Summary
ここでは、Dmdmdxマウス由来皮膚線維芽細胞からiPSC中のジストロフィン発現を復元し、Tet-on MyoD活性化システムを用いてiPSCを筋原性前駆細胞(MPC)に直接分化させるCas9ベースのexon23欠失プロトコルを提示する。
Abstract
デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、ジストロフィン遺伝子の突然変異によって引き起こされる重度の進行性筋疾患であり、最終的には筋前駆細胞の枯渇につながる。クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリドロミックリピート/CRISPR関連9(CRISPR/Cas9)遺伝子編集は、ジストロフィン遺伝子の発現を回復させる可能性を有する。自家誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋肉前駆細胞(MPC)は、幹/前駆細胞プールを補充し、損傷を修復し、免疫応答を引き起こさずにDMDのさらなる合併症を防ぐことができます。本研究では、CRISPR/Cas9と非統合iPSC技術を組み合わせて、回復したジストロフィンタンパク質発現を持つ筋肉前駆体を得ることを紹介する。簡単に言えば、非積分センダイベクターを用いて、Dmdmdxマウスの真皮線維芽細胞からiPSCラインを確立する。次に、CRISPR/Cas9欠失戦略を使用して、再フレームされたジストロフィン遺伝子の非相同末結合を通じてジストロフィン発現を回復させます。94個のピックiPSCコロニーから3つのコロニーにおけるexon23枯渇のPCR検証後、筋分化の調節に重要な役割を果たす重要な転写因子であるMoDのドキシサイクリン(Dox)誘導発現により、iPSCをMPCに分化する。我々の結果は、DMD治療のための将来の治療法を開発する上で大きな可能性を有するiPSC由来MPCにおけるジストロフィン発現を回復させるためにCRISPR/Cas9欠失戦略を用いることを可能にすることを示した。
Introduction
デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、最も一般的な筋ジストロフィーの一つであり、ジストロフィンの不在によって特徴付けられており、世界中の約5,000人の新生児の1人に影響を与える。ジストロフィン遺伝子機能の喪失は、進行性筋線維変性1、2につながる構造的な筋肉欠損をもたらす。組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)媒介遺伝子治療システムは、ジストロフィン発現を回復させ、マイクロジストロフィン(μ-Dys)を用いて遺伝子置換などの筋肉機能を改善するために試験された。しかしながら、rAAVアプローチは、機能性タンパク質3、4の発現を維持するために繰り返し注射を必要とする。したがって、DMD患者においてジストロフィン遺伝子発現を効果的かつ永続的に回復できる戦略が必要である。DMDのマウスモデルであるDmdmdxマウスは、早期終了コドンを導入するジストロフィン遺伝子のエキソン23に点変異を有し、C末端ジストログリカン結合ドメインを欠く非機能的切り捨てタンパク質をもたらす。最近の研究は、小・大型動物5、6、7における正確な遺伝子矯正または変異性エキソン欠失によるジストロフィン遺伝子発現を回復させるCRISPR/Cas9技術の使用を実証した。Long et al.8は、相同性修復(HDR)ベースのCRISPR/Cas9ゲノム編集によりDmdmdxマウス生殖細胞系におけるジストロフィン遺伝子変異を修正する方法を報告した。El Refaey et al.9は、rAAVがジストロフィーマウスで変異型エキソン23を効率的に排除できると報告した。これらの研究では、gRNAは、非相同末端接合(NHEJ)を介してDNA修復後にジストロフィン発現を部分的に回復させた二本鎖DNA切断を引き起こすために、イントロン20および23で設計された。さらにエキサイティングな、Amoasii et al.10は最近、イヌモデルにおけるジストロフィン発現の復元におけるrAAV媒介性CRISPR遺伝子編集の有効性と実現可能性を報告した。
DMDはまた、幹細胞障害11を引き起こす。筋肉の損傷のために, 住宅の筋肉幹細胞は、筋肉分化後に死にかけている筋肉細胞を補充します。.しかしながら、損傷および修復の連続したサイクルは、筋幹細胞12におけるテロメアの短縮、および幹細胞プール13、14の早期枯渇につながる。したがって、自家幹細胞療法とジストロフィン発現を回復させるゲノム編集の組み合わせは、DMDを治療するための実用的なアプローチでありうたることができる。CRISPR/Cas9技術は、機能的な筋肉再生のための自己的に修正された多能性幹細胞(iPSC)を生成し、免疫拒絶反応を引き起こさずにDMDのさらなる合併症を防ぐ可能性を提供します。しかし、iPSCは腫瘍形成のリスクがあり、筋原性前駆細胞へのiPSCの分化によって緩和される可能性がある。
このプロトコルでは、非統合センダイウイルスを用いてDmdmdxマウスの真皮線維芽細胞をiPSCに再プログラミングし、CRISPR/Cas9ゲノム欠失によりジストロフィン発現を回復することを説明する。ジェノタイピングによるiPSCにおけるExon23欠失の検証後、筋染発性筋原分化によりゲノム補正iPSCを筋原性前駆体(MPC)に分化した。
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Protocol
すべての動物の取り扱いと外科的処置は、オーガスタ大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されたプロトコルによって行われました。マウスに標準食と水のアドリビタムを与えた。
1. 成体Dmdmdxマウスからの一次マウス線維芽細胞の単離
- ジョージア州立医科大学(オーガスタ大学)が承認したIACUCに従い、CO2窒息および胸部切診により成体Dmdmdxマウス(雄、生後2ヶ月)を安楽死させる。薄板の下の無菌状態で滅菌メスで尾を切ります。尾を70%のエタノールで5分間洗い流し、6cm皿で無菌リン酸緩衝生理食生(PBS)で洗います。
- 尾皮をベースから尾の先端に鋭く切り取って尾皮を剥がし、ピンセットでテールスキンをそっと剥がします。無菌メスを使用して皮膚を1mm3の大きさにミンチし、0.1%のコラゲナーゼIVと1 U/mLのディスパーゼを含むダルベッコの最小必須培地/ハムF12(DMEM/F12)で6cmの皿にミンチされた皮膚組織を動かします。
- 5%CO2インキュベーターで37°Cで2時間培養皿で皮膚組織を消化する。
- フィブロネクチンと0.2%ゼラチンで6ウェルプレートをコーティング(0.2%ゼラチンの199 mLでフィブロネクチンの1mL;材料の表)37 °Cで1時間インキュベートします。
- 消化した皮膚組織を1mLピペット先端で解離し、組織と上清を無菌の15 mL円錐遠心分離管に移します。室温で217 x gで遠心分離機を3分間、上清を廃棄し、線維芽細胞培地(材料表)の1.5mLでペレットを再懸濁する。
- フィブロネクチンでコーティングした6ウェルプレート上のステップ1.5から不完全な消化皮膚組織を含むペレットを37°C、5%CO2インキュベーターでステップ1.4から0.2%ゼラチンを培養する。初期めっき後24時間培地を交換し、取り付けられていない細胞を除去し、48時間ごとに培地を変更する。
2. マウスの皮膚線維芽細胞をiPSCに再プログラミングする
- 経度の2日前に、細胞剥離溶液(材料の表)を用いてステップ1.6から消化マウス真皮線維芽細胞を37°Cインキュベーターで5分間5%CO2の加湿雰囲気で消化する。
- ヘマキトメーターと遠心分離機を使用して細胞を217 x gで3分間数えます。
- 5%CO2の加湿雰囲気を持つ37°Cインキュベーターで、6ウェルプレート上にウェル当たり1−2 x 105細胞の密度でシード細胞を培養し、線維芽細胞培地(材料の表)を培養した。
- 経度変換の日(0日目)に、細胞を推定し、商業マニュアルに従って、5、5、および3の感染の標的多重性(MOI)に達するために必要な各ウイルスの体積を計算する(すなわち、KOS MOI = 5、hc-Myc MOI = 5、hKlf4 MOI = 3)。
- 37°Cの水浴で3本の仙台管を5~10秒で解凍し、3本の仙台管の計算量を1mLの線維芽細胞培地(材料表)に加える。
- ステップ2.3から線維芽細胞培地を取り出し、細胞を含むウェルにリプログラミングウイルス混合物を添加する。5%CO2の加湿雰囲気で37°Cインキュベーターで一晩細胞をインキュベートする。
- 経度後24時間の新鮮な線維芽細胞培地で培地を交換してください。1日おきに培地交換で1週間細胞を培養する。
- 0.05%トリプシン/EDTAで移植後7日目に感染したマウス線維芽細胞を収穫し、以前にフィブロネクチンと0.2%ゼラチンでコーティングされた皿の上に置きます。
- 感染したマウス線維芽細胞をステップ2.6から完全なマウス胚性幹細胞(ES)増殖培地(材料表)で培養し、加湿雰囲気5%CO2を含む37°Cインキュベーターで培養し、毎日培地を変化させる。
- 8日目から、1日おきに反転顕微鏡下でプレートを観察し、マウスESの形態を持つ細胞塊の外観を特定する。
3. アルカリホスファターゼライブシミとフローサイトメトリーを用いてリプログラミング効率を定量化
- 各井戸から培養培養物を取り外し、DMEM/F-12で2~3分間すすいでください。
- 1xアルカリホスファターゼ(AP)生きた染色作業液(DMEM/F-12では1:500希釈)を2mL塗布し、37°Cのインキュベーターで37°Cのインキュベーターで30分間5%CO2の加湿雰囲気でインキュベートします。
- APライブシミを吸引し、それぞれ5分間PBSで2回洗浄します。
- 細胞剥離液(材料表)を37°Cインキュベーターで5分間5%CO2の加湿雰囲気で細胞を消化し、フローサイトメトリーを行い、リプログラミング効率を決定します。
4. ES様細胞の選択と収穫
- 反転顕微鏡下でステップ2.8からコロニーを調べます。
- 料理の下部にあるコロニーに、自己インクオブジェクトマーカーでマークします。
- マークされた細胞のコロニーをカバーするためにグリースクローニングリングを適用します。0.05%トリプシン/EDTAの100 μLを37°Cで各クローニングリングに5分間加え、100 μLピペットチップで消化細胞をmES成長培地を含む48ウェル培養プレートに移します。
- 5%CO2の加湿雰囲気を持つ37°Cインキュベーターで48ウェル培養プレートで細胞をインキュベートする。彼らは70%の合流に達したときに6センチ皿に細胞を通過させます。
- 均一なドミトリー形のクローンが得られるまで、手順4.3と4.4を数回繰り返します。
5. 凍結保存用のiPSCの凍結
- ステップ 4.5 から選択した iPSC をトリプシン、バーセネ、およびひよこプラズマ (TVP;材料の表)溶液を5%CO2インキュベーターで37°Cで30分間使用します。
- 無菌の15 mL円錐形チューブと遠心分離機で細胞を室温で3分間217 x gで回収します。
- 上清を吸引し、マウスES凍結培地(材料表)の2mLで細胞ペレットを再停止し、凍結当たり1mLを得た。
- 凍結保存に必要な重要な-1 °C/分冷却速度を一晩で繰り返し提供する冷凍容器を使用して、凍結液に細胞を追加し、凍結します。
- 冷凍バイアルを液体窒素タンクに移します。
6. iPSCにおける幹細胞マーカーの免疫蛍光染色
- ステップ5.1からmES培地で培養した種子iPSCを、ポリD-リジン/ラミニン(材料の表)でコーティングした8ウェルチャンバースライドに、ウェル当たり1-2 x 104細胞の間で達成し、37°Cインキュベーターでインキュベートする48時間の5%CO2の加湿雰囲気。
- 室温で15分間4%ホルムアルデヒドでスライドを浸し、その後、毎回5分間PBSに2回スライドを浸します。
- マウスIgG遮断試薬(材料の表)でセクションをインキュベートし、室温で1時間のヤギ血清を5%。
- タンパク質希釈剤中の一次抗体を希釈する(マウス抗SSEA1、1:100、ウサギ抗ナノグ、1:500;ウサギ抗POUクラス5ホメオボックス1[OCT4]、1:500;ウサギアンチSRYボックス2[SOX2]、1:500;ウサギアンチリン-2材料)。細胞に抗体を適用し、加湿室で一晩4°Cでインキュベートします。
- 一次抗体溶液を廃棄し、PBSでスライドを3倍洗浄します。
- スライド上のM.O.M.タンパク質希釈剤に2番目の抗体(Alexa488結合ヤギ抗マウス抗体とAlexa555-共役ヤギ抗ウサギ、各1:400)を適用し、室温で45分間インキュベートします。
- 4'6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)を含む取り付け媒体でPBSと取り付けセクションでスライド3xを洗浄します。
- 共焦点顕微鏡で写真を撮る。
7. 生体内におけるiPSCの多能性の調査
- iPSCをステップ5.1から単一細胞に解離し、37°Cのインキュベーターで37°Cのインキュベーターで、加湿雰囲気を5%CO2の30分間使用します。
- ヘマキトメーターと遠心分離機を使用して細胞を217 x gで3分間数えます。
- 上清を吸引し、細胞移植のための5 x 105細胞/30 μLの濃度で1.5 mL無菌遠心管でmES培地でペレットを再懸濁する。
- ヘアバリカンを使用して免疫不不十分なマウスの両方の後肢から毛髪を取り除きます。
- ケタミン(100mg/kg)でマウスを麻酔し、75%のアルコールで注射部位をきれいにします。
- ステップ7.3から30 μLのiPSC懸濁液を筋肉内の胃炎に注入し、31Gの針を使用する。
- 注射の2週間後、マウス胃炎を収穫し、最適な切断温度(OCT)化合物に埋め込み、スナップ凍結し、5-μmセクション15、16に切断する。
- 室温で4%ホルムアルデヒドの切片を15分間固定し、PBSで2回5分間洗浄します。
- 室温で1時間、5%ヤギ血清タンパク質希釈剤で細胞をブロックします。
- 希釈した一次抗体(ウサギ抗AFP,1:50;ウサギ抗SMA,1:50;ウサギ抗TH,1:50)をスライドに加湿したチャンバーで一晩4°Cでインキュベートします。
- 一次抗体溶液を廃棄し、PBSで細胞を3x(5分/ウォッシュ)洗浄し、1:400希釈されたAlexa555-結合ヤギ抗ウサギ抗体をスライドに加え、室温で45分間インキュベートする。
- PBSでスライド3x(5分/ウォッシュ)を洗浄し、DAPIを含む取り付け媒体付きの取り付けセクションを取り付けます。
8. CRISPR/Cas9レンチウイルスベクターターゲティングイントロンフインストロフィンエキソン23の構築
- http://crispor.tefor.net/crispor.pyを介してイントロンフランクジストロフィンエキソン23を標的とするgRNAオリゴの2組を設計する。
注: 設計されたペアは次のとおりです。
i22センス: 5'-CACCGタグタグタグターアア- 3'
i22アンチセンス:5'-AAACTTGATTTTTTTTAAGCTTAAC-3'
i23センス: 5'-CACCGAGTAGTGTGTCATTCTCT- 3'
i23アンチセンス:5'-AAACアガアッガカタクタクトC-3')。 - 消化と脱リン酸化5 μgのレンチウイルスCRISPRプラスミド(レンティ-CRISPRv2ブラスト[モハンバブからの贈り物]とレンティガイド-Hygro-iRFP670 [クリステン・ブレナンドからの贈り物]) (材料の表)BsmB1/Esp3Iで30分間30°C。プラスミドの5 μgの場合は、BsmB1制限酵素の3μL、高速アルカリホスファターゼの3μL、10倍酵素ダイジェストバッファーの6μL、60μL反応で100mM DTTの0.6 μLを加えます。
- 0.8%のアガロースゲルに反応をロードします。ゲルを100-150Vで30分間実行します。
- ゲル抽出キット(材料表)を用いて消化プラスミドインゲルを精製し、H2Oの20μLで溶出します。
- 100 μM で各オリゴヌクレオチドの 1 μL を含む gRNA オリゴヌクレオチドの各ペアのリン酸化物およびアニール、100 μL の 1 μL、T4 ポリヌクレオチド キナーゼ (PNK) の 0.5 μL、37 °C での ddH2O の 6.5 μL、および 90 °5 °C/分で25 °Cに所有しています。
- アニールされたgRNAオリゴヌクレオチドの1:200希釈を、plentiCRISPR V2-ブラストまたは豊富なガイド-Hygro-iRFP670にライゲートする。50 ngのBsmB1/Esp3I消化ベクターを希釈したオリゴデュプレックスの1μLと2xリゲスバッファーの5μLと11 μL反応系で1μLのリゲスを加え、室温で10分間インキュベートします。
- 製造元の指示に従って、3 μL のライゲーション製品を 50 μL の有能な細胞 (材料の表)に変換します。
- 100 μg/mLカルベニシリンで形質転換した有能な細胞を寒天プレートに広げ、31.5 °Cで18時間インキュベートします。
- 10 μLの滅菌ピペットの先端と培養物を31.5 °Cで100μg/mLカルベニシリンを含む素晴らしいスープ(材料の表)で5mLのコロニーを選び、21時間シェーカーインキュベーターで185rpmを選びます。
- ミニプレップキットとミディプレップキット(材料の表)を使用してプラスミドDNAを精製します。
- 制限消化によってミニプレッププラスミドを確認します。20 μL反応系の場合は、プラスミドDNAの1μg、消化反応バッファーの2μL(材料表)、制限酵素混合物の1μL(KpnI-HFの0.5μL、およびPlentiCRISPR V2-Blast-i22のAgeI-HFの0.5 μL、NotI-HFの0.5 μL)を追加します。 豊富なガイド-ハイグロ- iRFP670- i23)。37°Cで1時間の反応系をインキュベートします。
- 0.8%のアガロースゲルに反応をロードします。ゲルを100-150Vで30分間実行します。
注: plentiCRISPR V2-Blast-i22 の正しいバンドは 622 bp と 12.2 kb で、plentiGuide-Hygro- iRFP670- i23 の正しいバンドは 2.6 kb と 7.1 kb でなければなりません。
9. レンチウイルスベクター包装
- 培養7 x 105 293FT細胞を5mLのDMEM培養剤で37°C、5%CO2で一晩6cm皿に10%胎児ウシ血清を含有する。
- カクテル(1 μgのplentiCRISPR V2-Blast-i22またはplentiGuide-Hygro-iRFP670-i23、psPAX2包装プラスミドの750ng、pMD2.Gエンベローププラスミドの250ng、およびトランスフェクション試薬Aの5 μL[材料の表]100μMのメディア)を準備します。
- 減らされた血清MEM媒体の100 μLのトランスフェクション試薬B(材料の表)の5 μLの混合物を調製する。
- ステップ9.2からプラスミド混合物に100μLのトランスフェクション試薬B混合物を加え、室温で5分間インキュベートします。
- DNA脂質複合体(ステップ9.4から)を293FT細胞にドロップワイズで追加します。5%CO2で37 °Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、各皿にウイルス産生エンハンサー(500x)(材料表)を追加し、37°C、5%CO2で24時間インキュベートする。
- 次の2日間にピペットを使用して細胞から培地を収集し、0.45 μmフィルターを通して培地を濾過して細胞を除去します。
10. レンチウイルスベクターの濃度と精製
- ステップ9.7の培地でレンチウイルスベクターを5倍のポリエチレングリコール4000(PEG4000、8.5%最終濃度)および4M NaCl(0.4M最終濃度)で一晩4°Cで沈殿させる。
- PEG4000溶液を含むウイルス媒体を2,095 x gおよび4°Cで30分間遠心分離し、上清を取り除いて廃棄する。
- 500 μLの血清減少MEM培地でペレットを再中断する(レンチウイルス滴:lenti-CRISPR V2-gRNAi22:1.56 x 10 8、lenti-iRFP6 70-gRNAi23: 1.3 x 108, lenti-CRISPR V2制御: 3.13 x 107, lenti-iRFP670 制御: 5.9 x 107).使用するまで-80°Cで保管してください。
11. Cas9と組み合わせた2つのガイドRNA(gRNA)を持つマウスiPSCにおけるエキソン23の削除
- ステップ4.5からフィブロネクチンとゼラチンでコーティングされた24ウェルプレートにマウスiPSCをプレートします。
- 細胞が50%の合流点に達した後、8 μg/mLポリブレンを含む新鮮な培地(完全なマウス胚性幹細胞増殖培地)に切り替える。
- レンチ-CRISPR V2-gRNAi22、lenti-iRFP670-gRNAi23、および制御(空のベクトル:lenti-CRISPR V2、lenti-iRFP670)を含むステップ10.3からレンチウイルス粒子溶液の100 μLをマウスiPSCに追加します。5%CO2で37°Cで3日間細胞をインキュベートする。
- 2.5 μg/mLブラスチシジンと100 μg/mLヒグロマイシンBを含む培養剤を用いて安定感染細胞を選択し、感染していない細胞を殺すために必要なブラスチシジンとハイグロマイシンBの最小濃度を決定する。
注:非感染細胞は、ブラスチシジンとハイグロマイシンBによって殺されます。 - 選択したマウスiPSCを0.5mLのTVP溶液で消化し(24ウェルプレート)、細胞を37°Cで30分間30分間インキュベートし、5%CO2で分けます。
- ピペッティングによりiPSCを単一細胞に解離し、細胞計数室で細胞をカウントし、mES培地で消化した単一細胞を約150個の消化単細胞を10cm皿に希釈し、5%CO2で37°Cで培養した。
- 約10日後、10 μLの滅菌ピペットチップを使用して反転顕微鏡下で単一のコロニーを選びます(96個のコロニーを選ぶ必要があります)。
- 摘み取られたコロニーを50μLのTVP溶液に移し(96ウェルプレート、各コロニー各ウェル)、37°Cで30分間消化し、消化した細胞を2つの96ウェル培養プレートに播種し、培養(ジェノタイピング用)を保つ。
- CO2インキュベーターで37°Cでインキュベートし、70%のコンフルエントまでインキュベートします。
12. exon23削除によるiPSCコロニーの同定
- 細胞コロニーが70%の合流点に達したら、96ウェルプレートで培地を取り除きます。
- 各ウェルに25μLの溶解試薬(材料表)を含むタンパク質剤K溶液(溶解試薬100mLのプロテアーナーゼKの1mL)を各ウェルに加え、溶解液を96ウェルPCRプレートに移します。
- PCRプレートをシールし、プレートを55°Cで30分間インキュベートし、次いで95°Cで45分間細胞を分解し、プロテアーナーゼKを変性させます。
- ステップ12.3から2μLのリサートでPCR反応を行う。20 μL PCL反応の場合は、2μLのリサート、2x DNAポリメラーゼプレミックス(材料表)の10μL、DNASeフリー水の7μL、DMDエクソン23プライマーの1μLを添加します(表1)。
- PCR反応には次のパラメータを使用します:1分間98°C、10sの場合は98°Cの35サイクル、15sでは60°C、30sでは72°C、最終延長は72°Cで1分間使用してください。
- PCR反応を2%のアガロースゲルにロードします。ゲルを100-150Vで30分間実行します。
- 紫外線の下でゲルを点検する(ノックアウト効率は3/94である)。
13. Tet-on MyoD活性化システムを用いてiPSCを筋原性前駆細胞(MPC)に直接分化する
- LV-TRE-VP64-マウス MyoD-T2A-dsRedExpress2 および LV-TRE-VP16 マウス MyoD-T2A-dsRedExpress2 (チャールズ・ゲルスバッハからの贈り物) (材料の表)は、前述の通り、lenti-CRISPRv2 ブラストおよびレンチ-gRNA-iRFP670 ベクトルのセクションで説明しました。9と10。
- レンチウイルス-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2またはレンチウイルス-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2を使用してマウスiPSCに感染するレンティウイルス-CRISPRv2ブラストおよびレンチ-gRNA-iRFP670ベクターは、ステップ11.1-11.3.
- 感染の3日後に1 μg/mLピューロマイシンを持つ細胞を選択し、純粋なトランスメ下細胞集団を得る。
- 培養培養培養物(10%FBS DMEM)に3 μg/mLドキシサイクリンをMPC分化に加えます。2日ごとにドキシサイクリンを補充した新鮮な培地を置き換える.
14. 動的筋分化およびDMDエキソン22-24発現を評価するための定量的逆転写PCR
- RNA単離試薬を用いてドキシサイクリン処理後0、3、6、及び10日後に細胞RNAを抽出し、第1鎖cDNA合成キット(材料表)を用いてRNAをcDNAに逆転写する。
- 20 μL qPCR反応システムの場合は、cDNAの1μL、PCR反応バッファーの10μL(材料表)、DNAH2Oの8μL、および前方および逆プライマーの混合物の1μL(グリセラルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ[GAPDH]、骨格筋[ACTA1]、スケルト筋[ACTA1]、および1μLを加えます。OCT4 および DMD exon22、DMD exon23、および DMD exon24 を参照してください。.
- PCR反応には次のパラメータを使用します:2分間50°C、2分95°C、15sの場合は95°Cの40サイクル、1分間の60°C、溶融曲線65.0°C~95.0 °C、増分0.5°C。
15. ミオシン重鎖2(MYH2)及びジストロフィンタンパク質発現の免疫蛍光染色
- プレートドキシサイクリン誘発、レンティ-TRE-MyoDは、ステップ13.4から8ウェル培養スライドに細胞を改変した。
- 室温で4%ホルムアルデヒドで細胞を15分間固定し、PBSで2回5分間洗浄します。
- 室温で1時間、5%ヤギ血清タンパク質希釈剤で細胞をブロックします。
- スライドにウサギ系抗ジストロフィン抗体(1:300)およびマウス抗MYH2抗体(1:100)を添加し、加湿室で一晩4°Cでインキュベートする。
- 一次抗体溶液を廃棄し、PBSで細胞を3x(5分/ウォッシュ)洗浄し、1:400希釈されたAlexa488-共役ヤギ抗ウサギ抗体とAlexa555-共役ヤギ抗体をスライドに加え、室温で45分間インキュベートします。
- PBSでスライドを3x(5分/ウォッシュ)洗い、DAPIを含む取り付け媒体付きの取り付け部。
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Representative Results
dmdmdx皮膚線維芽細胞由来iPSCの確立我々は、統合フリーのリプログラミングベクターを用いてDmdmdxマウス由来皮膚線維芽細胞からマウスiPSCを生成する効率を実証した。図1Aは、感染後3週間で胚性幹細胞(ESC)様コロニーの出現を実証した。生きたアルカリホスファターゼ(AP)染色によるiPSC誘導の効率を評価する。図1Bは、FACS分析によりAP陽性細胞の割合が約1.8%であったことを示す。SSEA1、Lin28、ナノ、OCT4およびSOX2は、マウス胚性幹細胞に対する多能性マーカー、免疫蛍光染色によるiPSCコロニーに対して陽性であった(図1C)。生体内のiPSCの3つの生殖細胞分化を調べるために、マウスの胃炎にiPSCを筋肉内に注入した。注入されたiPSCは肝細胞(内皮)、平滑筋細胞(中皮)、アドレナリン性ニューロン細胞(エクトーダーム)に分化し、iPSCの多能性を示すことを観察した。
CRISPR/Cas9 仲介 exon23 削除.変異型エキソン23を横切る2つのガイドRNAを設計した。Cas9媒介の二本鎖切断(DSB)および非相同末端接合(NHEJ)の後、変異型エキソン23が削除され、切り捨てられたが機能的なジストロフィン産生を可能にした(図2A)。削除されたマウスiPSC23個を同定するために、細胞はまばらに播種され、個々のコロニーを採取して伝播した。これらのコロニーから抽出したゲノムDNをPCRジェノタイピングを行った。図2Bは、コロニー#1および#2がエキソン23の正常な削除を示すエキソン23欠失を有することを実証した。
マウスiPSCを筋原性系統に分化し、ジストロフィン発現を回復させる。我々は、テトラサイクリン誘導性MyoD発現システムを用いて、iPSCの筋原性分化を誘導する。ドキシサイクリンは、iPSCでMyoD発現を誘導するために使用された。図3Aは、ドックス処理iPSCにおける筋分化の時間経過を示す。qRT-PCRは、多能性マーカーであるOCT4のmRNAレベルが徐々に減少し、骨格筋マーカーであるACTA1の発現がDox誘導後に増加することを示した。また、ドックス治療後2週間で筋管形成を観察した(図3B)。重要なことに、qRT-PCRアッセイは、Dox誘発性、Cas9媒介Exon23削除ラインにおけるDMDエキソン24 mRNA発現の回復をCas9対照線(図3C)と比較して示した。qRT-PCRと矛盾し、免疫蛍光染色はCas9媒介エキソン23削除細胞におけるジストロフィンタンパク質発現を示し、一方、ジストロフィン発現は対照細胞に存在しなかった(図3D)。
図1:DmdmdxマウスからiPSCに皮膚線維芽細胞を再プログラミングする。
(A)ES様コロニーの代表的な画像(スケールバー= 200 μm)。(B)ライブAP染色による仙台ウイルス伝達の8日後にiPSCにマウス皮膚線維芽細胞の再プログラミング効率のFACS分析。(C)iPSCにおけるSSEA1、Lin28、ナノグ、Oct4、およびSOX2の免疫蛍光染色(スケールバー= 50 μm)。(D)AFP(内皮)、SMA(中皮)、およびチロシンヒドロラーゼ(TH)(エクトーダーム)のiPSCを胃炎に注入してから2週間後(スケールバー=20μm)の免疫蛍光染色。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: CRISPR/Cas9 媒介 exon23 削除。
(A)CRISPR/Cas9媒介エキソン23削除の概略図。Cas9ヌクレアーゼは、2つのgRNAによってイントロン22およびイントロン23を標的とする。Cas9による二本鎖破断(DSB)は、変異型エキソン23の切除をもたらす。遠位端は非相同末端接合(NHEJ)によって修復され、ジストロフィン遺伝子の読み取りフレームの復元をもたらす。(B)エキソン23のPCRジェノタイピング分析。矢印は、エキソン23のPCR産物を示す。GAPDH は参照として機能します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスiPSCを筋原性系統に分化し、ジストロフィン発現を回復させる。
(A)qRT-PCRは、ドックス処理エキソン23削除Dmdmdx iPSC(*P< 0.05 対 D0、D6、D10、#P < 0.05 対 D0、D3、D10、$P< 0.05 対 D0、D3、D6、n = 4 Oct4) (*P < 0.05 対 D6 および D10、#P < 0.05 対 D0、D3、および D10、$P < 0.05 対 D0、D3、および D6、n = 3 ACTA1)。(B)左:ドックス誘発マウスiPSCからの筋管形成の代表的な画像(スケールバー= 200μm)。右:ドックス誘発マウスiPSCからの筋管形成におけるMYH2の免疫蛍光分析(スケールバー= 20 μm)。(C) 上: DMD Exon22、Exon23、および Exon24 の PCR プライマー位置。下: MPCにおけるDMD Exon22、Exon23、およびExon24発現のmRNAレベルのqRT-PCR分析(****P< 0.0001、n = 3)。(D)iPSCCas9-CtrlおよびiPSCCas9-gRNA(スケールバー=50μm)からのドックス誘導MPCにおけるジストロフィン発現の免疫蛍光分析。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| ガイドプライマー | |
| i22 センス | 5'-カクグッタグタグタグタグアアトカ- 3' |
| i22 アンチセンス | 5'-AAACTTTTTTTTAGCTAC-3' |
| i23 センス | 5'-カッガグタットGTGTTCT- 3' |
| I23 アンチセンス | 5'-AAACAGAAGGTATATATTActC-3' |
| PCR プライマー | |
| OCT4フォワード | 5'-アグクツガアガガガガッカスカ-3' |
| OCT4-リバース | 5'-TCTCATTGTGTCGGCTCCCCA-3' |
| ACTA1 フォワード | 5'-ガッカッガガッカッカック-3' |
| ACTA1-リバース | 5'-TCAGCガタッカッタキャット-3' |
| Exon22-フォワード | 5'-タッカッカアットGCTATCA-3' |
| Exon22-リバース | 5'-CCGAGTCTCCCCCCTC-3' |
| Exon23-フォワード | 5'-CCAAAAGAAGCTTCAAATG-3' |
| Exon23-リバース | 5'-TTTGGCAGCTTCCカ-3' |
| Exon24 フォワード | 5'-AAC CTT アカ GAA ATG ガット GGC-3' |
| Exon24-リバース | 5'-TTTCaggatttCAGCCCCCCCCCCCCCCCC' |
| GAPDH フォワード | 5'-TGACAAGCTTCCCTCTCG-3' |
| GAPDH-リバース | 5'-CCCTTCATTGACCTCAACTACATCatACAT-3' |
表 1: プライマー シーケンス。
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Discussion
デュシェンヌ筋ジストロフィー(DMD)は、ジストロフィンの欠如を特徴とする破壊的で最終的に致命的な遺伝性疾患であり、進行性筋萎縮症1、2を引き起こす。我々の結果は、CRISPR/Cas9媒介exon23欠失のアプローチにより、Dmdmdx iPSC由来筋原性前駆細胞におけるジストロフィン遺伝子発現の回復を実証した。この方法には 3 つの利点があります。
まず、非統合RNAベクターを用いてDmdmdxマウス由来真皮線維芽細胞からiPSCを生成した。レンチウイルスベクターやレトロウイルスベクターなどのiPSCを生成する様々な方法が開発され、宿主染色体に統合してリプログラミング遺伝子を発現させ、安全性に関する懸念を抱きます。プラスミドベクター、アデノ関連ウイルス、アデノウイルスなどのDNAベースのベクターは、非統合的な方法で存在します。しかし、それらは依然として低周波で宿主染色体に統合される可能性がある。本研究では、非統合RNAベクターである改変された非透過性のセンダイウイルスを用いて、リプログラミングのために幹細胞転写因子を線維芽細胞に安全かつ効果的に提供した。
次に、CRISPR/Cas9媒介精密遺伝子補正ではなく、CRISPR媒介ゲノム欠失を用いて、iPSCにおけるジストロフィン発現を回復させる。この方法は、実行可能かつ効率的です。多くのヒトDMD患者17で発生する複数の変異エノンを削除するために複数のgRNAを設計することは容易である。Exonの欠失は比較的効率的な非相同末端結合経路を利用し、この方法はまたDNA修復テンプレートを提供する必要性を回避する。したがって、Cas9媒介精密補正と比較して、Cas9媒介エキソン欠失は、複数の遺伝子変異を有するDMD患者に適している。
最後に、未分化iPSCを筋原性前駆細胞に誘導し、iPSCによる腫瘍形成のリスクを低減する可能性があります。このプロトコルでは、誘導性テトラサイクリン調節(Tet-On)ベクター系を介してMyoD発現を誘導し、iPSCを骨格筋前駆体18,19に分化させた。
結論として、CRISPR/Cas9ゲノム編集とTet-on MyoD活性化システムの組み合わせは、DMD患者における細胞移植のための幹細胞における変異型DMD-Exon23欠失の安全で、実現可能かつ効率的な戦略を提供する可能性がある。
ES様細胞を効率的に選択して収穫するには、ドーム状の形態を用いて未分化iPSC細胞を同定し、インクオブジェクトマーカーを使用して、iPSCの周りに1.8mmの円で培養皿の下部から個々のクローンをラベル付けするのに役立ちます。クローン。トリプシン溶液の漏れを避けるために、我々はリングの底部に均等にグリースを適用する必要があります。また、ラベル付きセルコロニーの上部にグリースコーティングリングを配置した後、リングに触れないように注意する必要があります。それ以外の場合、iPSC クローンはデタッチされます。
プロトコルには制限があります。例えば、iPSCを生成するために非統合RNAベクターシステムを選択しました。しかし、我々は、DMDエキソン23を削除するためにレンチウイルスCRISPR/Cas9システムを使用し、iPSC筋原分化を誘導するためにレンチウイルスベースのMyoD活性化システムを使用しました。これらの統合レンチウイルスベクターは、安全性に関する懸念を有する。しかし、これらの問題は、組換え、高純度S.ピョージェンスCas9ヌクレアーゼをcrRNA:tracrRNAデュプレックスで含むリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体の適用によって解決することができる。化学的に改変されたMyoD mRNAトランスフェクションを選択して、iPSCを筋原性前駆体に直接区別することができますが、効率は難しいかもしれません。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
タンとワイントラウブは、NIH-AR070029、NIH-HL086555、NIH-HL134354によって部分的にサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical Instruments | |||
| 31-gauge needle | Various | ||
| Sharp Incision | Various | ||
| Sterile Scalpels | Various | ||
| Tweezers | Various | ||
| Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.1 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 1 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 87 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 10 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 1 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 1 mL |
| TVP solution (for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Chicken Serum | Gibco | 16110-082 | 5 mL |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | 186 mg |
| Phosphat-buffered saline | to 500 mL | ||
| Trypsin (2.5%) | Thermo | 15090046 | 5 mL |
| mES growth medium(for 500 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| 2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco | 21-985-023 | 0.5 mL |
| Antibiotic Antimycotic Slution 100x | CORNING | MT30004CI | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 408.5 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 75 mL |
| L-Glutamine solution | SIGMA | G7513 | 5 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 500 μL |
| MEK/GS3 Inhibitor Supplement | EMD Millipore Corp | CS210510-500UL | 500 μL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140076 | 5 mL |
| The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks. | |||
| mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) | Company | Catalog Number | Volume |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | SIGMA | D2650 | 5 mL |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | SIGMA | D6429 | 24.9 mL |
| Fetal Bovine Serum Characterized | HyClone | SH30396.03 | 25 mL |
| Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL | EMD Millipore Corp | CS210511 | 50 μL |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | RRID |
| 0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA | CORNING | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo scientific | J19943-k2 | |
| Accutase solution | SIGMA | A6964 | Cell detachment solution |
| AgeI-HF | NEB | R3552L | |
| Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody | Invitrogen | A32723 | AB_2633275 |
| Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32731 | AB_2633280 |
| Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody | Invitrogen | A32732 | AB_2633281 |
| anti-AFP | Thermo scientific | RB-365-A1 | AB_59574 |
| anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP | CST | 19245S | AB_2734735 |
| anti-Dystrophin | Thermo | PA5-32388 | AB_2549858 |
| anti-LIN28A (D1A1A) XP | CST | 8641S | AB_10997528 |
| anti-MYH2 | DSHB | mAb2F7 | AB_1157865 |
| anti-Nanog-XP | CST | 8822S | AB_11217637 |
| anti-Oct-4A (D6C8T) | CST | 83932S | AB_2721046 |
| anti-Sox2 | abcam | ab97959 | AB_2341193 |
| anti-SSEA1(MC480) | CST | 4744s | AB_1264258 |
| anti-TH (H-196) | SANTA CRUZ | sc-14007 | AB_671397 |
| Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) | Thermo | A14353 | |
| Blasticidin S | Sigma-Aldrich | 203350 | |
| BsmBI/Esp3I | NEB | R0580L/R0734L | |
| Carbenicillin | Millipore | 205805-250MG | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Competent Cells | TakaRa | 636763 | |
| CutSmart | NEB | B7204S | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo | A16517 | |
| DirectPCR Lysis Reagent (cell) | VIAGEN BIOTECH | 302-C | |
| Dispase (1 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| Doxycycline Hydrochloride | Fisher BioReagents | BP26535 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101L | |
| Fibronectin bovine plasma | SIGMA | F1141 | |
| QIAEX II Gel Extraction Kit (500) |
QIAGEN | 20051 | |
| Gelatin from porcine skin, type A | SIGMA | G1890 | |
| HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector | H-1500 | |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | Invitrogen | 10687010 | |
| Ketamine HCL Injection | HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH | 45822 | |
| KpnI-HF | NEB | R3142L | |
| lenti-CRISPRv2-blast | Addgene | 83480 | |
| lenti-Guide-Hygro-iRFP670 | Addgene | 99377 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000015 | |
| LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60625 | |
| LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 | Addgene | 60626 | |
| Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit | Vector | BMK-2202 | |
| NotI-HF | NEB | R3189L | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher | 31985070 | |
| Polyethylene glycol 4,000 | Alfa Aesar | AAA161510B | |
| Polybrene | SIGMA | TR1003 | |
| Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide | CORNING | CB354688 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | ThermoFisher | A25742 | |
| PrimeSTAR Max Premix | TakaRa | R045 | |
| Proteinase K | VIAGEN BIOTECH | 507-PKP | |
| Puromycin Dihydrochloride | MP Biomedicals | ICN19453980 | |
| qPCR Lentivirus Titration Kit | abm | LV900 | |
| Quick ligation kit | NEB | M2200S | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | QIAGEN | 27106 | |
| QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) | QIAGEN | 12945 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo scientific | K1691 | |
| RNAzol RT | Molecular Research Center, INC | RN 190 | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Terrific Broth Modified | Fisher BioReagents | BP9729-600 | |
| ViralBoost Reagent (500x) | ALSTEM | VB100 |
References
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