胚性パターンスケーリングの研究のためのゼブラフィッシュの外科的サイズ縮小
Summary
ここでは、通常の発達過程を妨げずにゼブラフィッシュの胚のサイズを小さくする方法について述べる。この手法により、サイズ変更に対するパターンのスケーリングと開発の堅牢性の検討が可能になります。
Abstract
発達過程において、胚は体のサイズに自分の体のパターンを一致させる顕著な能力を示す。それらの体の割合は、特定の限界内で、より大きいか、またはより小さい胚においてさえ維持される。このスケーリングの現象は1世紀以上にわたって注目されてきたが、様々なサイズの胚における発達力学の量的記述不足のために、根底にあるメカニズムを理解することは限定的であった。このような制約を克服するため、ゼブラフィッシュの胚のサイズを外科的に減少させる新しい手法を開発し、生体内ライブイメージングに大きな利点を持っています。我々は、別のステップで胞胚段階で細胞および卵黄を平衡除去した後、胚が適切な条件下で迅速に回復し、より小さいがそれ以外の場合は正常な胚に成長することを実証する。この技術は特別な装置を必要としないので、それは容易に適応可能であり、morphogen によって媒介されるパターン化の強さを含むスケールの問題の広い範囲を研究するのに使用することができる。
Introduction
科学者たちは、胚の大きさは、自然と実験的な条件1,2,3の下で大きく異なるが、一定の体の割合を形成する顕著な能力を持っていることを長い間知られています。数十年にわたる理論的および実験的研究にもかかわらず、このようなサイズ変動に対する頑健性は、スケーリングと呼ばれ、多くの組織や器官においてその根底にあるメカニズムは未知のままである。現像システムのダイナミクスを直接捕捉するために、ゼブラフィッシュ4において再現性がありかつ単純なサイズ低減技術を確立し、これは生体内ライブ撮像5において大きな利点を有する。
ゼブラフィッシュは、発生生物学を含む生物学の複数の学問分野を研究するためのモデル脊椎動物として役立ってきた。特に、ゼブラフィッシュは生体内ライブ撮像6にとって理想的であるので 1) 開発は母と卵殻の外で正常に進行でき、そして 2) 胚は透明である。さらに、胚は、それらが実験室条件で研究されることを可能にするいくつかの温度および環境変動に耐えることができる。また、モルホリノや mRNA 注入7,8による従来の遺伝子発現摂動に加え、近年の CRISPR/Cas9 技術の進歩により、ゼブラフィッシュにおける逆遺伝学が極めて効率的な9となっている。さらに、細胞移植または組織手術などの発生学における多くの古典的技術を、4、10、11に適用することができる。
サイズ低減技術は、両生類および他の非脊椎動物12で元々開発された。例えば、アフリカツメガエルガエルにおいて、他の一般的な脊椎動物モデルでは、胞胚段階で動物植物軸に沿って公知は、サイズ減少した胚12,13を作り出すことができる。しかし、私たちの手の中でこのワンステップのアプローチは、dorsalized または ventralized の胚が不均一に分布しており、胚の形態からの局在を知ることができないためであると考えられます。ここでは、通常発達しているがより小さな胚を生成するゼブラフィッシュのための代替の2段階のチョッピング技術を示す。この技術によって、細胞は最初に動物の極から、オーガナイザーの活動に欠けているナイーブな細胞の領域から取り除かれます。Epiboly とその後の形態形成に重要な卵黄と細胞の量のバランスをとるために、卵黄を除去する。ここでは、このプロトコルについて詳しく説明し、パターン形成におけるサイズ不変性の2つの例を示します。somite 形成と腹部神経管のパターニング。定量的イメージングと組み合わせることで、サイズ低減技術を利用して、体節と神経管のサイズが減少した胚のサイズにどのように影響するかを調べました。
Protocol
Representative Results
Discussion
歴史的に、脊椎動物のうち、サイズの減少は、主に両生類の胚を使用して行われており、植物軸に沿って胚を胞胚段階12で bisecting することによっている。しかし、カエルとゼブラフィッシュの胚の間には、胚を二分すると2つの違いがある。まず、ゼブラフィッシュの胚が bisecting (胞胚ステージ) に寛容になった段階で、オーガナイザーは胞胚マージン<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、日本科学技術振興機構 (JPMJPR11AA) と国立衛生研究所 (R01GM107733) の PRESTO 事業によって支援された。
Materials
| 60 mm PYREX Petri dish | CORNING | 3160-60 | |
| Agarose | affymetrix | 75817 | For making a mount for live imaging |
| Agarose, low gelling temperature Type VII-A | SIGMA-ALDRICH | A0701-25G | |
| CaCl2 | EMD | CX0130-1 | For 1/3 Ringer's solution |
| CaSO4 | For egg water | ||
| Cover slip (25 mm x 25 mm, Thickness 1) | CORNING | 2845-25 | |
| Disposable Spatula | VWR | 80081-188 | |
| Foam board | ELMER'S | 951300 | For microscope incubator |
| Forcept (No 55) | FST | 11255-20 | |
| Glass pipette | VWR | 14673-043 | |
| HEPES | SIGMA Life Science | H4034 | For 1/3 Ringer's solution |
| INCUKIT XL for Cabinet Incubators | INCUBATOR Warehouse.com | For microscope incubator | |
| Instant sea salt | Instant Ocean | 138510 | For egg water |
| KCl | SIGMA-ALDRICH | P4504 | For 1/3 Ringer's solution |
| Methyl cellulose | SIGMA-ALDRICH | M0387-100G | |
| NaCl | SIGMA-ALDRICH | S7653 | For 1/3 Ringer's solution |
| Petri dish | Falcon | 351029 | For making a mount for live imaging |
| Phenol red | SIGMA Life Science | P0290 | |
| Pipette pump | BEL-ART PRODUCTS | F37898 | |
| Pronase | EMD Millipore Corp | 53702-250KU | |
| Tricaine-S (MS222) | WESTERN CHEMICAL INC | NC0135573 | |
| Ultra thin bright annealed 316L dia. 0.035 mm Stainless Steel Weaving Wires | Sandra | The wire we used was obtained ~20 years ago and we could not find exactly the same one. This product has the same material and diameter as the one we use. |
References
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