLV, GBLV, IRKV, כרוב, לואלין, SHIBV, WCBV, KBLV, ו TWBLV, בהתאמה. ליין 19 = PCR בקרה חיובית; ליין 20 = שליטה שלילית עבור ה-PCR העגול הראשון; ליין 21 = שליטה שלילית עבור ה-PCR העגול השני. תוצאת ה-PCR החיובית מראה להקה ב-845 bp בסיבוב הראשון ו-371 bp ב-PCR העגול השני. אמפליקון של arav אינו נראה בסיבוב הראשון, אבל נראה בסיבוב השני של ה-PCR (ליין 8), בעוד אמפליקון של ikov הוא נראה בסיבוב הראשון, אבל לא נראה בסיבוב השני של ה-pcr (ליין 9). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2 : השוואה עם רצפים פריימר מראה את נוקלאוטידים הדיפרנציאלי באזורים פריימר של 18 lyssavirus מינים. N127 ו N829 היו התחל החיצוני, N371F ו N371R היו התחל הפנימי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כיום, RABV הוא וירוס מרכזי האחראי על כמעט כל כלבת האדם והחיה בסין, כמו גם במדינות אחרות. בנוסף, משתנה IRKV זוהה לראשונה מ- Murina leucogaster במחוז ג'ילין בצפון מזרח סין ב 201210, והיא דווחה כדי לגרום למותו של כלב במחוז ליאונינג ב 201711. לאחרונה, הרומן lyssavirus, TWBLV, זוהה גם מתוך עטלף פיפיסטרלי יפני בטייוואן, סין בשנת 2017. תוצאות אלה מרמזות על גילוי יעיל של lyssaviruses אחרים חשוב גם כדי למנוע את הנפילה של העטלף המועברות lyssaviruses. בהקשר זה, פאן-lyssavirus מקונן RT-PCR מיקוד אזור N הגן השכיח ביותר הוא כלי שימושי מאוד, ואת התוצאות הראו כי זה יכול ביעילות לזהות את כל 16 ICTV מאושר ושני מינים הרומן lyssavirus ירוס זוהה עד כה, כולל מפוצלים גנטית RABVs ו IRKV בסין (נתונים על מאמץ IRKV לא מוצג). עם זאת, מעניין גם לציין כי ARAV זוהה רק על ידי ה-PCR העגול השני התחל, בעוד IKOV זוהה רק על ידי הראשון בסיבוב PCR התחל (איור 1). כדי לחקור את הגורם לפער זה, רצף השוואה של כל 18 lyssaviruses בתוך ארבעה אזורים פריימר נערך, עם התוצאות מראה כי 3 ' הקצה נוקלאוטיד T של פריימר החיצוני N829 ב-PCR העגול הראשון ואת נוקלאוטיד השני T ב 3 ' הקצה של התחל הפנימי N371F ב-PCR העגול השני לא היה זהה למיקומים המתאימים של ARAV (G) ו-IKOV (A) (איור 2). לאחר T של פריימר N829 שונה G של ARAV ו T של פריימר N371F השתנה ל-A של IKOV, שני וירוסים שזוהו בהצלחה ב-PCR (נתונים לא מוצגים). תוצאה זו ממחישה את התפקיד הקריטי של 3 ' סוף או קרוב נוקלאוטידים של התחל בתוך הגברה מוצלחת של אזור היעד.

כדי להעריך את הרגישות ואת הספציפיות של השיטה באיתור וירוס כלבת לאבחון קליני ומעקב, 9,624 בעלי חיים דגימות המוח בדיקות נבדקו ב 10 השנים האחרונות על ידי ה-FAT ו-PCR מקונן במקביל. מבין 165 הדגימות שנבדקו כלבת החיובית על-ידי מקונן RT-PCR, 162 זוהו כחיוביים על-ידי ה-FAT; לפיכך, שתי השיטות מציגות את ההתאמה של 99.07%. Rabvs זוהה אלה 165 דגימות יכול להיות מסווג לתוך ליננים שונים באסיה, הקשורים הארקטי, וקוסמופוליטן clades12,13, המציין כי RT-PCR מקונן יכול לכסות את clades גנטיים שונים של rabvs. שלושה דגימות קליניות מאוד התפורר נבדקו חיובי על ידי מקוננים RT-PCR אבל שלילי על ידי FAT. תוצאה זו מתאימה במיוחד להערכת היעילות בבדיקת שתי דוגמאות מובנות כפי שמוצג בסעיף התוצאות המייצג, ומציינות כי RT-PCR המקונן רגיש יותר מאשר ה-FAT באיתור וירוסים בדגימות מאוד מאוד.

הביצועים של RT-PCR מקוננים אושרה עוד יותר על ידי השתתפות במבחן השוואת המעבדה הבינלאומית (ILCT) מאורגן על ידי המעבדה התייחסות האיחוד האירופי לכלבת בסוכנות הצרפתית למזון, איכות הסביבה ובריאות תעסוקתית & בטיחות ( ANSES) בשנת 2010, שימוש בסדרה של 12 דגימות (אחד כל רביע, EBLV-1, EBLV-2, ו ABLV כפקדים חיוביים, שליטה אחת שלילית, ושבעה דגימות עיוורות). במבחן, מקונן RT-PCR זיהה בהצלחה את כל הווירוסים lyssaviruses a 100% עקביות. בשנת 2018, השיטה אושרה כסטנדרט הלאומי של אבחונים של כלבת (GB/T36789-2018) על ידי הוועדה הלאומית לתקינה טכנית של בעלי חיים בריאות של סין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

המחקר היה נתמך על ידי תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי (גרנט no. 2016YFD0500401) ואת הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (גרנט no. 31302043).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 × TAE Various Various
6 × loading buffer TakaRa 9156
Agarose US Everbright® Inc A-2015-100g
ddH2O Various Various
DL 2,000 Marker Takara 3427A
dNTPs (10 mM) TakaRa 4019
dNTPs (2.5 mM) TakaRa 4030
Electrophoresis System Tanon EPS300
Ex-Taq (5 U/μL) TakaRa RR001
Gel Imaging System UVITEC Fire Reader
Microcentifuge tubes Various Various
M-MLV reverse transcriptase (200 IU/µL) TakaRa 2641A 
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermoscientific ND1000
Oligo (dT)15 TakaRa 3805
PCR Machine BIO-RAD T100
PCR Tubes Various Various
Phusion High-Fidelity DNA Polymearase NEW ENGLAND BioLabs M0530S
Pipettors Various Various
Random Primer TakaRa 3801
RNase Inhibitor (40 IU/µL) TakaRa 2313A
RNase-free ddH2O TakaRa 9102
Taq Buffer (10×) TakaRa 9152A
Tips Various Various
Vortex mixer Various Various

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hemachudha, T., Laothamatas, J., Rupprecht, C. E. Human rabies: a disease of complex neuropathogenetic mechanisms and diagnostic challenges. Lancet Neurology. 1, (2), 101-109 (2002).
  2. Amarasinghe, G. K., Arechiga Ceballos, N. G. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2018. Archives of Virology. 163, (8), 2283-2294 (2018).
  3. Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. M., Kantala, T., Gadd, T. Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland. Transboundary and Emerging Diseases. 65, (3), 593-596 (2018).
  4. Hu, S. C., et al. Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan. Emerging Infectious Diseases. 24, (4), 782-785 (2018).
  5. World Organization for Animal Health (OIE). Chapter 2.1.17 - Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2018. Available from: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.17_RABIES.pdf 2-14 (2018).
  6. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory techniques in rabies. World Health Organization. 74-195 (2018).
  7. Mani, R. S., et al. Utility of real-time Taqman PCR for antemortem and postmortem diagnosis of human rabies. Journal of Medical Virology. 86, (10), 1804-1812 (2014).
  8. Fooks, A. R., et al. Emerging technologies for the detection of rabies virus: challenges and hopes in the 21st century. PLOS Neglected Tropical Diseases. 3, (9), 530 (2009).
  9. Jiang, Y., et al. An outbreak of pig rabies in Hunan province, China. Epidemiology and Infection. 136, (4), 504-508 (2008).
  10. Liu, Y., et al. Analysis of the complete genome of the first Irkut virus isolate from China: comparison across the Lyssavirus genus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 69, (3), 687-693 (2013).
  11. Chen, T., et al. Possible Transmission of Irkut Virus from Dogs to Humans. Biomedical and Environmental Sciences. 31, (2), 146-148 (2018).
  12. Feng, Y., et al. Disease outbreaks caused by steppe-type rabies viruses in China. Epidemiology and Infection. 143, (6), 1287-1291 (2015).
  13. Feng, Y., et al. Livestock rabies outbreaks in Shanxi province, China. Archives of Virology. 161, (10), 2851-2854 (2016).
הערכה של מקונן אוניברסלי הפוכה תגובת שרשרת פולימראז לאיתור של Lyssaviruses
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).More

Wang, Y., Xu, W., Guo, H., Gong, W., He, B., Tu, Z., Tu, C., Feng, Y. Evaluation of a Universal Nested Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction for the Detection of Lyssaviruses. J. Vis. Exp. (147), e59428, doi:10.3791/59428 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter