Summary
Qui, presentiamo un protocollo di eliminazione exon23 basato su Cas9 per ripristinare l'espressione distrofina in iPSC da fibroblasti cutanei derivati da mousemdx Dmd e differenziare direttamente gli iPSC in cellule progenitrici miogenie (MPC) utilizzando il sistema di attivazione Tet-on MyoD.
Abstract
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una grave malattia muscolare progressiva causata da mutazioni nel gene della distrofina, che alla fine porta all'esaurimento delle cellule progenitrici muscolari. L'editing genico a breve area(CRISPR/Cas9) interspaziale regolarmente interspaziale ha il potenziale per ripristinare l'espressione del gene della distrofina. Le cellule progenitrici muscolari derivate da cellule staminali muscolari (MPC) autologhe indotte possono ricostituire il pool di cellule staminali/progenitrici, riparare i danni e prevenire ulteriori complicazioni nella DMD senza causare una risposta immunitaria. In questo studio, introduciamo una combinazione di CRISPR/Cas9 e tecnologie iPSC non integrate per ottenere progenitori muscolari con espressione proteica di distrofina recuperata. In breve, utilizziamo un vettore Sendai non integrato per stabilire una linea iPSC dai fibroblasti dermici dei topimdxi Dmd. Usiamo quindi la strategia di eliminazione CRISPR/Cas9 per ripristinare l'espressione della distrofina attraverso un'unione finale non omologa del gene della distrofina riformulato. Dopo la convalida PCR dell'esaurimento dell'eso23 in tre colonie da 94 colonie iPSC selezionate, differenziamo iPSC in MPC per espressione indotta da Dox (Dox) di MyoD, un fattore chiave di trascrizione che svolge un ruolo significativo nella regolazione della differenziazione muscolare. I nostri risultati mostrano la fattibilità dell'utilizzo della strategia di eliminazione CRISPR/Cas9 per ripristinare l'espressione della distrofina nell'MPC derivato da iPSC, che ha un potenziale significativo per lo sviluppo di future terapie per il trattamento della DMD.
Introduction
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una delle distrofie muscolari più comuni ed è caratterizzata dall'assenza di distrofina, che colpisce 1 di circa 5.000 neonati in tutto il mondo1. La perdita della funzione genica della distrofina si traduce in difetti muscolari strutturali che portano alla degenerazione progressiva delle miofibre1,2. Il sistema di terapia genica mediata da un virus adeno ricombinante (rAAV) è stato testato per ripristinare l'espressione della distrofina e migliorare la funzione muscolare, come la sostituzione genica utilizzando micro-distrofine. Tuttavia, l'approccio rAAV richiede iniezioni ripetute per sostenere l'espressione della proteina funzionale3,4. Pertanto, abbiamo bisogno di una strategia in grado di fornire in modo efficace e permanente l'espressione genica della distrofina nei pazienti con DMD. Il topomdx Dmd, un modello murino per la DMD, ha una mutazione puntiforme nell'esone 23 del gene della distrofina che introduce un codone di terminazione prematura e si traduce in una proteina troncata non funzionale alla mancanza del dominio di legame disproglycan del terminale C. Recenti studi hanno dimostrato l'uso della tecnologia CRISPR/Cas9 per ripristinare l'espressione genica della distrofina mediante una correzione genica accurata o la delezione di esoni mutanti in animali piccoli e grandi5,6,7. Long et al.8 ha riportato il metodo per correggere la mutazione del gene distrofina nella germina murinamdx Dmd mediante la riparazione diretta da omologia (HDR) basata sull'editing del genoma CRISPR/Cas9. El Refaey et al.9 ha riferito che rAAV potrebbe in modo efficiente eccitare l'esone mutante 23 in topi distrofici. In questi studi, i gRNA sono stati progettati negli introni 20 e 23 per causare rotture del DNA a doppio filamento, che hanno parzialmente ripristinato l'espressione della distrofina dopo la riparazione del DNA tramite l'unione finale non omologa (NHEJ). Ancora più eccitante, Amoasii et al.10 hanno recentemente riportato l'efficacia e la fattibilità dell'editing genico CRISPR mediato da rAAV nel ripristino dell'espressione della distrofina nei modelli canini, un passo essenziale nella futura applicazione clinica.
La DMD causa anche disturbi delle cellule staminali11. Per danni muscolari, le cellule staminali muscolari residenziali riforniscono le cellule muscolari morenti dopo la differenziazione muscolare. Tuttavia, i cicli consecutivi di lesioni e riparazione portano ad accorciamento dei telomeri nelle cellule staminali muscolari12, e l'esaurimento prematuro di piscine di cellule staminali13,14. Pertanto, una combinazione di terapia autologa con l'editing del genoma per ripristinare l'espressione della distrofina può essere un approccio pratico per il trattamento della DMD. La tecnologia CRISPR/Cas9 offre la possibilità di generare cellule staminali pluripotenti indotte geneticamente corrette autologie (iPSC) per la rigenerazione muscolare funzionale e prevenire ulteriori complicazioni della DMD senza causare il rigetto immunitario. Tuttavia, gli iPSC hanno un rischio di formazione del tumore, che potrebbe essere alleviato dalla differenziazione dell'iPSC nelle cellule progenitrici miogeniche.
In questo protocollo, descriviamo l'uso del virus Sendai non integrato per riprogrammare i fibroblasti dermici di topimdxi Dmd in iPSC e quindi recuperiamo l'espressione della distrofina con la cancellazione del genoma CRISPR/Cas9. Dopo la convalida della delezione di Exon23 in iPSC mediante genotipizzazione, abbiamo differenziato l'iPSC corretto dal genoma in progenitori miogenici (MPC) tramite la differenziazione miogenica indotta da MyoD.
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Protocol
Tutte le procedure di movimentazione e chirurgia degli animali sono state eseguite da un protocollo approvato dall'Augusta University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). I topi sono stati alimentati dieta standard e acqua al libitum.
1. Isolamento dei fibroblasti di topi primari da topimdx adulti Dmd
- Eutanasia adulto Dmd topimdxi (maschio, 2 mesi) da CO2 asfissia e toracotomia secondo IACUC approvato dal Medical College of Georgia, Università di Augusta. Tagliare la coda con un bisturi sterile in una condizione sterile sotto il cofano laminare. Sciacquare la coda con il 70% di etanolo per 5 min, quindi lavare con sterile fosfato buffersina salina (PBS) in un piatto di 6 cm.
- Sbucciare la pelle della coda da una forte incisione dalla base alla punta della coda lungo la pelle della coda, quindi staccare delicatamente la pelle della coda con una pinzetta. Tritare la pelle a 1 mm3 utilizzando un bisturi sterile e spostare il tessuto cutaneo macinato in un piatto di 6 cm nel mezzo essenziale minimo di Dulbecco/Ham's F12 (DMEM/F12) contenente lo 0,1% collagenase IV e 1 U/mL di dispase.
- Digerire il tessuto cutaneo in un piatto di coltura per 2 h a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 del 5%.
- Coprire una piastra a 6 pozzetti con fibronectina e 0,2% di gelatina (1 mL di fibronectina in 199 mL di gelatina dello 0,2%; Tabella dei materiali) e incubare a 37 gradi centigradi per 1 ora.
- Dissociare il tessuto cutaneo digerito con una punta pipet da 1 mL e trasferire il tessuto e il supernatante in un tubo di centrifuga conico sterile da 15 mL. Centrifuga a 217 x g per 3 min a temperatura ambiente, scartare il super-atante e risospendere il pellet in 1,5 mL di fibroblasto medio (Tabella dei Materiali).
- Cultura i pellet, compreso il tessuto cutaneo incompleto digerito dal punto 1,5 sulla piastra a 6 pozzetti rivestita con fibronectina e 0,2% di gelatina dal punto 1,4 in un'incubatrice di 37 gradi centigradi, 5% di CO2. Sostituire il mezzo 24 h dopo la placcatura iniziale per rimuovere le celle non attaccate e modificare il mezzo ogni 48 h.
2. Riprogrammazione dei fibroblasti cutanei dei topi in iPSC
- Due giorni prima della trasduzione, i fibroblasti dermici del topo digerito dal punto 1.6 con la soluzione di distacco cellulare (Tabella dei materiali) in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidizzata del 5% di CO2 per 5 min.
- Contare le cellule usando un emacytometro e centrifugare a 217 x g per 3 min.
- Le cellule di semi ad una densità di 1x2 x 105 cellule per pozzo su una piastra e coltura di 6 pozzetti con fibroblasto medio (Tabella dei materiali) in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidificata del 5% di CO2.
- Il giorno della trasduzione (giorno 0), stimare le cellule e calcolare il volume di ogni virus necessario per raggiungere la molteplicità bersaglio di infezione (MOI) di 5, 5 e 3 (ad es. KOS MOI - 5, hc-Myc MOI - 5, hKlf4 MOI - 3) secondo il manuale commerciale.
- Scongelare tre tubi Sendai in un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi per 5x10 s e aggiungere i volumi calcolati di ciascuno dei tre tubi Sendai a 1 mL di mezzo fibroblasto (Tabella dei Materiali).
- Rimuovere il supporto fibroblasto dal passaggio 2.3 e aggiungere la miscela di virus di riprogrammazione ai pozze contenenti le cellule. Incubare le cellule durante la notte in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidizzata del 5% di CO2.
- Sostituire il mezzo con fibroblasto fresco medio 24 h dopo la trasduzione. Coltura le cellule per una settimana con scambio medio a giorni alterni.
- Raccogliere i fibroblasti di topo infetti il giorno 7 dopo la trasduzione con 0.05% trypsin / EDTA e posizionare su piatti che sono precedentemente rivestiti con fibronectina e 0.2% gelatina.
- Cultura i fibroblasti di topo infetti dal passo 2.6 con mezzo di crescita completo delle cellule staminali embrionali del topo (ES) (Tabella dei materiali) in un incubatore di 37 C con un'atmosfera umidificata del 5% di CO2 e cambiare media quotidiana.
- Dall'ottavo giorno, osservare la piastra al microscopio invertito ogni due giorni per identificare la comparsa di grumi cellulari con la morfologia del topo ES.
3. Utilizzo di fosfopfoplasmasi dal vivo macchia e citometria di flusso per quantificare l'efficienza di riprogrammazione
- Rimuovere i supporti di coltura da ogni pozzo e risciacquare con DMEM/F-12 per 2/3 min.
- Applicare 2 mL di 1x soluzione di lavoro con macchie alcaline (AP) (1:500 diluizione in DMEM/F-12) alle cellule aderenti e incubare in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidificata del 5% CO2 per 30 min.
- Aspirati la macchia live AP e lavate due volte con PBS per 5 min ciascuno.
- Digerire le cellule con la soluzione di distacco cellulare (Tabella dei materiali) in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidificata del 5% di CO2 per 5 min. Eseguire la citometria di flusso per determinare l'efficienza di riprogrammazione.
4. Selezione e raccolta di cellule simili a ES
- Esaminare le colonie dal punto 2.8 al microscopio invertito.
- Contrassegnare le colonie nella parte inferiore del piatto con un marcatore di oggetto auto-input.
- Applicare anelli di clonazione ingrassati per coprire le colonie cellulari marcate. Aggiungete 100 l di 0,05% di trypsin/EDTA ad ogni anello di clonazione a 37 gradi centigradi per 5 minuti, quindi trasferite le celle digerite con 100 punte di pipetta a 48 vacille contenenti mezzo di crescita mES.
- Incubare le cellule in lastre di coltura di 48 pozzi in un'incubatrice di 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidizzata del 5% di CO2. Passare le cellule a piatto 6 cm quando raggiungono 70% confluenza.
- Ripetere i passaggi 4.3 e 4.4 per più volte fino a ottenere cloni uniformi a forma di dormitorio.
5. Congelamento degli iPSC per la crioconservazione
- Dissociare gli iPSC selezionati dal passaggio 4.5 con trypsin, versene e plasma per pulcini (TVP; Tabella dei materiali) a 37 gradi centigradi in un'incubatrice di CO2 del 5% per 30 min.
- Raccogliere le cellule in un tubo conico sterile da 15 mL e centrifugare a 217 x g per 3 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il supernatante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 2 mL di mouse ES congelato medio (Tabella dei materiali) per ottenere 1 mL per crioviale.
- Aggiungere le cellule ai criovial e congelare utilizzando un contenitore di congelatore che fornisca il tasso di raffreddamento critico e ripetuto -1/min necessario per la crioconservazione a -80 gradi durante la notte.
- Trasferire le fiale congelate in un serbatoio di azoto liquido.
6. Colorazione dell'immunofluorescenza per marcatori di cellule staminali negli iPSC
- IPSC di semi da passo 5.1 coltivato con mezzo mES in uno scivolo a 8 camere rivestito con poli-D-lysine/laminina (Tabella dei materiali) alla densità appropriata per raggiungere tra 1/2 x 10 4cellule per bene e incubare in un incubatore di 37 umidificata del 5% di CO2 per 48 h.
- Immergere i vetrini nel 4% di formaldeide per 15 min a temperatura ambiente, quindi immergere i vetrini in PBS due volte per 5 min ogni volta.
- Incubare sezioni con un reagente di blocco IgG del topo (Tabella dei materiali)e il siero di capra del 5% per 1 h a temperatura ambiente.
- Diluire gli anticorpi primari nel diluente proteico (topo anti-SSEA1, 1:100, coniglio-anti-Nanog, 1:500; coniglio-anti-POU classe 5 omeobox 1 [OCT4], 1:500; coniglio-anti-SRY-box 2 [SOX2], 1:500; coniglio-anti-Lin-28 homolog A [Lin28A], 1:400) ( Tabella della tabella della tabella della tabelladella Materiali). Applicare anticorpi sulle cellule e incubare a 4 gradi centigradi durante la notte in una camera umidificata.
- Eliminare la soluzione anticorpale primaria e lavare i vetrini 3x in PBS.
- Applicare i secondi anticorpi (anticorpo di capra-anti-tono coniugato Alexa488 e capra coniugata ad Alexa555 a temperatura ambiente, 1:400 ciascuno) in diluente proteico M.O.M. sui vetrini e incubare per 45 min a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini 3x in PBS e montare le sezioni con supporto di montaggio contenente 4'6-diamidino-2-fenylindole (DAPI).
- Scattare foto con un microscopio confocale.
7. Indagare sulla pluripotenza degli iPSC in vivo
- Dissociare gli iPSC dal passo 5.1 in singole cellule utilizzando la soluzione TVP in un incubatore a 37 gradi centigradi con un'atmosfera umidizzata del 5% di CO2 per 30 min.
- Contare le cellule usando un emacytometro e centrifugare a 217 x g per 3 min.
- Aspirare il supernatante e risospendere il pellet con mezzo mES in un tubo di centrifugazione sterile da 1,5 ml ad una concentrazione di 5 x 105 cellule/30 L per il trapianto di cellule.
- Rimuovere i capelli da entrambi gli arti posteriori dei topi immunodeficienti utilizzando tagliacapelli.
- Anestesizzare i topi con chetamina (100 mg/kg) e pulire il sito di iniezione con il 75% di alcol.
- Iniettare 30 l di sospensione iPSC dal punto 7.3 intramuscolare nel gastrocnemii, utilizzando un ago da 31 G.
- Due settimane dopo l'iniezione, raccogliere i gastrocnemii del topo e incorporare in composto di temperatura di taglio ottimale (OCT), scattare congelare e tagliare in 5-m sezioni15,16.
- Fissare le sezioni in formaldeide 4% per 15 min a temperatura ambiente, e poi lavare i vetrini due volte in PBS per 5 min ogni volta.
- Bloccare le cellule con 5% diluente proteico del siero di capra per 1 h a temperatura ambiente.
- Aggiungere anticorpo primario diluito (coniglio anti-AFP, 1:50; coniglio anti-SMA, 1:50; coniglio anti-TH, 1:50) agli scivoli e incubare a 4 gradi durante la notte in una camera umida.
- Eliminare la soluzione anticorpale primaria, lavare le cellule 3x (5 min/wash) in PBS, aggiungere un anticorpo di 1:400 Alexa555-coniugato capra-anti-coniglio a vetrini, e incubare per 45 min a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini 3x (5 min/lavaggio) in PBS e montare le sezioni con il supporto di montaggio contenente DAPI.
8. Costruzione di introni vettoriali lentivirali CRISPR/Cas9 che fiancheggiano la distrofina 23
- Progetta due coppie di oligogno gRNA che prendono di mira la distrofina ditrontrophina fiancheggiata da introni 23 tramite http://crispor.tefor.net/crispor.py.
NOTA: Le coppie progettate sono le seguenti:
i22sense: 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAATCAA- 3'
i22anti-sense: 5'-AAACTTGATTTTACCTAGCTTAAC-3'
i23sense: 5'-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT- 3'
i23anti-sense: 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3'). - Digest e dephosphorylate 5 g di plasmide di CRISPR lentivirale (lenti-CRISPRv2-blast [un regalo di Mohan Babu] e lenti-Guide-Hygro-iRFP670 [un regalo di Kristen Brennand]) (Tabella dei materiali)con BsmB1/Esp3I per 30 min a 37 gradi centigradi. Per 5 g di plasmidi, aggiungere 3 -L l di BsmB1 limitare l'enzima, 3 -L di fosforo veloce, 6 -L di 10x buffer di digerimento dell'enzima e 0,6 di 100 mM DTT in reazione 60 .
- Caricare le reazioni su un gel di agarose dello 0,8%. Eseguire il gel a 100-150 V per 30 min.
- Purificare il plasmide digerito in gel utilizzando un kit di estrazione gel (Tabella dei materiali) ed eluire in 20 .L di H2O.
- Fosforolate e anneal ogni coppia di oligonucleotidi gRNA contenenti 1 L di ogni oligonucleotide a 100 m, 1 L di 10 x T4 tampone di ligazione, 0,5 L di T4 polynucleonucleotide kinase (PNK), 6,5 l di ddH2O a 37 gradi centigradi per 30 min, e poi 95 Gradi C per 5 min e quindi rampa d.c. a 25 gradi centigradi a 5 gradi centigradi/min.
- Ligate una diluizione 1:200 degli oligonucleotidi gRNA annessi nell'abbondanteCRISPR V2-Blast o plentiGuide-Hygro-iRFP670. Mescolare 50 ng di vettori digeriti BsmB1/Esp3I, con 1 L di oligo duplex diluito e 5 l una di tampone da 2x ligase più 1 L di ligase in un sistema di reazione a 11 gradi e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
- Eseguire la trasformazione con 3 -L di prodotto di ligazione in 50 celle competenti (Tabella dei materiali) secondo le istruzioni del produttore.
- Stendere le celle competenti trasformate in una piastra di agar con 100 g/mL di carbenicillina e incubare a 31,5 gradi centigradi per 18 ore.
- Raccogliere colonie con 10 punte sterili e coltura in 5 mL di brodo formidabile (Table of Materials) contenenti 100 carbenicillina s/mL a 31,5 gradi centigradi, 185 rpm in un'incubatrice di shaker per 21 h.
- Purificare il DNA plasmide utilizzando i kit mini-prep e midi-prep (Tabella dei materiali).
- Verificare i plasmidi mini-prep per digestione di restrizione. Per il sistema di reazione a 20 ,l, aggiungere 1 g di DNA plasmide, 2 ll di buffer di reazione del digest (Tabella dei materiali) e 1 l di miscela enzimatica di restrizione (0,5 L di KpnI-HF e 0,5L di AgeI-HF per implentiR - V2-Blast-i22; 0,5 . ablentiGuide-Hygro- iRFP670- i23). Incubare il sistema di reazione per 1 h a 37 .
- Caricare le reazioni su un gel di agarose dello 0,8%. Eseguire il gel a 100-150 V per 30 min.
NOTA: le bande corrette per l'ablentiCRISPR V2-Blast-i22 devono essere 622 bp e 12,2 kb e le bande corrette per plentiguide-Hygro- iRFP670- i23 devono essere 2,6 kb e 7,1 kb.
9. Imballaggio vettoriale Lentivirale
- Coltura 7 x 105 293FT cellule in 5 mL di supporti DMEM contenenti 10% siero bovino fetale in un piatto di 6 cm durante la notte a 37 gradi Centigradi, 5% CO2.
- Preparare un cocktail (1 g di plasmide di confezionamento plentirCRISPR V2-Blast-i22 o lentiguida-Hygro-iRFP670-i23, 750 ng di plasmide di imballaggio psPAX2, 250 ng di pMD2.G invilupmida di busta di pMD2.G e 5 -L di reagente di trasfezione A [Tabella dei materiali] in 100 - L di supporto MEM ridotto del siero).
- Preparare una miscela di 5 -L di reagente di trasfezione B (Tabella dei materiali) in 100 -L di supporto MEM ridotto.
- Aggiungete 100 l di miscela di reagente di trasfezione B alla miscela di plasmide dal punto 9.2 e incubate per 5 min a temperatura ambiente.
- Aggiungere il complesso DNA-lipidico (dal punto 9.4) dropwise alle cellule 293FT. Incubare pernottamento a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
- Aggiungere potenziatore di produzione di virus (500x) (Tabella dei materiali) ad ogni piatto il giorno successivo e incubare per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
- Raccogliere il mezzo dalle cellule utilizzando pipette nei due giorni successivi e filtrare il mezzo attraverso un filtro 0,45 m per rimuovere le cellule.
10. Concentrazione e purificazione dei vettori lentivirali
- Vettore lentivirale precipitare nel mezzo della fase 9,7 durante la notte a 4 gradi centigradi con 5x di polietilene glicole 4000 (PEG4000, 8,5% concentrazione finale) e 4 M NaCl (concentrazione finale 0,4 M).
- Centrifugare il supporto virale contenente la soluzione PEG4000 a 2.095 x g e 4 gradi centigradi per 30 min, rimuovere e scartare il supernatante.
- Risospendere i pellet con 500 l di siero ridotto MEM media (lentivirus titro: lenti-CRISPR V2-gRNAi22: 1.56 x 108, lenti-iRFP670-gRNAi23: 1.3 x 10 8 , lenti-CRISPR V2-controllo: 3.13 x 107, lenti-iRFP670-control: 5.3 x 10x10.5 ). Conservare a -80 gradi centigradi fino all'uso.
11. Cancellazione di exon 23 in iPSC mouse con due RNA guida (gRNA) accoppiati con Cas9
- Piattare gli iPSC del topo dal punto 4.5 in una piastra da 24 pozzetti rivestita con fibronectina e gelatina.
- Dopo che le cellule raggiungono il 50% di confluenza, passare al mezzo di coltura fresco (mezzo di crescita delle cellule staminali embrionali del topo completo) contenente 8 polibreni/ml).
- Aggiungere 100 l della soluzione di particella lentivirale dal punto 10.3 tra cui lenti-CRISPR V2-gRNAi22, lenti-iRFP670-gRNAi23 e il controllo (vettore vuoto: lenti-CRISPR V2, lenti-iRFP670) agli iPSCs del mouse. Incubare le cellule per 3 giorni a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
- Selezionare le cellule infettate in modo stabile con supporti contenenti 2,5 g/mL di blasticidin e 100 sg/mL di igromycin B determinando la concentrazione minima di blasticidin e igromycinB necessaria per uccidere la cellula non infetta.
NOTA: Le cellule non infettate sarebbero stati uccisi da blasticidin e igromycina B. - Digerire gli iPSC del mouse selezionati con 0,5 mL di soluzione TVP ogni pozzo (piastra 24-pozzetti) e incubare le cellule per 30 min a 37 s con 5% DI CO2.
- Dissociare gli iPSC in singole celle con il pipettaggio, contare le celle con una camera di conteggio delle celle e quindi diluire circa 150 cellule singole digerite con mezzo mES in piatto 10 cm per la coltura a 37 s C con 5% CO2.
- Dopo circa 10 giorni, scegli le singole colonie sotto un microscopio invertito usando 10 punte sterili pipette (è necessario raccogliere 96 colonie).
- Trasferire le colonie raccolte in 50 .
- Incubare in un'incubatrice di CO2 a 37 s al 70% di confluente.
12. Identificazione delle colonie iPSC con delezione di exon23
- Rimuovere il mezzo in 96-bene piastra quando le colonie cellulari raggiungono 70% confluenza.
- Aggiungete a ciascun pozzo 25 lun di reagente di lisi (Tabella dei materiali) contenente la soluzione proteinaK (1 mL di proteinasi K in 100 mL di reagente di lisi) e trasferite il lisa toaritmo a una piastra PCR da 96 pozze.
- Sigillare la piastra PCR e incubare le piastre a 55 gradi centigradi per 30 min, e poi a 95 gradi centigradi per 45 min per lasile delle cellule e denaturare la proteinasi K.
- Eseguire la reazione PCR con 2 lunati dal punto 12.3. Per la reazione di 20 -L PCR, aggiungere 2 L di lisato, 10 l di 2x prediglie di polimerasi di DNA (Tabella dei materiali), 7 L di acqua senza DNase e 1 L di dMD eson 23 primer(tabella 1).
- Utilizzare i seguenti parametri per la reazione PCR: 98 gradi centigradi per 1 min, 35 cicli di 98 gradi centigradi per 10 s, 60 gradi centigradi per 15 s, 72 gradi centigradi per 30 s e un'estensione finale a 72 gradi centigradi per 1 min.
- Caricare la reazione PCR su un gel di agarose del 2%. Eseguire il gel a 100-150 V per 30 min.
- Ispezionare il gel sotto la luce UV (l'efficienza del knockout è 3/94).
13. Utilizzo del sistema di attivazione Tet-on MyoD per differenziare direttamente iPSC in cellule progenitrici miogeni (MPC)
- Confeziona il mouse LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 e LV-TRE-VP16 MyoD-T2A-dsRedExpress2 (un regalo di Charles Gersbach) (Tabella dei materiali) come descritto in precedenza per i vettori lenti-CRISPRv2-blast e lenti-gRNA-iRFP670 nelle sezioni 9 e 10.
- Infettare il topo iPSC con lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 o lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 come descritto in precedenza per i vettori lentiRv2-blast e lenti-gRNA-iRFP670 nei passaggi 11.
- Selezionare le cellule con 1 g/mL puromycin dopo tre giorni di infezione per ottenere una popolazione di cellule trasdotte pure.
- Aggiungere 3 doxycycline di g/mL nei supporti di coltura (10% FBS DMEM) alla differenziazione MPC. Sostituire il mezzo fresco integrato con doxycycline ogni due giorni.
14. Trascrizione quantitativa inversa PCR per la valutazione della differenziazione muscolare dinamica e l'espressione DMD exon 22-24
- Estrarre l'RNA cellulare dopo 0, 3, 6 e 10 giorni dopo il trattamento della doxycycline utilizzando il reagente di isolamento dell'RNA, trascrivere in modo inverso l'RNA in cDNA utilizzando il primo kit di sintesi cDNA filamento (Tabella dei materiali).
- Per il sistema di reazione a 20 gradi lqPCR, aggiungere 1 ll di cDNA, 10 L di buffer di reazione PCR (Tabella dei materiali), 8 L di DNA H2O e 1 -L di miscela di primer avanti e indietro (dehydrogenase di gliceralde-3-fosfato [GAPDH], muscolo scheletrico [ACTA1], OCT4 e DMD exon22, DMD exon23 e DMD exon24, vedere tabella 1).
- Utilizzare i seguenti parametri per la reazione PCR: 50 gradi centigradi per 2 min, 95 s per 2 min, 40 cicli di 95 s per 15 s, 60 gradi centigradi per 1 min, fondere la curva da 65,0 c a 95,0 gradi centigradi, incrementare 0,5 gradi centigradi.
15. Colorazione immunofluorescenza della minosina della catena pesante 2 (MYH2) e dell'espressione proteica della distrofina
- Cellule modificate da una piastra doxycycline, indotta da lenti-TRE-MyoD, dal passo 13.4 su scivolamo di coltura a 8 vetrini.
- Fissare le cellule in 4% formaldeide per 15 min a temperatura ambiente, e poi lavare i vetrini due volte in PBS per 5 min ogni volta.
- Bloccare le cellule con 5% diluente proteico del siero di capra per 1 h a temperatura ambiente.
- Aggiungere l'anticorpo coniglio-anti-distrofina (1:300) e l'anticorpo topo-anti-MYH2 (1:100) ai vetrini, incubare a 4 gradi durante la notte in una camera umida.
- Eliminare la soluzione anticorpale primaria, lavare le cellule 3x (5 min/wash) in PBS, aggiungere 1:400 anticorpi risposati Alexa488 capra-anti-coniglio e anticorpo di capra-anti-tono coniugato Alexa555 e incubare per 45 min a temperatura ambiente.
- Lavare i vetrini 3x (5 min/wash) in PBS e montare le sezioni con supporto di montaggio contenente DAPI.
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Representative Results
Istituzione di fibroblasti cutaneimdx Dmd derivati iPSC. Abbiamo dimostrato l'efficienza della generazione di iPSC del mouse da topimdx Dmd che derivano dal fibroblasto cutaneo utilizzando i vettori di riprogrammazione senza integrazione. La figura 1A ha dimostrato che la comparsa di colonie simili a cellule staminali embrionali (ESC) a tre settimane dall'infezione. Valutiamo l'efficienza dell'induzione iPSC con macchie di fosfofosate alcalina (AP); La figura 1B mostra che la percentuale di cellule a base di valori positivi rispetto all'AP è stata di circa l'1,8% mediante l'analisi FACS. SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 e SOX2, marcatori di pluripotenza per cellule staminali embrionali di topo, sono stati positivi per le colonie di iPSC per colorazione immunofluorescente, (Figura 1C). Per studiare la differenziazione dei tre germinali degli iPSC in vivo, abbiamo iniettato per via intramuscolare gli iPSC nei gastrocnemii del topo. Abbiamo osservato che gli iPSC iniettati si differenziavano nelle cellule del fegato (endoderm), nelle cellule muscolari lisce (mesoderm) e nelle cellule del neurone adrenergico (ectoderm) (Figura 1D), indicando la pluripotenza degli iPSC.
Eliminazione esun23 mediata da CRISPR/Cas9. Abbiamo progettato due RNA guida che fiancheggiano l'esone mutante 23. Dopo che le interruzioni a doppio filamento mediate da Cas9 (DSB) e l'unione finale non omologa (NHEJ), l'exon 23 del tipo (Eson 23) è stato eliminato, consentendo una produzione di distrofina troncata ma funzionale (Figura 2A). Per identificare l'esone 23 eliminato mouse iPSC, le cellule sono state scarsamente seminate, e le singole colonie sono state raccolte e propagate. I DNA genomici estratti da queste colonie sono stati sottoposti a genotipizzazione PCR. La figura 2B ha dimostrato che la colonia #1 e #2 hanno 23 delezioni che indicano una delezione corretta dell'esone 23.
Differenziare gli iPSC del topo in un lignaggio miogenico e ripristinare l'espressione della distrofina. Usiamo un sistema di espressione MyoD inducibile da tetraciclina per indurre la differenziazione miogenica degli iPSC. La doxyciclina è stata utilizzata per indurre l'espressione MyoD negli iPSC. Figura 3A mostra il corso temporale di differenziazione muscolare in iPSC trattati con Dox. qRT-PCR ha mostrato che il livello di mRNA dell'OCT4, un marcatore pluripotente, è gradualmente diminuito, mentre l'espressione di ACTA1, un marcatore muscolare scheletrico, è aumentato dopo l'induzione di Dox. Inoltre, abbiamo osservato la formazione di miotubi due settimane dopo il trattamento Dox (Figura 3B). È importante sottolineare che il test qRT-PCR ha mostrato il recupero dell'espressione mRNA DMD exon 24 in Dox-indotto, mediato da Cas9 Exon23 rispetto alla linea di controllo Cas9 (Figura 3C). Incoerente con qRT-PCR, la colorazione immunofluorescente mostra l'espressione della proteina distrofina nelle cellule cancellate di Cas9 esone 23, mentre l'espressione della distrofina era assente nelle cellule di controllo (Figura 3D).
Figura 1: Riprogrammazione dei fibroblasti cutanei da topimdx Dmd in iPSC.
(A) Immagine rappresentativa delle colonie simili a un ES (barra di scala : 200 m). (B) Analisi FACS dell'efficienza di riprogrammazione dei fibroblasti cutanei del topo in iPSC dopo 8 giorni di trasduzione del virus Sendai mediante colorazione AP viva. (C) Colorazione immunofluorescente di SSEA1, Lin28, Nanog, Oct4 e SOX2 in iPSC (barra di scala : 50 m). (D) Colorazione immunofluorescente per AFP (endoderm), SMA (mesoderm) e idrolasi tirosina (TH) (ectoderm) di teratoma 2 settimane dopo l'iniezione di iPSC in gastrocnemii (barra di scala n. 20 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: eliminazione esone23 mediata da CRISPR/Cas9.
(A) Diagramma schematico delle eliminazioni di esone 23 mediate da CRISPR/Cas9. La nucleasi Cas9 punta intron 22 e intron 23 da due gRNA. Le rotture a doppio filamento (DSB) di Cas9 provocano l'escissione dell'esone mutante 23. Le estremità distese sono riparate da un'estremità non omologa (NHEJ), con conseguente ripristino del frame di lettura del gene della distrofina. (B) Analisi della genotipizzazione PCR dell'esone 23. La freccia indica il prodotto PCR di exon 23. GAPDH funge da riferimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Differenziare gli iPSC del topo nel lignaggio miogenico e ripristinare l'espressione della distrofina.
(A) qRT-PCR ha mostrato il decorso temporale del livello di mRNA di Oct4 e ACTA1 in Eson 23-deletedDmd mdx iPSC (P < 0.05 vs D0, D6, D10, #P < 0.05 vs D0, D3, D10, $P < 0.05 vs D0, D3, D6, n - 4 per Oct4) (P < 0,05 vs D6 e D10 , #P < 0,05 vs D0, D3 e D10, $P < 0,05 vs D0, D3 e D6, n - 3 per ACTA1). (B) A sinistra: Immagine rappresentativa della formazione del miotubo da iPSC del mouse indotto da Dox (barra di scala : 200 m). A destra: Analisi immunofluorescente di MYH2 nella formazione di miotubi da iPSC del topo indotta da Dox (barra di scala : 20 m). (C) Superiore: le posizioni dei primer PCR per DMD Exon22, Exon23 ed Exon24; In basso: analisi qRT-PCR del livello mRNA dell'espressione DMD Exon22, Exon23 ed Exon24 in MPC (Sezione ) e espressione di (D) Analisi immunofluorescente dell'espressione della distrofina nell'MPC indotto da Dox da iPSCCas9-Ctrl e iPSCCas9-gRNA (barra di scala - 50 m). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Guida primer | |
| i22 senso | 5'-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA- 3' |
| i22 antisense | 5'-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3' |
| i23 senso | 5'-CACCGAGTAGTGTCTCATACCTCT- 3' |
| I23 antisenso | 5'-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3' |
| Primer PCR | |
| OCT4-Inoltro | 5'-AGCTGCTGAAGCAGAAGAGATCA-3' |
| Oct4-Inverti | 5'-TCTCATTGTTGGCTCTCCTCCA-3' |
| ACTA1-Avanti | 5'-GATCCATACCACCTACAAC-3' |
| ACTA1 -Reverse | 5'-TCAGCGATACCAGGGTACAT-3' |
| Eon22-Avanti | 5'-TTACCACCAATGCTATCA-3' |
| Exon22-Reverse | 5'-CCGAGTCTCTCCTCCATTTTC-3' |
| Eon23-Avanti | 5'-CCAAGAAAGCACCTCAGAAATATG-3' |
| Exon23-Reverse | 5'-TTGGCGCTTTTCCACCA-3' |
| Eon24-Avanti | 5'-AAC CTT ACA GAA ATG GAT GGC-3' |
| Exon24-Reverse | 5'-TTTCAGGATTTTCAGCATCCC-3' |
| GAPDH-Avanti | 5'-TGACAAGCTCTCTCTCTCTCG-3' |
| GAPDH-Reverse | 5'-CCCTTCATTACCTCAACTACAT-3' |
Tabella 1: sequenza di primer.
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Discussion
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è una malattia ereditaria distruttiva e in definitiva fatale caratterizzata da una mancanza di distrofina, che porta ad un'atrofia muscolare progressiva1,2. I nostri risultati dimostrano l'espressione genica distrofina ripristinata nelle cellule progenitrici miogenie derivate da Dmdmdx iPSC dall'approccio della delezione di eon23 mediata da CRISPR/Cas9. Questo approccio presenta tre vantaggi.
In primo luogo, abbiamo generato iPSC da fibroblasti dermici derivati da mousemdx Dmd utilizzando un vettore di RNA non integrato. Sono stati sviluppati diversi metodi per generare iPSC, come i vettori lentivirali e retrovirali, che si integreranno nei cromosomi ospiti per esprimere geni di riprogrammazione, sopportando così problemi di sicurezza. Vettori basati sul DNA come vettori plasmici, virus adeno-associati e adenovirus esistono in modo non integrato; tuttavia, possono ancora integrarsi nel cromosoma ospite a bassa frequenza. In questo studio, abbiamo usato un virus Sendai modificato e non trasmissibile, un vettore di RNA non integrato, per fornire in modo sicuro ed efficace i fattori di trascrizione delle cellule staminali ai fibroblasti per la riprogrammazione.
Successivamente, utilizziamo la delezione del genoma mediata da CRISPR, piuttosto che la correzione genica di precisione mediata da CRISPR/Cas9, per ripristinare l'espressione della distrofina negli iPSC. Questo metodo è fattibile ed efficiente; è facile progettare più gRNA per eliminare più esoni mutanti, che si verificano in molti pazienti d'AIDS umani17. Exon eliminazione utilizza un relativamente efficiente percorso di giunzione finale non omologa, e il metodo evita anche la necessità di fornire un modello di riparazione del DNA. Pertanto, rispetto alla correzione di precisione mediata da Cas9, la delezione degli esoni mediata da Cas9 è adatta per i pazienti affetti da DMD con mutazioni genetiche multiple.
Infine, abbiamo indotto iPSC indifferenziati in cellule progeniche miogeniche, che possono ridurre il rischio di tumorigenesi causata da iPSC. In questo protocollo, abbiamo indotto l'espressione MyoD tramite un sistema vettoriale inducibile regolato da tetraciclina (Tet-On) per differenziare gli iPSC in progenitori muscolari scheletrici18,19.
In conclusione, la combinazione dell'editing del genoma CRISPR/Cas9 con il sistema di attivazione MyoD Tet-on può fornire una strategia sicura, fattibile ed efficiente per la delezione mutata di DMD-Exon23 nelle cellule staminali per il trapianto di cellule in pazienti affetti da DMD.
Per selezionare e raccogliere le cellule eS in modo efficiente, dovremmo identificare le cellule iPSC indifferenziate attraverso la loro morfologia a cupola, e un marcatore di oggetto che indica l'input penna può aiutarci a etichettare i singoli cloni dal fondo del piatto di coltura con un cerchio di 1,8 mm intorno all'iPSC Cloni. Per evitare perdite di soluzione trypsin, abbiamo bisogno di applicare il grasso in modo uniforme sul fondo degli anelli. Inoltre, dopo aver posizionato gli anelli rivestiti di grasso sulla parte superiore delle colonie cellulari etichettate, è necessario fare attenzione a non toccare gli anelli. In caso contrario, i cloni iPSC verranno scollegati.
Il protocollo ha i suoi limiti; per esempio, abbiamo scelto un sistema vettoriale RNA non integrato per generare iPSC. Tuttavia, abbiamo utilizzato un sistema lentivirale CRISPR/Cas9 per eliminare la DMD exon 23 e un sistema di attivazione MyoD basato sulla lentivirale per indurre la differenziazione miogenica iPSC; questi vettori lentivirali integrativi hanno problemi di sicurezza. Tuttavia, questi problemi possono essere risolti mediante l'applicazione di un complesso di ribonucleoproteina (RNP) che comprende un ricombinante, ad alta purezza S. pyogenes Cas9 nuclease con un crRNA:tracrRNA duplex; possiamo scegliere la trasfezione di mRNA MyoD modificata chimicamente per differenziare direttamente gli iPSC in progenitori miogenici, anche se l'efficienza può essere difficile.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Tang e Weintraub sono stati parzialmente supportati da NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
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