Denna uppsats beskriver två metoder för att kvantifiera försvars svar i Arabidopsis thaliana efter exponering för immunelicitors: den övergående oxidativ bristning, och hämning av plantan tillväxt.
Växter har utvecklats ett robust immunförsvar att uppfatta patogener och skydda mot sjukdomar. Denna uppsats beskriver två analyser som kan användas för att mäta styrkan av immunförsvaret aktivering i Arabidopsis thaliana efter behandling med elicitor molekyler. Presenteras först är en metod för att fånga den snabbt inducerad och dynamisk oxidativ burst, som kan övervakas med hjälp av en luminol-baserad analys. Presenteras andra är en metod som beskriver hur man mäter immun-inducerad hämning av plantan tillväxt. Dessa protokoll är snabba och pålitliga, kräver inte specialiserad utbildning eller utrustning, och används i stor utsträckning för att förstå den genetiska grunden för växt immunitet.
Att uppfatta och försvara sig mot patogener, växter har utvecklats membran-bundna mönsterigenkänning receptorer (PRRs) som upptäcker bevarade mikrobiella molekyler utanför cellen kallas Microbe-associerade molekylära mönster (MAMPs)1. Bindningen av mamps till deras besläktat PRRS initierar proteinkinas-medierad immun signalering vilket resulterar i bredspektrum sjukdoms resistens2. En av de tidigaste Svaren efter PRR aktiveringen är fosforylering och aktivering av integrerad plasmamembran respiratorisk BURST OXIDAS HOMOLOG (RBOH) proteiner som katalyserar produktionen av extracellulära reaktiva syreradikaler (ROS)3 , 4. ros spelar en viktig roll i att fastställa sjukdoms beständighet, agerar både som sekundära budbärare att propagera immun signalering samt direkta antimikrobiella medel5. Den första observationen av en immunsuppressiva oxidativ explosion beskrevs med hjälp av potatisknölar av CV. Rishiri efter Phytophthora infestans inympning6. ROS produktion har utvärderats i flera växtarter med hjälp av blad skivor7, cellsuspension kulturer8, och protoplasts6. Beskrivs här är en enkel metod för testmetoder mönster-utlöst ros produktion i blad skivor av Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Som ett svar på MAMP perception, aktiverade rboh proteiner katalysera produktionen av superoxid radikaler (O2–), hydroxylradikaler (• OH), och linne syre (1o2) som omvandlas till väteperoxid (H2o 2) i extracellulära rymden9. H2O2 kan kvantifieras med luminol-baserad chemiluminescens i närvaro av oxidationsmedlet pepparrot PEROXIDAS (HRP)10. HRP oxiderar H2O2 och genererar en HYDROXIDJON (Oh−) och syre gas (O2) som reagerar med luminol för att framställa en instabil intermediär som frigör en fotton av ljus10. Photon emission kan kvantifieras som relativ ljusenheter (RLUs) med hjälp av en mikroplattläsare eller Imager som kan detektera Luminescens, som har blivit standarddelar av utrustning i de flesta molekylära laboratorier. Genom att mäta ljuset som produceras under en 40-60-minuters intervall, en övergående oxidativ burst kan upptäckas så tidigt som 2-5 minuter efter elicitor behandling, topp på 10-20 minuter, och återvänder till basal nivåer efter ~ 60 minuter11. Det kumulativa ljus som produceras under denna tid kurs kan användas som ett mått på immunförsvaret som motsvarar aktiveringen av RBOH proteiner12. Bekvämt, denna analys kräver inte specialiserad utrustning eller besvärliga provberedning.
Peaking kort efter MAMP upptäckt, den oxidativa burst anses vara ett tidigt immunsvar, tillsammans med MAPK aktivering och etenproduktion5. Senare immunsvar inkluderar transkriptionell omprogrammering, stomatala stängning, och callose deposition2,5. Långvarig exponering för MAMPs aktiverar kontinuerligt energiskt kostsamma immun signalering resulterar i hämning av växternas tillväxt, tyder på en avvägningen mellan utveckling och immunitet13. Mönsterutlöst Groddplanta tillväxthämning (SGI) används ofta för att bedöma immun produktionen i Arabidopsis och har varit en integrerad del av identifieringen av flera viktiga komponenter i immun signalering inklusive PRRS14,15 ,16. Därför presenterar detta papper dessutom ett test för mönster-utlöst SGI i Arabidopsis, varvid plantor odlas i multi-well tallrikar som innehåller standardmedier eller media kompletteras med en immun elicitor för 8-12 dagar och sedan vägde med hjälp av en analytisk skala.
För att demonstrera hur ROS-och SGI-analyser kan användas för att övervaka PRR-medierad signalering valdes tre genotyper som representerar olika immun utgångar: (1) Wild Type Arabidopsis anslutning Columbia (Col-0), (2) den dominerande-negativa bak1-5 Mutant där multifunktionell PRR Co-receptor brassinosteroid okänslig 1-associerad Kinas 1 (BAK1) är icke-funktionell i immun signalering17,18, och (3) den recessiv cpk28-1 Mutant, som saknar den reglerande protein kalciumberoende proteinkinas 28 (CPK28) och visar förhöjda immunsuppressiva svar19,20. Analyser av ROS och SGI presenteras som svar på en syntetiskt producerad elf18 peptid epitop av bakteriell Elongation Factor tu (EF-TU), erkänd i Arabidopsis av PRR EF-tu-receptorn (EFR)15. Dessa protokoll kan användas med andra immunologiska elicitorer såsom bakteriell motilitet protein flagellin14 eller endogena växt Elixir proteiner (AtPeps)16, det bör dock noteras att anläggningens reaktionsförmåga varierar beroende på elicitor21. Tillsammans kan ROS-och SGI-analyser användas för snabb och kvantitativ bedömning av tidiga och sena PRR-medierade svar.
Denna uppsats beskriver två metoder för testmetoder mönster-utlöst immunsvar i Arabidopsis, erbjuder kvantitativa metoder för att utvärdera immun produktionen utan användning av specialiserad utrustning. I kombination, mönster-utlöst ros och SGI kan användas för att bedöma tidiga och sena svar på mikrob perception, respektive.
Den största begränsningen av den oxidativa burst-analysen är variation. Av skäl som inte är helt klarlagda, absoluta RLUs skiljer sig ofta med…
The authors have nothing to disclose.
Arbetet i vårt labb finansieras genom naturresursernas och ingenjörs forskningens råd (NSERC) Discovery program, den kanadensiska Stiftelsen för innovation John R. Evans Leader ‘ s Fund, och Queen ‘ s University. KS och är stöds av tandem Ontario Graduate stipendier och NSERC Kanada Graduate stipendier för masterstudenter (CGS-M).
20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |