Summary

胚性パターンスケーリングの研究のためのゼブラフィッシュの外科的サイズ縮小

Published: May 03, 2019
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Summary

ここでは、通常の発達過程を妨げずにゼブラフィッシュの胚のサイズを小さくする方法について述べる。この手法により、サイズ変更に対するパターンのスケーリングと開発の堅牢性の検討が可能になります。

Abstract

発達過程において、胚は体のサイズに自分の体のパターンを一致させる顕著な能力を示す。それらの体の割合は、特定の限界内で、より大きいか、またはより小さい胚においてさえ維持される。このスケーリングの現象は1世紀以上にわたって注目されてきたが、様々なサイズの胚における発達力学の量的記述不足のために、根底にあるメカニズムを理解することは限定的であった。このような制約を克服するため、ゼブラフィッシュの胚のサイズを外科的に減少させる新しい手法を開発し、生体内ライブイメージングに大きな利点を持っています。我々は、別のステップで胞胚段階で細胞および卵黄を平衡除去した後、胚が適切な条件下で迅速に回復し、より小さいがそれ以外の場合は正常な胚に成長することを実証する。この技術は特別な装置を必要としないので、それは容易に適応可能であり、morphogen によって媒介されるパターン化の強さを含むスケールの問題の広い範囲を研究するのに使用することができる。

Introduction

科学者たちは、胚の大きさは、自然と実験的な条件1,2,3の下で大きく異なるが、一定の体の割合を形成する顕著な能力を持っていることを長い間知られています。数十年にわたる理論的および実験的研究にもかかわらず、このようなサイズ変動に対する頑健性は、スケーリングと呼ばれ、多くの組織や器官においてその根底にあるメカニズムは未知のままである。現像システムのダイナミクスを直接捕捉するために、ゼブラフィッシュ4において再現性がありかつ単純なサイズ低減技術を確立し、これは生体内ライブ撮像5において大きな利点を有する。

ゼブラフィッシュは、発生生物学を含む生物学の複数の学問分野を研究するためのモデル脊椎動物として役立ってきた。特に、ゼブラフィッシュは生体内ライブ撮像6にとって理想的であるので 1) 開発は母と卵殻の外で正常に進行でき、そして 2) 胚は透明である。さらに、胚は、それらが実験室条件で研究されることを可能にするいくつかの温度および環境変動に耐えることができる。また、モルホリノや mRNA 注入7,8による従来の遺伝子発現摂動に加え、近年の CRISPR/Cas9 技術の進歩により、ゼブラフィッシュにおける逆遺伝学が極めて効率的な9となっている。さらに、細胞移植または組織手術などの発生学における多くの古典的技術を、41011に適用することができる。

サイズ低減技術は、両生類および他の非脊椎動物12で元々開発された。例えば、アフリカツメガエルガエルにおいて、他の一般的な脊椎動物モデルでは、胞胚段階で動物植物軸に沿って公知は、サイズ減少した胚12,13を作り出すことができる。しかし、私たちの手の中でこのワンステップのアプローチは、dorsalized または ventralized の胚が不均一に分布しており、胚の形態からの局在を知ることができないためであると考えられます。ここでは、通常発達しているがより小さな胚を生成するゼブラフィッシュのための代替の2段階のチョッピング技術を示す。この技術によって、細胞は最初に動物の極から、オーガナイザーの活動に欠けているナイーブな細胞の領域から取り除かれます。Epiboly とその後の形態形成に重要な卵黄と細胞の量のバランスをとるために、卵黄を除去する。ここでは、このプロトコルについて詳しく説明し、パターン形成におけるサイズ不変性の2つの例を示します。somite 形成と腹部神経管のパターニング。定量的イメージングと組み合わせることで、サイズ低減技術を利用して、体節と神経管のサイズが減少した胚のサイズにどのように影響するかを調べました。

Protocol

すべての魚関連の手続きは、ハーバード大学医学部の制度的動物ケアと使用委員会 (IACUC) の承認を得て行われました。 1. ツールと試薬の準備 胚を切り刻むためにワイヤーループを作る 40μ m の直径の堅く、非腐食性であるステンレス鋼ワイヤーの 20 cm を取りなさい。ワイヤーをガラス毛細管 (1.0 mm 外径、0.5 mm 内径、フィラメン?…

Representative Results

卵黄体積減少は、通常の形態にとって重要である最近述べたように Almuedo-カスティージョ et al.17において、胚のサイズ減少は卵黄体積を減少させることなく達成することができる。卵黄体積減少と比較するために、我々は2段階のチョッピング (胞胚と卵黄の両方) と胞胚のみのチョッピング (図 2と補足ムービー 1) の両方を?…

Discussion

歴史的に、脊椎動物のうち、サイズの減少は、主に両生類の胚を使用して行われており、植物軸に沿って胚を胞胚段階12で bisecting することによっている。しかし、カエルとゼブラフィッシュの胚の間には、胚を二分すると2つの違いがある。まず、ゼブラフィッシュの胚が bisecting (胞胚ステージ) に寛容になった段階で、オーガナイザーは胞胚マージン<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、日本科学技術振興機構 (JPMJPR11AA) と国立衛生研究所 (R01GM107733) の PRESTO 事業によって支援された。

Materials

60 mm PYREX Petri dish CORNING  3160-60
Agarose affymetrix 75817 For making a mount for live imaging
Agarose, low gelling temperature Type VII-A SIGMA-ALDRICH A0701-25G
CaCl2 EMD CX0130-1 For 1/3 Ringer's solution
CaSO4 For egg water
Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) CORNING 2845-25
Disposable Spatula VWR  80081-188
Foam board ELMER'S 951300 For microscope incubator
Forcept (No 55) FST 11255-20
Glass pipette VWR 14673-043
HEPES SIGMA Life Science H4034 For 1/3 Ringer's solution
INCUKIT XL for Cabinet Incubators INCUBATOR Warehouse.com For microscope incubator
Instant sea salt Instant Ocean 138510 For egg water
KCl SIGMA-ALDRICH P4504 For 1/3 Ringer's solution
Methyl cellulose SIGMA-ALDRICH M0387-100G
NaCl SIGMA-ALDRICH S7653 For 1/3 Ringer's solution
Petri dish Falcon 351029 For making a mount for live imaging
Phenol red SIGMA Life Science P0290
Pipette pump BEL-ART PRODUCTS F37898
Pronase EMD Millipore Corp 53702-250KU
Tricaine-S (MS222) WESTERN CHEMICAL INC NC0135573
Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires Sandra The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use.

References

  1. Cooke, J. Scale of body pattern adjusts to available cell number in amphibian embryos. Nature. 290, 775-778 (1981).
  2. Driesch, H. Entwicklungsmechanische Studien: I. Der Werthe der beiden ersten Furchungszellen in der Echinogdermenentwicklung. Experimentelle Erzeugung von Theil- und Doppelbildungen. Zeitschrift fur wissenschaftliche Zoologie. , (1892).
  3. Morgan, T. H. Half embryos and whole embryos from one of the first two blastomeres. Anatomischer Anzeiger. 10, 623-638 (1895).
  4. Ishimatsu, K., et al. Size-reduced embryos reveal a gradient scaling-based mechanism for zebrafish somite formation. Development. 145, (2018).
  5. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
  6. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (26), e1217 (2009).
  7. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  8. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
  9. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969 (2018).
  10. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. Journal of Visualized Experiments. (29), e1394 (2009).
  11. Mizuno, T., Shinya, M., Takeda, H. Cell and tissue transplantation in zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 15-28 (1999).
  12. Cooke, J. Control of somite number during morphogenesis of a vertebrate, Xenopus laevis. Nature. 254, 196-199 (1975).
  13. Inomata, H., Shibata, T., Haraguchi, T., Sasai, Y. Scaling of dorsal-ventral patterning by embryo size-dependent degradation of Spemann’s organizer signals. Cell. 153, 1296-1311 (2013).
  14. Gomez, C., et al. Control of segment number in vertebrate embryos. Nature. 454, 335-339 (2008).
  15. Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., Francois, P., Aulehla, A. Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding. Nature. 493, 101-105 (2013).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  17. Almuedo-Castillo, M., et al. Scale-invariant patterning by size-dependent inhibition of Nodal signalling. Nature Cell Biology. 20, 1032-1042 (2018).
  18. Koos, D. S., Ho, R. K. The nieuwkoid gene characterizes and mediates a Nieuwkoop-center-like activity in the zebrafish. Current Biology. 8, 1199-1206 (1998).
  19. Yamanaka, Y., et al. A novel homeobox gene, dharma, can induce the organizer in a non-cell-autonomous manner. Genes and Development. 12, 2345-2353 (1998).
  20. Jesuthasan, S., Stahle, U. Dynamic microtubules and specification of the zebrafish embryonic axis. Current Biology. 7, 31-42 (1997).
  21. Schier, A. F., Talbot, W. S. The zebrafish organizer. Current Opinion in Genetics and Development. 8, 464-471 (1998).

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Cite This Article
Ishimatsu, K., Cha, A., Collins, Z. M., Megason, S. G. Surgical Size Reduction of Zebrafish for the Study of Embryonic Pattern Scaling. J. Vis. Exp. (147), e59434, doi:10.3791/59434 (2019).

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