Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

CRISPR/Cas9 teknologi i gjenopprette Dystrofingenet uttrykk i iPSC-avledet Muscle forfedre

Published: September 14, 2019 doi: 10.3791/59432
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Medical College of Georgia, Augusta University

Summary

Her presenterer vi en Cas9-basert exon23 sletting protokoll for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk i iPSC fra DMDMDX mus-avledet hud fibroblaster og direkte differensiere iPSCs til myogenic stamceller (MPC) ved hjelp av tet-on MyoD aktiveringssystem.

Abstract

Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) er en alvorlig progressiv muskel sykdom forårsaket av mutasjoner i dystrofingenet genet, som til slutt fører til utmattelse av muskel stamceller. Gruppert regelmessig oppdelt korte palindromic repetisjoner/CRISPR-Associated 9 (CRISPR/Cas9) genredigering har potensiale til å gjenopprette uttrykk for det dystrofingenet genet. Autologous indusert Pluripotent stamceller (iPSCs)-avledet muskel stamceller (MPC) kan etterfylle stammen/Stamcelle utvalget, reparere skader, og hindre ytterligere komplikasjoner i DMD uten å forårsake en immunrespons. I denne studien introduserer vi en kombinasjon av CRISPR/Cas9 og ikke-integrerte iPSC-teknologier for å få muskel forfedre med gjenopprettede dystrofingenet protein uttrykk. Kort, bruker vi en ikke-integrere Sendai vektor å etablere en iPSC linje fra dermal fibroblaster av DMDMDX mus. Vi bruker deretter CRISPR/Cas9 sletting strategi for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk gjennom en ikke-homologe slutten sammenføyning av reframed dystrofingenet genet. Etter PCR validering av exon23 nedbryting i tre kolonier fra 94 plukket iPSC kolonier, skiller vi iPSC inn MPC av Doxycycline (dox)-indusert uttrykk for MyoD, en nøkkel transkripsjon faktor spiller en betydelig rolle i regulering muskel differensiering. Våre resultater viser muligheten for å bruke CRISPR/Cas9 sletting strategi for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk i iPSC-avledet MPC, som har betydelig potensial for å utvikle fremtidige terapier for behandling av DMD.

Introduction

Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) er en av de vanligste muskuløse dystrofi og er karakterisert ved fravær av dystrofingenet, som berører 1 av ca 5 000 nyfødte gutter over hele verden1. Tap av dystrofingenet gen funksjon resulterer i strukturelle muskel feil som fører til progressiv myofibers degenerasjon1,2. Rekombinant adeno-Associated virus (rAAV)-mediert genterapi system har blitt testet for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk og forbedre muskel funksjon, som for eksempel gen erstatning ved hjelp av mikro-dystrophins (μ-Dys). Imidlertid krever rAAV tilnærming gjentatte injeksjoner å opprettholde uttrykk for den funksjonelle protein3,4. Derfor trenger vi en strategi som kan gi effektivt og permanent gjenopprette dystrofingenet genuttrykk hos pasienter med DMD. DMDMDX musen, en mus modell for DMD, har et punkt mutasjon i ekson 23 av dystrofingenet genet som introduserer en tidlig avslutning Codon og resulterer i en ikke-funksjonell avkortet protein mangler C-terminal dystroglycan bindende domene. Nyere studier viste bruk av CRISPR/Cas9 teknologi for å gjenopprette dystrofingenet genuttrykk ved nøyaktig gen korreksjon eller mutant ekson sletting i små og store dyr5,6,7. Long et al.8 rapporterte metoden for korrigering av dystrofingenet genet mutasjon i DMDMDX mus germline av homologi-regissert reparasjon (HDR) basert CRISPR/Cas9 Genova redigering. El Refaey et al.9 rapporterte at rAAV kunne effektivt avgiftsdirektoratet den muterte ekson 23 i dystrophic mus. I disse studiene, gRNAs ble utformet i introns 20 og 23 for å forårsake dobbel-strandet DNA pauser, som delvis restaurert dystrofingenet uttrykk etter DNA reparasjon via ikke-homologe ende sammenføyning (NHEJ). Enda mer spennende, Amoasii et al.10 nylig rapportert effekten og gjennomførbarhet av rAAV-mediert CRISPR genredigering i å gjenopprette dystrofingenet uttrykk i canine modeller, et viktig skritt i fremtidig klinisk anvendelse.

DMD fører også til Stamcelle forstyrrelser11. For muskel skade, bolig muskel stamceller fylle døende muskelceller etter muskel differensiering. Men, påfølgende sykluser av skade og reparasjon føre til forkortelse av telomerer i muskel stamceller12, og for tidlig tømming av Stamcelle bassengene13,14. Derfor kan en kombinasjon av autologous stilk cellen terapi med Genova redigering for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk være en praktisk tilnærming for behandling DMD. Den CRISPR/Cas9 teknologi gir mulighet for å generere autologous genetisk korrigert indusert Pluripotent stamceller (iPSC) for funksjonell muskel regenerering og hindre ytterligere komplikasjoner av DMD uten å forårsake immun avvisning. Men iPSCs har en risiko for tumor dannelse, som kan bli lindres av differensiering av iPSC inn myogenic stamceller.

I denne protokollen, beskriver vi bruken av ikke-integrere Sendai virus til omprogrammering dermal fibroblaster av DMDMDX mus til iPSCs og deretter gjenopprette dystrofingenet uttrykk ved CRISPR/Cas9 Genova sletting. Etter godkjenningen av Exon23 overstrekingen inne iPSC av genotyperingteknologi, vi differensiert Genova-korrigerte iPSC i myogenic forfedre (MPC) via MyoD-indusert myogenic differensiering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr håndtering og kirurgiske prosedyrer ble utført av en protokoll godkjent av Augusta University institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC). Mus ble matet standard kosthold og vann ad lib.

1. isolering av primær mus fibroblaster fra voksen DMDMDX mus

  1. Euthanize voksen DMDMDX mus (hann, 2 måneder gammel) av co2 kvelning og toraktomi henhold til IACUC godkjent av Medical College of Georgia, Augusta University. Skjær halen med en steril skalpell i en steril tilstand under laminær hette. Skyll halen med 70% etanol i 5 min, og vask deretter med sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS) i en 6 cm rett.
  2. Skrell halen huden av en skarp snitt fra basen til halen spissen langs halen huden, og deretter forsiktig skrelle av halen huden med pinsett. Hakke huden å en størrelse av 1 mm3 benytter en steril skalpell og bevege det hakket hud tissue å en 6 cm fat inne Dulbecco ' minimal vesentlige medium/ham ' s F12 (DMEM/F12) inneholder 0,1% kollagenase IV og 1 U/ml av dispase.
  3. Fordøye hud vevet i en kultur rett for 2 timer ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator.
  4. Coat en 6-brønn plate med fibronektin og 0,2% gelatin (1 mL fibronektin i 199 mL av 0,2% gelatin; Tabell med materialer) og ruge ved 37 ° c for 1 time.
  5. Distansere det fordøyd hud vevet med en 1 mL Pipet spiss og Overfør vevet og supernatanten til et sterilt 15 mL konisk sentrifugerør. Sentrifuger ved 217 x g i 3 min ved romtemperatur, kast supernatanten og resuspend pellet i 1,5 ml Fibroblast medium (tabell av materialer).
  6. Kultur pellets inkludert ufullstendig fordøyd hud vev fra trinn 1,5 på 6-brønn plate belagt med fibronektin og 0,2% gelatin fra trinn 1,4 i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator. Erstatt mediet 24 h etter den første plating å fjerne ledige celler, og endre mediet hver 48 h.

2. omprogrammering mus huden fibroblaster inn iPSCs

  1. To dager før Transduction, fordøye mus dermal fibroblaster fra trinn 1,6 med cellen avløsning løsning (tabell av materialer) i en 37 ° c inkubator med en fuktet atmosfære av 5% co2 for 5 min.
  2. Count celler ved hjelp av en hemacytometer og sentrifuger på 217 x g i 3 min.
  3. Seed celler i en tetthet på 1 − 2 x 105 celler per brønn på en 6-brønn plate og kultur med Fibroblast medium (tabell av materialer) i en 37 ° c inkubator med en fuktet atmosfære av 5% co2.
  4. På dagen for Transduction (dag 0), anslå cellene og beregne volumet av hvert virus som kreves for å nå målet mangfoldet av smitte (MOI) på 5, 5 og 3 (dvs. KOS MOI = 5, HC-myC MOI = 5, hKlf4 MOI = 3) i henhold til den kommersielle manualen.

Equation 1

  1. Tine tre Sendai rør i en 37 ° c vannbad for 5 − 10 s og legge de beregnede volumer av hver av de tre Sendai rør til 1 mL Fibroblast medium (tabell av materialer).
  2. Fjern det Fibroblast mediet fra trinn 2,3 og Legg til omprogrammering virus blandingen i brønnene som inneholder cellene. Ruge cellene over natten i et 37 ° c inkubator med en fuktet atmosfære på 5% CO2.
  3. Bytt medium med friskt Fibroblast medium 24 h etter Transduction. Kultur cellene for en uke med middels utveksling annenhver dag.
  4. Harvest infiserte musen fibroblaster på dag 7 etter Transduction med 0,05% Trypsin/EDTA og plassere på retter som er tidligere belagt med fibronektin og 0,2% gelatin.
  5. Kultur den infiserte musen fibroblaster fra trinn 2,6 med komplett mus embryonale Stamcelle (ES) vekstmedium (tabell av materialer) i en 37 ° c inkubator med en fuktet atmosfære av 5% co2 og endre medium daglig.
  6. Fra den åttende dagen, observere platen under en invertert mikroskop annenhver dag for å identifisere utseendet på cellen klumper med morfologi av musen ES.

3. Bruk av alkalisk fosfatase levende beis og strømnings flowcytometri for å kvantifisere omprogrammering effektivitet

  1. Fjern kultur mediene fra hver brønn og skyll med DMEM/F-12 for 2 − 3 min.
  2. Påfør 2 mL 1x alkalisk fosfatase (AP) levende beis arbeids løsning (1:500 fortynning i DMEM/F-12) til tilhenger celler, og ruge i en 37 ° c inkubator med en fuktet atmosfære på 5% CO2 i 30 min.
  3. Aspirer AP leve flekken og vask to ganger med PBS for 5 min hver.
  4. Fordøye cellene med celle avløsning løsning (tabell av materialer) i en 37 ° c inkubator med en fuktet atmosfære på 5% co2 for 5 min. utføre Flow flowcytometri å bestemme omprogrammering effektivitet.

4. velge og høste ES-lignende celler

  1. Undersøk koloniene fra trinn 2,8 under et invertert mikroskop.
  2. Merk koloniene i bunnen av fatet med en selv-blekk objekt markør.
  3. Påfør smurt kloning ringer for å dekke de markerte celle koloniene. Tilsett 100 μL av 0,05% Trypsin/EDTA til hver kloning ring ved 37 ° c i 5 min, og deretter overføre de fordøyd celler med 100 μL pipette tips til 48-brønn kultur plater som inneholder mES vekstmedium.
  4. Ruge cellene i 48-brønn kultur plater i et 37 ° c inkubator med en fuktet atmosfære på 5% CO2. Passage cellene til 6 cm parabolen når de når 70% samløpet.
  5. Gjenta trinn 4,3 og 4,4 for flere ganger til uniform dorm-formede kloner er innhentet.

5. frysing iPSCs for kryonisk bevaring

  1. Distansere den valgte iPSCs fra trinn 4,5 med Trypsin, versene og Chick plasma (TVP; Tabell med materialer) løsning ved 37 ° c i en 5% CO2 inkubator i 30 minutter.
  2. Samle cellene i et sterilt 15 mL konisk rør og sentrifuger ved 217 x g i 3 min ved romtemperatur.
  3. Aspirer supernatanten og re-suspendere celle pellet i 2 mL mus ES frosset medium (tabell av materialer) for å få 1 ml per cryovial.
  4. Legg celler til cryovials og fryse ved hjelp av en fryseboks som gir den kritiske, gjentatt-1 ° c/min kjøle hastighet kreves for kryonisk bevaring ved-80 ° c over natten.
  5. Overfør frosne hetteglass til en flytende nitrogen tank.

6. Immunofluorescence farging for stilk cellen markører i iPSCs

  1. Seed iPSCs fra trinn 5,1 kultivert med mES medium inn i en 8-brønn kammer Slide belagt med Poly-D-lysin/laminin (tabell av materialer) i riktig tetthet for å oppnå mellom 1 − 2 x 104 celler per brønn og ruge i en 37 ° c inkubator med en fuktet atmosfære av 5% CO2 for 48 h.
  2. Dypp lysbildene i 4% formaldehyd i 15 min ved romtemperatur, og deretter dyppe lysbildene i PBS to ganger for 5 min hver gang.
  3. Ruge deler med en mus IgG-blokkerende reagens (tabell av materialer), og 5% geit serum for 1 t ved romtemperatur.
  4. Fortynne den primære antistoffer i protein fortynningsmiddel (mus-anti-SSEA1, 1:100, kanin-anti-Nanog, 1:500; kanin-anti-POU klasse 5 homeobox 1 [OCT4], 1:500; kanin-anti-SRY-Box 2 [SOX2], 1:500; kanin-anti-Lin-28 homologe A [Lin28A], 1:400) (tabell over Materialer). Påfør antistoffer mot cellene og ruge ved 4 ° c over natten i et fuktet kammer.
  5. Kast den primære antistoff løsningen og vask lysbildene 3x i PBS.
  6. Påfør andre antistoffer (Alexa488-bøyd geit-anti-mus antistoff og Alexa555-bøyd geit-anti-kanin, 1:400 hver) i M.O.M. protein fortynningsmiddel på lysbilder og ruge for 45 min ved romtemperatur.
  7. Vask lysbildene 3x i PBS og Monter seksjoner med montering medium som inneholder 4 ' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  8. Ta bilder med et konfokalmikroskopi mikroskop.

7. gransker pluripotency av iPSCs in vivo

  1. Distansere iPSCs fra trinn 5,1 til enkeltceller ved hjelp av TVP-løsning i en 37 ° c inkubator med en fuktet atmosfære på 5% CO2 i 30 minutter.
  2. Count celler ved hjelp av en hemacytometer og sentrifuger på 217 x g i 3 min.
  3. Aspirer supernatanten og resuspend pellet med mES medium i et 1,5 mL sterilt sentrifugerør ved en konsentrasjon på 5 x 105 celler/30 μL for celle transplantasjon.
  4. Fjern hår fra begge bakbena på immunodeficient mus ved hjelp av hårklippere.
  5. Bedøve mus med ketamin (100 mg/kg) og rengjør injeksjonsstedet med 75% alkohol.
  6. Injiser 30 μL av iPSC fjæring fra trinn 7,3 intramuskulært inn i gastrocnemii ved hjelp av en 31 G nål.
  7. To uker etter injeksjon, høste musen gastrocnemii og legge inn i optimal skjæring temperatur (Oct) sammensatte, snap fryse og skåret i 5-μm seksjoner15,16.
  8. Fix seksjoner i 4% formaldehyd i 15 min ved romtemperatur, og deretter vaske lysbildene to ganger i PBS for 5 min hver gang.
  9. Blokker cellene med 5% geit serum protein fortynningsmiddel for 1 t ved romtemperatur.
  10. Legg fortynnet primære antistoff (kanin anti-AFP, 1:50; kanin anti-SMA, 1:50; kanin anti-TH, 1:50) til lysbildene og ruge ved 4 ° c over natten i et fuktet kammer.
  11. Kast den primære antistoff løsningen, vask cellene 3x (5 min/vask) i PBS, tilsett en 1:400 fortynnet Alexa555-bøyd geit-anti-kanin antistoff til lysbilder, og ruge for 45 min ved romtemperatur.
  12. Vask lysbilder 3x (5 min/vask) i PBS, og montere seksjoner med montering medium som inneholder DAPI.

8. bygging av CRISPR/Cas9 lentiviral vektor målretting introns flankerer dystrofingenet ekson 23

  1. Design to par gRNA oligos målretting Intronets opprinnelse-flankert dystrofingenet ekson 23 via http://crispor.tefor.net/crispor.py.
    Merk: de utformede parene er som følger:
    i22sense: 5 '-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA-3 '
    i22anti-Sense: 5 '-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3 '
    i23sense: 5 '-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT-3 '
    i23anti-Sense: 5 '-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3 ').
  2. Digest og dephosphorylate 5 μg av lentiviral CRISPR plasmider (Lenti-CRISPRv2-blast [en gave fra Mohan Babu] og Lenti-guide-Hygrotermometersensor-iRFP670 [en gave fra kristen Brennand]) (tabell over materialer) med BsmB1/Esp3I i 30 min ved 37 ° c. For 5 mikrogram plasmider, tilsett 3 μL av BsmB1 begrense enzym, 3 μL av rask alkalisk fosfatase, 6 μL av 10x enzym sammendrags buffer og 0,6 μL av 100 mM DTT i 60 μL reaksjon).
  3. Legg reaksjonene på en 0,8% agarose gel. Kjør gelen ved 100 − 150 V i 30 min.
  4. Rens fordøyd plasmider i-gel ved hjelp av et gel Extraction Kit (tabell av materialer) og eluere i 20 ΜL av H2O.
  5. Phosphorylate og anneal hvert par av gRNA-oligonukleotider som inneholder 1 μL av hver oligonukleotid ved 100 μM, 1 μL av 10x T4 ligation buffer, 0,5 μL av T4 polynucleotide kinase (PNK), 6,5 μL av ddH2O ved 37 ° c i 30 min, og deretter 95 ° c i 5 min og deretter rampe d egen til 25 ° c ved 5 ° c/min.
  6. Ombinde en 1:200 fortynning av glødet gRNA oligonukleotider inn i plentiCRISPR v2-blast eller plentiGuide-Hygrotermometersensor-iRFP670. Bland 50 ng av BsmB1/Esp3I fordøyd vektorer med 1 μL av fortynnet oligo duplex og 5 μL av 2x ligase buffer pluss 1 μL av ligase i et 11 μL reaksjons system og ruge i 10 min ved romtemperatur.
  7. Utfør transformasjon med 3 μL av ligation produkt inn i 50-og μL-kompetente celler (materialfortegnelsen) i henhold til produsentens anvisninger.
  8. Spre transformert kompetente celler i en agar plate med 100 μg/mL carbenicillin og ruge ved 31,5 ° c i 18 timer.
  9. Plukk kolonier med 10 μL steril pipette og kultur i 5 mL fantastisk buljong (tabell av materialer) inneholdende 100 μg/ml carbenicillin ved 31,5 ° c, 185 RPM i en shaker inkubator for 21 h.
  10. Rens plasmider DNA ved hjelp av mini-prep og MIDI-prep kits (tabell av materialer).
  11. Kontroller mini-prep plasmider ved begrensning fordøyelsen. For det 20 μL reaksjons system, tilsett 1 mikrogram plasmider DNA, 2 μL av sammendrags reaksjonsbuffer (tabell av materialer) og 1 μL av Begrensnings enzym blanding (0,5 ΜL av KPNI-HF og 0,5 ΜL av AGEI-HF for plentiCRISPR v2-blast-i22; 0,5 ΜL av NOTI-hf og 0,5 μL av ECORI-HF for plentiGuide-Hygrotermometersensor-iRFP670-i23). Ruge reaksjonssystemet i 1 time ved 37 ° c.
  12. Legg reaksjonene på en 0,8% agarose gel. Kjør gelen ved 100 − 150 V i 30 min.
    Merk: de riktige bandene for plentiCRISPR v2-blast-i22 bør være 622 BP og 12,2 KB, og de riktige bandene for plentiGuide-Hygrotermometersensor-iRFP670-i23 bør 2,6 KB og 7,1 kb.

9. Lentiviral vektor emballasje

  1. Kultur 7 x 105 293FT celler i 5 ml DMEM medier som inneholder 10% fosterets storfe serum i en 6 cm parabolen over natten på 37 ° c, 5% co2.
  2. Forbered en cocktail (1 μg av plentiCRISPR v2-blast-i22 eller plentiGuide-Hygrotermometersensor-iRFP670-i23, 750 ng av psPAX2 emballasje plasmider, 250 ng av pMD2. G konvolutt plasmider, og 5 μL av transfeksjoner reagens A [materialfortegnelsen] i 100 μL av redusert serum mem Media).
  3. Forbered en blanding av 5 μL av transfeksjoner reagens B (tabell av materialer) i 100 μL av redusert serum mem-medium.
  4. Tilsett 100 μL av transfeksjoner reagens B-blanding i plasmider blanding fra trinn 9,2 og ruge i 5 min ved romtemperatur.
  5. Tilsett DNA-lipid-komplekset (fra trinn 9,4) dråpevis til 293FT-cellene. Ruge over natten ved 37 ° c med 5% CO2.
  6. Legg til virus produksjon Enhancer (500x) (tabell av materialer) til hver tallerken neste dag og ruge for 24 timer ved 37 ° c, 5% co2.
  7. Samle medium fra celler ved hjelp av Pipetter på de neste to dagene, og Filtrer mediet gjennom et 0,45 μm-filter for å fjerne cellene.

10. konsentrasjon og rensing av lentiviral vektorer

  1. Utløse lentiviral vektor i mediet for trinn 9,7 over natten ved 4 ° c med 5x polyetylen glykol 4000 (PEG4000, 8,5% endelig konsentrasjon) og 4 M NaCl (0,4 M endelig konsentrasjon).
  2. Sentrifuger det viral media inneholder det PEG4000 løsning for 2 095 x g og 4 ° c for 30 min, fjerne og kaste supernatanten.
  3. Resuspend pellets med 500 μL av serum redusert MEM Media (lentivirus titer: Lenti-CRISPR v2-gRNAi22:1,56 x 108, Lenti-IRFP670-gRNAi23:1,3 x 108, Lenti-CRISPR V2-kontroll: 3,13 x 107, lenti-iRFP670-kontroll: 5,9 x 107 ). Oppbevares ved-80 ° c til bruk.

11. sletting av ekson 23 i mus iPSCs med to guide RNAs (gRNAs) kombinert med Cas9

  1. Plate musen iPSCs fra trinn 4,5 i en 24-brønn plate belagt med fibronektin og gelatin.
  2. Etter at cellene nå 50% samløpet, bytte til fersk kultur medium (komplett mus embryonale stilk cellen vekstmedium) inneholder 8 μg/mL polybrene).
  3. Tilsett 100 μL av lentiviral partikkel løsning fra trinn 10,3 inkludert Lenti-CRISPR v2-gRNAi22, Lenti-iRFP670-gRNAi23 og kontroll (tom vektor: Lenti-CRISPR v2, Lenti-iRFP670) til mus iPSCs. Ruge celler i 3 dager ved 37 ° c med 5% CO2.
  4. Velg stabilt infiserte celler med medium som inneholder 2,5 μg/mL blasticidin og 100 μg/mL hygromycin B ved å bestemme den minste konsentrasjonen av blasticidin og hygromycin B som kreves for å drepe den un-infiserte cellen.
    Merk: un-infiserte celler ville bli drept av blasticidin og hygromycin B.
  5. Fordøye den valgte musen iPSCs med 0,5 mL TVP oppløsning hver brønn (24-brønn plate) og ruge celler i 30 min ved 37 ° c med 5% CO2.
  6. Distansere den iPSCs til enkeltceller ved pipettering, telle celler med en celle telling kammer og deretter fortynne om 150 fordøyd enkeltceller med mES medium i 10 cm parabol for kultur ved 37 ° c med 5% CO2.
  7. Etter ca. 10 dager, Velg enkelt kolonier under et omvendt mikroskop med 10 μL sterile pipette (96 kolonier må plukkes).
  8. Overfør de plukkede koloniene til 50 μL av TVP-løsning hver brønn (96-brønn plate, en koloni hver brønn), fordøye på 37 ° c i 30 min, og deretter seedet de fordøyd cellene til 2 96-brønn kultur plater for å holde kulturen (en for genotyperingteknologi).
  9. Ruge i en CO2 inkubator ved 37 ° c til 70% confluent.

12. identifisering av iPSC kolonier med exon23 sletting

  1. Fjern mediet i 96-brønn plate når celle koloniene nå 70% samløpet.
  2. Tilsett 25 μL av lyse Rings reagens (tabell med materialer) som inneholder proteinase k-løsning (1 ml proteinase k i 100 ml lyse Rings reagens) til hver brønn, og Overfør lysat til en 96-brønn PCR-plate.
  3. Forsegle PCR-platen og ruge platene ved 55 ° c i 30 min, og deretter ved 95 ° c i 45 min for å lyse cellene og denaturere proteinase K.
  4. Utfør PCR-reaksjon med 2 μL av lysat fra trinn 12,3. For den 20 μL PCR-reaksjonen, tilsett 2 μL lysat, 10 μL av 2x DNA-polymerase Premix (tabell av materialer), 7 μL av DNase-fritt vann, og 1 ΜL av DMD ekson 23 primere (tabell 1).
  5. Bruk følgende parametre for PCR-reaksjonen: 98 ° c i 1 min, 35 sykluser på 98 ° c i 10 s, 60 ° c i 15 s, 72 ° c i 30 s, og en endelig utvidelse ved 72 ° c i 1 min.
  6. Last PCR-reaksjonen på en 2% agarose gel. Kjør gelen ved 100 − 150 V i 30 min.
  7. Inspiser gelen under UV-lys (knockout effektivitet er 3/94).

13. bruke tet-on MyoD Aktivisering system for å direkte differensiere iPSC i myogenic stamceller (MPC)

  1. Pakk LV-TRE-VP64-Mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 og LV-TRE-VP16 Mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 (en gave fra Charles Gersbach) (tabell over materialer) som tidligere beskrevet for Lenti-CRISPRv2-blast og Lenti-GRNA-iRFP670 vektorer i seksjoner 9 og 10.
  2. Infisere muse iPSC med lentivirus-TRE-VP64-MyoD-T2A-dsRed-Express2 eller lentivirus-TRE-VP16-MyoD-T2A-dsRedExpress2 som tidligere beskrevet for Lenti-CRISPRv2-blast og Lenti-gRNA-iRFP670 vektorer i trinn 11.1 − 11.3.
  3. Velg celler med 1 μg/mL puromycin etter tre dager med infeksjon for å få en ren transduced cellepopulasjon.
  4. Tilsett 3 μg/mL Doxycycline i kultur Media (10% FBS DMEM) til MPC differensiering. Bytt ut friskt medium supplert med Doxycycline annenhver dag.

14. kvantitativ omvendt transkripsjon PCR for å evaluere dynamisk muskel differensiering og DMD ekson 22-24 uttrykk

  1. Pakk Cellular RNA etter 0, 3, 6 og 10 dager etter Doxycycline behandling ved hjelp av RNA isolasjons reagens, reversely transkribere RNA i cDNA ved hjelp av første strand cDNA syntese Kit (tabell av materialer).
  2. For det 20 μL qPCR reaksjons system, tilsett 1 μL av cDNA, 10 μL av PCR reaksjonsbuffer (tabell av materialer), 8 ΜL av DNA H2O, og 1 μL av blanding av forover og revers primere (glyceraldehyde-3-fosfat dehydrogenase [GAPDH], skjelettlidelser muskel [ACTA1], OCT4 og DMD exon22, DMD exon23 og DMD exon24, se tabell 1).
  3. Bruk følgende parametre for PCR-reaksjonen: 50 ° c i 2 min, 95 ° c i 2 min, 40 sykluser på 95 ° c i 15 s, 60 ° c i 1 min, smelte kurve 65,0 ° c til 95,0 ° c, øke 0,5 ° c.

15. Immunofluorescence farging av myosin tung kjede 2 (MYH2) og dystrofingenet protein uttrykk

  1. Plate Doxycycline-indusert, Lenti-TRE-MyoD modifiserte celler fra trinn 13,4 til 8-brønn kultur lysbilder.
  2. Fix celler i 4% formaldehyd i 15 min ved romtemperatur, og deretter vaske lysbildene to ganger i PBS for 5 min hver gang.
  3. Blokker cellene med 5% geit serum protein fortynningsmiddel for 1 t ved romtemperatur.
  4. Legg kanin-anti-dystrofingenet antistoff (1:300) og mus-anti-MYH2 antistoff (1:100) til lysbildene, ruge ved 4 ° c over natten i et fuktet kammer.
  5. Kast den primære antistoff løsningen, vask cellene 3x (5 min/vask) i PBS, tilsett 1:400 fortynnet Alexa488-bøyd geit-anti-kanin antistoff og Alexa555-bøyd geit-anti-mus antistoff til lysbilder, og ruge for 45 min ved romtemperatur.
  6. Vask lysbildene 3x (5 min/vask) i PBS, og Monter seksjoner med festemiddel som inneholder DAPI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etablering av DMDMDX hud fibroblaster avledet IPSC. Vi demonstrerte effektiviteten av å generere musen iPSCs fra DMDMDX mus avledet hud Fibroblast ved hjelp av integrering-fri omprogrammering vektorer. Figur 1a viste at utseendet på embryonale stamceller (ESC)-lignende kolonier på tre uker etter smitte. Vi evaluerer effektiviteten til iPSC induksjon ved Live alkalisk fosfatase (AP) beis; Figur 1B viser at prosentandelen av AP-positive celler var rundt 1,8% av FACS analyse. SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 og SOX2, pluripotency markører for mus embryonale stamceller, var positive for iPSC kolonier ved immunofluorescent farging, (figur 1C). For å undersøke de tre germline differensiering av iPSCs in vivo, intramuskulært vi injisert iPSCs inn i musen gastrocnemii. Vi observerte at injisert iPSCs differensiert i leverceller (endoderm), glatt muskelceller (mesoderm), og adrenerge Nevron celler (ektoderm) (figur 1d), anklage pluripotency av iPSCs.

CRISPR/Cas9-mediert exon23 sletting. Vi designet to guide RNAs som flanke den muterte ekson 23. Etter Cas9-mediert dobbel-strandet pauser (DSB) og ikke-homologe ende sammenføyning (NHEJ), mutant ekson 23 ble slettet, noe som åpner for avkortet men funksjonell dystrofingenet produksjon (figur 2a). For å identifisere ekson 23 slettet mus iPSC, celler var tynt sådd, og individuelle kolonier ble plukket og spredte. Genomisk DNAs utvunnet fra disse koloniene ble utsatt for PCR-genotyperingteknologi. Figur 2b viste at koloni #1 og #2 har ekson 23 slettinger som indikerer en vellykket sletting av ekson 23.

Differensiering musen iPSCs inn i en myogenic avstamning og gjenopprette dystrofingenet uttrykk. Vi bruker et Tetracycline-induserbart MyoD uttrykks system for å indusere myogenic differensiering av iPSCs. Doxycycline ble brukt til å indusere MyoD uttrykk i iPSCs. Figur 3a viser tiden løpet av muskel differensiering i dox-behandlet iPSCs. qRT-PCR viste at mRNA-nivået på OCT4, en pluripotent markør, gradvis sank, mens uttrykket for ACTA1, en Skjelettmuskel markør, økte etter dox induksjon. Også observerte vi myotubes formasjon på to uker etter dox behandling (figur 3b). Viktigere, qRT-PCR analysen viste utvinning av DMD ekson 24 mRNA uttrykk i dox-indusert, Cas9-mediert Exon23 slettet linje i forhold til Cas9-kontroll linje (figur 3c). Inkonsekvent med qRT-PCR, immunofluorescent farging viser dystrofingenet protein expressionin Cas9-mediert ekson 23 slettede celler, mens dystrofingenet uttrykket var fraværende i kontroll celler (figur 3D).

Figure 1
Figur 1: omprogrammering hud fibroblaster fra DMDMDX mus til iPSCs.
(A) representativt bilde av es-lignende kolonier (skala bar = 200 μm). (B) FACS analyse av omprogrammering effektiviteten av musen hud fibroblaster i iPSCs etter 8 dager av Sendai virus Transduction av Live Ap farging. (C) Immunofluorescent FARGING av SSEA1, Lin28, Nanog, OCT4 og SOX2 i iPSCs (skala bar = 50 μm). (D) Immunofluorescent FARGING for AFP (endoderm), sma (mesoderm), og tyrosin HYDROLASE (th) (ektoderm) av teratoma 2 uker etter IPSC injeksjon i gastrocnemii (skala bar = 20 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: CRISPR/Cas9-mediert exon23 sletting.
(A) skjematisk diagram av CRISPR/Cas9-mediert ekson 23 slettinger. Cas9 nuklease mål Intronets opprinnelse 22 og Intronets opprinnelse 23 av to gRNAs. Dobbel-strandet pauser (DSBs) ved Cas9 resulterer i fjerning av mutant ekson 23. De ikke-homologe endene blir reparert ved at det ikke er en slutt sammenføyning (NHEJ), noe som resulterer i restaureringen av lese RAM men til det dystrofingenet genet. (B) PCR genotyperingteknologi analyse av ekson 23. Pilen indikerer PCR-produktet av ekson 23. GAPDH fungerer som en referanse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: skille musen iPSCs inn i myogenic avstamning og gjenopprette dystrofingenet uttrykk.
(A) QRT-PCR viste tiden løpet av mRNA nivå på OCT4 og ACTA1 i dox-behandlet ekson 23-deleted DMDMDX iPSC (* P < 0,05 vs D0, D6, d10, #P < 0,05 vs D0, d3, D10, $P < 0,05 vs D0, D3, D6, n = 4 for Oct4) (* P < 0,05 vs D6 og D10 , #P < 0,05 vs D0, D3, og D10, $P < 0,05 vs D0, D3 og D6, n = 3 for ACTA1). (B) venstre: representativt bilde av myotube formasjon fra dox-indusert mus iPSCs (skala bar = 200 μm). Høyre: Immunofluorescent analyse av MYH2 i myotube formasjon fra dox-indusert mus iPSCs (skala bar = 20 μm). (C) øvre: PCR primer POSISJONENE for DMD Exon22, Exon23 og Exon24; Bunn: qRT-PCR analyse av mRNA nivået av DMD Exon22, Exon23, og Exon24 uttrykk i MPC (* * * * P < 0,0001, n = 3). (D) Immunofluorescent analyse av dystrofingenet uttrykk i dox-indusert MPC fra IPSCCas9-CTRL og IPSCCas9-gRNA (skala bar = 50 μm). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Guide primere
i22 følelse 5 '-CACCGTTAAGCTTAGGTAAAATCAA-3 '
i22 antisens 5 '-AAACTTGATTTTACCTAAGCTTAAC-3 '
i23 følelse 5 '-CACCGAGTAATGTGTCATACCTTCT-3 '
I23 antisens 5 '-AAACAGAAGGTATGACACATTACTC-3 '
PCR-primere
OCT4-forover 5 '-AGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCA-3 '
OCT4-revers 5 '-TCTCATTGTTGTCGGCTTCCTCCA-3 '
ACTA1-forover 5 '-GATCCATGAGACCACCTACAAC-3 '
ACTA1-revers 5 '-TCAGCGATACCAGGGTACAT-3 '
Exon22-forover 5 '-TTACCACCAATGCGCTATCA-3 '
Exon22-revers 5 '-CCGAGTCTCTCCTCCATTATTTC-3 '
Exon23-forover 5 '-CCAAGAAAGCACCTTCAGAAATATG-3 '
Exon23-revers 5 '-TTTGGCAGCTTTCCACCA-3 '
Exon24-forover 5 '-AAC CTT ACA GAA ATG GAT GGC-3 '
Exon24-revers 5 '-TTTCAGGATTTCAGCATCCC-3 '
GAPDH-fremover 5 '-TGACAAGCTTCCCATTCTCG-3 '
GAPDH-omvendt 5 '-CCCTTCATTGACCTCAACTACAT-3 '

Tabell 1: primer sekvens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) er en destruktiv og til syvende og sist dødelig arvelig sykdom preget av mangel på dystrofingenet, fører til progressiv muskel atrofi1,2. Våre resultater viser den restaurerte dystrofingenet genuttrykk i DMDMDX IPSC-avledet myogenic stamceller ved TILNÆRMINGEN av CRISPR/Cas9-mediert exon23 sletting. Denne tilnærmingen har tre fordeler.

Først genererte vi iPSCs fra DMDMDX mus-avledet dermal fibroblaster ved hjelp av en ikke-integrert RNA vektor. En rekke metoder er utviklet for å generere iPSCs, slik som lentiviral og retroviral vektorer, som vil integreres i vert kromosomer å uttrykke omprogrammering gener, og dermed bærende sikkerhet bekymringer. DNA-baserte vektorer som plasmider vektorer, adeno-assosiert virus og adenoviruses finnes i en ikke-integrert måte; de kan imidlertid fortsatt integreres i verts-kromosom på en lav frekvens. I denne studien, brukte vi en modifisert, ikke-smittsomme Sendai virus, en ikke-integrert RNA vektor, til trygt og effektivt levere stilk cellen transkripsjon faktorer å fibroblaster for omprogrammering.

Deretter bruker vi CRISPR-mediert Genova sletting, snarere enn CRISPR/Cas9-mediert presisjon gen korreksjon, for å gjenopprette dystrofingenet uttrykk i iPSCs. Denne metoden er gjennomførbart og effektiv; Det er lett å designe flere gRNAs å slette flere mutant exoner, som forekommer i mange menneskelige DMD pasienter17. Ekson sletting utnytter en relativt effektiv ikke-homologe ende sammenføyning sti, og metoden også unngår behovet for å levere en DNA reparasjon mal. Derfor, i forhold til Cas9-mediert presisjon korreksjon, Cas9-mediert ekson sletting er egnet for DMD pasienter med flere genmutasjoner.

Til slutt, indusert vi udifferensierte iPSCs inn myogenic stamceller, som kan redusere risikoen for tumorigenesis forårsaket av iPSCs. I denne protokollen, induserte vi MyoD uttrykk via en induserbart Tetracycline-regulert (tet-on) vektor system for å differensiere iPSCs i skjelettlidelser muskel forfedre18,19.

I konklusjonen, kombinasjonen av CRISPR/Cas9 Genova redigering med tet-on MyoD aktiveringssystem kan gi en trygg, gjennomførbart og effektiv strategi for mutant DMD-Exon23 sletting i stamceller for celle transplantasjon i DMD pasienter.

For å velge og høste ES-lignende celler effektivt, bør vi identifisere de udifferensierte iPSC-cellene via deres kuppel-lignende morfologi, og en håndskrift objekt markør kan hjelpe oss med å merke individuelle kloner fra bunnen av kultur fatet med en 1,8 mm sirkel rundt iPSC Kloner. For å unngå lekkasje av Trypsin løsning, må vi bruke fett jevnt til bunnen av ringene. Også, etter å plassere fett belagte ringene på toppen av merket celle kolonier, forsiktighet bør utvises ikke å berøre ringene. Ellers vil iPSC kloner bli løsrevet.

Protokollen har sine begrensninger; for eksempel valgte vi et ikke-integrert RNA vektor system for å generere iPSCs. Men vi brukte en lentiviral CRISPR/Cas9 system for å slette DMD ekson 23 og et lentiviral-basert MyoD aktiveringssystem for å indusere iPSC myogenic differensiering; disse integrerende lentiviral vektorer har sikkerhet bekymringer. Imidlertid kan disse problemene løses ved anvendelsen av en ribonucleoprotein (RNP) kompleks bestående av en rekombinant, høy renhet S. pyogenes Cas9 nuklease med en crRNA: tracrRNA duplex; Vi kan velge kjemisk modifisert MyoD mRNA transfeksjoner å skille direkte iPSCs inn myogenic forfedre, selv om effektiviteten kan være utfordrende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Tang og Weintraub ble delvis støttet av NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical Instruments
31-gauge needle Various 
Sharp Incision Various 
Sterile Scalpels Various 
Tweezers Various 
Fibroblast medium (for 100 mL of complete medium) Company Catalog Number Volume
2-Mercaptoethanol (55 mM) Gibco 21-985-023 0.1 mL
Antibiotic Antimycotic Slution 100x CORNING MT30004CI 1 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose SIGMA D6429 87 mL
Fetal Bovine Serum Characterized HyClone SH30396.03 10 mL
L-Glutamine solution SIGMA G7513 1 mL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)  Gibco 11140076 1 mL
TVP solution (for 500 mL of complete solution) Company Catalog Number Volume
Chicken Serum Gibco 16110-082 5 mL
EDTA Sigma-Aldrich E6758 186 mg
Phosphat-buffered saline to 500 mL
Trypsin (2.5%) Thermo 15090046 5 mL
mES growth medium(for 500 mL of complete solution) Company Catalog Number Volume
2-Mercaptoethanol (55 mM) Gibco 21-985-023 0.5 mL
Antibiotic Antimycotic Slution 100x CORNING MT30004CI 5 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose SIGMA D6429 408.5 mL
Fetal Bovine Serum Characterized HyClone SH30396.03 75 mL
L-Glutamine solution SIGMA G7513 5 mL
Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL EMD Millipore Corp CS210511 500 μL
MEK/GS3 Inhibitor Supplement EMD Millipore Corp CS210510-500UL 500 μL
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)  Gibco 11140076 5 mL
The ES cell media should not be stored for more than 4 weeks and with inhibitors not more than 2 weeks.
mES frozen medium(for 50 mL of complete solution) Company Catalog Number Volume
Dimethyl sulfoxide (DMSO) SIGMA D2650 5 mL
Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose SIGMA D6429 24.9 mL
Fetal Bovine Serum Characterized HyClone SH30396.03 25 mL
Mouse recombinant Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0.5 x 106 U/mL EMD Millipore Corp CS210511 50 μL
Name of Material/ Equipment Company Catalog Number RRID
0.05% Trypsin/0.53 mM EDTA CORNING 25-052-CI
4% Paraformaldehyde Thermo scientific J19943-k2
Accutase solution SIGMA A6964 Cell detachment solution
AgeI-HF NEB R3552L
Alexa488-conjugated goat-anti-mouse antibody Invitrogen A32723 AB_2633275
Alexa488-conjugated goat-anti-rabbit antibody Invitrogen A32731 AB_2633280
Alexa555-conjugated goat-anti-rabbit antibody Invitrogen A32732 AB_2633281
anti-AFP Thermo scientific RB-365-A1 AB_59574
anti-α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP CST 19245S AB_2734735
anti-Dystrophin Thermo PA5-32388 AB_2549858
anti-LIN28A (D1A1A) XP    CST 8641S AB_10997528
anti-MYH2 DSHB mAb2F7 AB_1157865
anti-Nanog-XP CST 8822S AB_11217637
anti-Oct-4A (D6C8T) CST 83932S AB_2721046
anti-Sox2 abcam ab97959 AB_2341193
anti-SSEA1(MC480)  CST 4744s AB_1264258
anti-TH (H-196) SANTA CRUZ  sc-14007 AB_671397
Alkaline Phosphatase Live Stain (500x) Thermo A14353
Blasticidin S Sigma-Aldrich 203350
BsmBI/Esp3I NEB R0580L/R0734L
Carbenicillin Millipore 205805-250MG
Collagenase IV  Worthington Biochemical Corporation LS004189
Competent Cells TakaRa 636763
CutSmart  NEB B7204S
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo A16517
DirectPCR Lysis Reagent (cell) VIAGEN BIOTECH 302-C
Dispase (1 U/mL) STEMCELL Technologies 7923
Doxycycline Hydrochloride Fisher BioReagents BP26535
EcoRI-HF NEB R3101L
Fibronectin bovine plasma SIGMA F1141
 
QIAEX II Gel Extraction Kit (500)		 QIAGEN 20051
Gelatin from porcine skin, type A SIGMA G1890
HardSet Antifade Mounting Medium with DAPI Vector H-1500
Hygromycin B (50 mg/mL) Invitrogen 10687010
Ketamine HCL Injection HENRY SCHEIN ANIMAL HEALTH 45822
KpnI-HF NEB R3142L
lenti-CRISPRv2-blast Addgene 83480
lenti-Guide-Hygro-iRFP670 Addgene 99377
Lipofectamin 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000015
LV-TRE-VP64-mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2   Addgene 60625
LV-TRE-VP16 mouse MyoD-T2A-dsRedExpress2 Addgene 60626
Mouse on Mouse (M.O.M.) Basic Kit Vector BMK-2202
NotI-HF NEB R3189L
Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher 31985070
Polyethylene glycol 4,000 Alfa Aesar AAA161510B
Polybrene SIGMA TR1003
Corning BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin Culture Slide CORNING CB354688
PowerUp SYBR Green Master Mix ThermoFisher A25742
PrimeSTAR Max Premix TakaRa R045
Proteinase K VIAGEN BIOTECH 507-PKP
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals ICN19453980
qPCR Lentivirus Titration Kit abm LV900
Quick ligation kit NEB M2200S
QIAprep Spin Miniprep Kit (250) QIAGEN 27106
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit (100) QIAGEN 12945
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo scientific K1691
RNAzol RT Molecular Research Center, INC RN 190
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S
T4 Polynucleotide Kinase NEB M0201S
Terrific Broth Modified Fisher BioReagents BP9729-600
ViralBoost Reagent (500x) ALSTEM VB100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of Neurology. 71 (3), 304-313 (2012).
  2. Batchelor, C. L., Winder, S. J. Sparks, signals and shock absorbers: how dystrophin loss causes muscular dystrophy. Trends Cell Biology. 16 (4), 198-205 (2006).
  3. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  4. Bengtsson, N. E., Seto, J. T., Hall, J. K., Chamberlain, J. S., Odom, G. L. Progress and prospects of gene therapy clinical trials for the muscular dystrophies. Human Molecular Genetics. 25 (R1), R9-R17 (2016).
  5. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351 (6271), 407-411 (2016).
  6. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 400-403 (2016).
  7. Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351 (6271), 403-407 (2016).
  8. Long, C., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345 (6201), 1184-1188 (2014).
  9. El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circulation Research. 121 (8), 923-929 (2017).
  10. Amoasii, L., et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 362 (6410), 86-91 (2018).
  11. Eisen, B., et al. Electrophysiological abnormalities in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes generated from Duchenne muscular dystrophy patients. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (3), 2125-2135 (2019).
  12. Marion, R. M., et al. Telomeres acquire embryonic stem cell characteristics in induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 4 (2), 141-154 (2009).
  13. Dumont, N. A., et al. Dystrophin expression in muscle stem cells regulates their polarity and asymmetric division. Nature Medicine. 21 (12), 1455-1463 (2015).
  14. Sacco, A., et al. Short telomeres and stem cell exhaustion model Duchenne muscular dystrophy in mdx/mTR mice. Cell. 143 (7), 1059-1071 (2010).
  15. Su, X., et al. Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Visualized Experiments. (146), (2019).
  16. Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 412-419 (2018).
  17. Ousterout, D. G., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nature Communications. 6, 6244 (2015).
  18. Barde, I., et al. Efficient control of gene expression in the hematopoietic system using a single Tet-on inducible lentiviral vector. Molecular Therapy. 13 (2), 382-390 (2006).
  19. Glass, K. A., et al. Tissue-engineered cartilage with inducible and tunable immunomodulatory properties. Biomaterials. 35 (22), 5921-5931 (2014).

Tags

Utviklingsbiologi indusert Pluripotent stamceller iPSC CRISPR/Cas9 DMD dystrofingenet myogenic stamfar differensiering
CRISPR/Cas9 teknologi i gjenopprette Dystrofingenet uttrykk i iPSC-avledet Muscle forfedre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jin, Y., Shen, Y., Su, X.,… More

Jin, Y., Shen, Y., Su, X., Weintraub, N., Tang, Y. CRISPR/Cas9 Technology in Restoring Dystrophin Expression in iPSC-Derived Muscle Progenitors. J. Vis. Exp. (151), e59432, doi:10.3791/59432 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter