Summary

Chirurgische grootte vermindering van zebravis voor de studie van het embryonale patroon schrapen

Published: May 03, 2019
doi:

Summary

Hier beschrijven we een methode om de grootte van zebravis embryo’s te verkleinen zonder de normale ontwikkelingsprocessen te verstoren. Deze techniek maakt de studie van het patroon schalen en ontwikkelingsstoornissen robuustheid tegen grootte te veranderen.

Abstract

In het ontwikkelingsproces, vertonen de embryo’s een opmerkelijke capaciteit om hun lichaams patroon aan hun lichaamsgrootte te passen; hun lichaamsdeel wordt gehandhaafd, zelfs in embryo’s die groter of kleiner zijn, binnen bepaalde grenzen. Hoewel dit fenomeen van de schaalvergroting heeft de aandacht getrokken voor meer dan een eeuw, het begrijpen van de onderliggende mechanismen is beperkt, deels als gevolg van een gebrek aan kwantitatieve beschrijving van de ontwikkelingsdynamiek in embryo’s van verschillende grootte. Om deze beperking te overwinnen, ontwikkelden we een nieuwe techniek om chirurgisch de grootte van zebravis embryo’s te verminderen, die grote voordelen hebben voor in vivo Live Imaging. Wij tonen aan dat na een evenwichtige verwijdering van cellen en dooier in de blastula fase in afzonderlijke stappen, embryo’s snel kunnen herstellen onder de juiste omstandigheden en zich ontwikkelen tot kleinere, maar anders normale embryo’s. Aangezien deze techniek geen speciale apparatuur nodig heeft, is het gemakkelijk aanpasbaar, en kan worden gebruikt om een breed scala van schaling problemen studie, met inbegrip van robuustheid van morphogen gemedieerde patroon.

Introduction

Wetenschappers weten al lang dat embryo’s een opmerkelijke mogelijkheid hebben om constante lichaamsverhoudingen te vormen, hoewel de embryo grootte sterk kan variëren, zowel onder natuurlijke als experimentele omstandigheden1,2,3. Ondanks decennia van theoretische en experimentele studies, blijft deze robuustheid aan grootte variatie, genoemd het schrapen, en zijn onderliggende mechanismen onbekend in vele weefsels en organen. Om de dynamiek van het ontwikkelingssysteem direct vast te leggen, hebben we een reproduceerbare en eenvoudige grootte reductie techniek in zebravis4, die het grote voordeel in in vivo Live Imaging5heeft.

Zebravis heeft gediend als een model gewervelde dier om meerdere disciplines van de biologie studie, met inbegrip van ontwikkelingsbiologie. In het bijzonder, zebravis is ideaal voor in vivo Live Imaging6 omdat 1) ontwikkeling kan normaal te werk gaan buiten de moeder en de eierschaal, en 2) de embryo’s zijn transparant. Bovendien zijn de embryo’s bestand tegen temperatuur-en milieu fluctuaties, waardoor ze in laboratoriumomstandigheden kunnen worden bestudeerd. Ook, in aanvulling op conventionele genexpressie verstoring door morpholino en mRNA injectie7,8, recente vooruitgang in de Crisper/Cas9 technologie heeft omgekeerde genetica in zebravis zeer efficiënte9. Bovendien kunnen vele klassieke technieken in embryologie, zoals cel transplantatie of weefsel chirurgie worden toegepast4,10,11.

De de verminderings technieken werden van de grootte oorspronkelijk ontwikkeld in amfibie en andere niet-gewervelde dieren12. Bijvoorbeeld, in Xenopus laevis, een ander populair gewervelde dierlijk model, Bisectie langs de dierlijk-plantaardige as in blastula stadium kan grootte-verminderde embryo’s12,13produceren. Echter, in onze handen deze One-Step benadering resulteert in dorsale of ventralized embryo’s in zebravis, vermoedelijk omdat dorsale determinanten ongelijk verdeeld en men kan niet weten wat hun lokalisatie van de morfologie van embryo’s. Hier tonen we een alternatieve twee-staps hakken techniek voor zebravis die normaal ontwikkelt, maar kleinere embryo’s produceert. Met deze techniek worden cellen voor het eerst verwijderd uit de dierlijke pool, een gebied van naïeve cellen ontbreekt in organisator activiteit. Om de hoeveelheid dooier en cellen in evenwicht te brengen, die voor epiboly en verdere morfogenese belangrijk is, wordt de dooier dan verwijderd. Hier, we detail dit protocol en bieden twee voorbeelden van grootte onveranderlijkheid in patroonvorming; Somiet vorming en buik neurale buis patroon. Gecombineerd met kwantitatieve beeldvorming, gebruikten we de grootte reductie techniek om te onderzoeken hoe de grootte van somieten en neurale buis worden beïnvloed in grootte verminderde embryo’s.

Protocol

Alle met de visserij verband houdende procedures werden uitgevoerd met de goedkeuring van de institutionele Commissie van het Dierzorg en van het gebruik (DEC) bij de medische school van Harvard. 1. voorbereiding van gereedschap en reagens Maak een draad lus om embryo’s te hakken Neem 20 cm roestvrijstalen draad die stijf en niet corrosief is met een diameter van 40 μm. Loop de draad door in glas capillaire (1,0 mm buitendiameter, 0,5 mm …

Representative Results

Dooier volume reductie is belangrijk voor de normale morfologieZoals onlangs beschreven in Almuedo-Castillo et al.17, kan de grootte vermindering van embryo’s worden bereikt zonder het volume van de dooier te verminderen. Om te vergelijken met en zonder dooier volume reductie, voerden we zowel twee-Step hakken (zowel blastula en dooier) en blastula-only hakken (Figuur 2 en supplementaire film 1). In twee stappen gehakte embryo’s b…

Discussion

Historisch, onder gewervelde dieren, is de grootte vermindering hoofdzakelijk uitgevoerd gebruikend amfibie embryo’s, door de embryo’s langs dierlijk-plantaardige as in een blastula stadium12te doorsnijdt. Echter, er zijn voornamelijk twee verschillen tussen kikker en zebravis embryo’s als we bisect embryo’s. Eerst, in het stadium wanneer de zebravis embryo’s tolerant van doorsnijdt (blastula stadium) worden, wordt de organisator gevestigd in een beperkt gebied van bla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het werk werd ondersteund door het PRESTO-programma van het Japan Science and Technology Agency (JPMJPR11AA) en een nationale instituten van Health Grant (R01GM107733).

Materials

60 mm PYREX Petri dish CORNING  3160-60
Agarose affymetrix 75817 For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A SIGMA-ALDRICH A0701-25G
CaCl2 EMD CX0130-1 For 1/3 Ringer's solution
CaSO4 For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) CORNING 2845-25
Disposable Spatula VWR  80081-188
Foam board ELMER'S 951300 For microscope incubator
Forcept (No 55) FST 11255-20
Glass pipette VWR 14673-043
HEPES SIGMA Life Science H4034 For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators INCUBATOR Warehouse.com For microscope incubator
Instant sea salt Instant Ocean 138510 For egg water
KCl SIGMA-ALDRICH P4504 For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose SIGMA-ALDRICH M0387-100G
NaCl SIGMA-ALDRICH S7653 For 1/3 Ringer's solution
Petri dish Falcon 351029 For making a mount for live imaging
Phenol red SIGMA Life Science P0290
Pipette pump BEL-ART PRODUCTS F37898
Pronase EMD Millipore Corp 53702-250KU
Tricaine-S (MS222) WESTERN CHEMICAL INC NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires Sandra The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.

References

  1. Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
  2. Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
  3. Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
  4. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
  5. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
  6. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
  7. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  8. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
  9. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
  11. Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
  12. Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
  13. Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann’s organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
  14. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
  15. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  17. Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
  18. Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
  19. Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
  20. Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
  21. Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).

Play Video

Cite This Article
Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z. M., Megason, S. G. Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling. J. Vis. Exp. (147), e59434, doi:10.3791/59434 (2019).

View Video