Dit artikel beschrijft twee methoden voor het kwantificeren van verdediging reacties in Arabidopsis thaliana na blootstelling aan immuun uitlokken: de voorbijgaande oxidatieve uitbarsting, en de remming van zaailing groei.
Planten hebben een robuust immuunsysteem ontwikkeld om pathogenen te zien en te beschermen tegen ziekte. Dit artikel beschrijft twee testen die kunnen worden gebruikt voor het meten van de sterkte van de immuunactivering in Arabidopsis thaliana na behandeling met elicitor moleculen. Gepresenteerd eerst is een methode voor het vastleggen van de snel geïnduceerde en dynamische oxidatieve burst, die kan worden bewaakt met behulp van een Luminol gebaseerde assay. De tweede is een methode die beschrijft hoe de door immuungeïnduceerde remming van zaailing te meten. Deze protocollen zijn snel en betrouwbaar, vereisen geen gespecialiseerde training of apparatuur, en worden op grote schaal gebruikt om de genetische basis van de immuniteit van de plant te begrijpen.
Om te waarnemen en te verdedigen tegen pathogenen, planten hebben geëvolueerd membraan-gebonden patroon erkenning receptoren (PRRs) dat geconmaald microbiële moleculen buiten de cel bekend als microbe-geassocieerde moleculaire patronen (MAMPs)1detecteren. De binding van mamps aan hun verwant PRRS initieert eiwit kinase-gemedieerde immuun signalering resulterend in breedspectrum ziekte resistentie2. Een van de vroegste reacties na activering van PRR is de fosforylering en activering van integraal plasma membraan respiratoire BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) eiwitten die de productie van extracellulaire reactieve zuurstof soorten (ROS) katalyseren3 , 4. Ros spelen een belangrijke rol bij het vaststellen van de ziekte resistentie, fungeert als secundaire boodschappers te propageren immuun signalering evenals directe antimicrobiële middelen5. De eerste observatie van een immuun-opgewekt oxidatieve uitbarsting werd beschreven met behulp van aardappelknollen van CV. Rishiri na Phytophthora infestans inoculatie6. ROS productie is geëvalueerd in verschillende plantensoorten met behulp van Leaf discs7, cel suspensie culturen8, en protoplasten6. Hier beschreven is een eenvoudige methode voor het aszeggen van patroon-geactiveerde ROS productie in blad schijven van Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Als reactie op MAMP-waarneming katalyseert de geactiveerde rboh-eiwitten de productie van superoxide-radicalen (O2–), hydroxylradicalen (• Oh) en singlet-zuurstof (1O2) die worden omgezet in waterstofperoxide (H2O 2) in de extracellulaire ruimte9. H2O2 kan worden gekwantificeerd met chemiluminescentie op basis van Luminol in aanwezigheid van de oxiderende agent mierikswortelperoxidase (HRP)10. HRP oxiseert H2O2 en genereert een HYDROXIDE-Ion (Oh−) en zuurstof gas (O2) dat reageert met Luminol om een instabiel intermediair te produceren dat een foon van licht10vrijgeeft. De emissie van photon kan worden gekwantificeerd als relatieve licht eenheden (RLUs) met behulp van een microplaat lezer of Imager die luminescentie detecteert, die standaard uitrustingsstukken zijn geworden in de meeste moleculaire laboratoria. Door het meten van het licht dat wordt geproduceerd over een interval van 40-60 minuten, kan een voorbijgaande oxidatieve uitbarsting al 2-5 minuten na de behandeling van de elicitor worden gedetecteerd, een piek van 10-20 minuten en terugkeren naar de basale niveaus na ~ 60 minuten11. Het cumulatieve licht dat over deze tijdsduur wordt geproduceerd, kan worden gebruikt als een maatstaf voor de immuunsterkte die overeenkomt met de activering van RBOH-eiwitten12. Handig is deze bepaling niet vereist gespecialiseerde apparatuur of omslachtige monstervoorbereiding.
Peaking kort na MAMP detectie, de oxidatieve uitbarsting wordt beschouwd als een vroege immuunrespons, samen met MAPK activering en ethyleenproductie5. Latere immuunresponsen omvatten transcriptionele herprogrammering, stomatale afsluiting en callose afzetting2,5. Langdurige blootstelling aan MAMPs activeert voortdurend energetisch-kostbare immuunsigna lering, resulterend in remming van de plantengroei, indicatief voor een trade-off tussen ontwikkeling en immuniteit13. Patroon-geactiveerde zaailing groeiremming (SGI) wordt veel gebruikt om de immuunoutput in Arabidopsis te beoordelen en is integraal onderdeel geweest van de identificatie van verschillende belangrijke componenten van immuunsigna lering, waaronder PRRS14,15 ,16. Daarom presenteert dit papier ook een test voor het patroon getriggerd SGI in Arabidopsis, waarbij zaailingen worden geteeld in multi-well platen met standaard media of media aangevuld met een immuunloïde gedurende 8-12 dagen en vervolgens gewogen met behulp van een analytische schaal.
Om aan te tonen hoe Ros en SGI assays kunnen worden gebruikt om PRR-gemedieerde signalering te bewaken, zijn drie genotypen gekozen die verschillende immuunoutputs vertegenwoordigen: (1) het wild type Arabidopsis toetredings Columbia (Col-0), (2) de dominante-negatieve bak1-5 Mutant waarin de multi-functionele PRR co-receptor brassinosteroid ongevoelig 1-geassocieerde KINASE 1 (BAK1) is niet-functioneel in immuun signalering17,18, en (3) het recessieve cpk28-1 Mutant, die mist de regulerend eiwit calcium-afhankelijke proteïne KINASE 28 (CPK28) en vertoont verhoogde immuungeactiveerde responsen19,20. Ros en SGI assays worden gepresenteerd in reactie op een synthetisch geproduceerde elf18 peptide epitoop van bacteriële rek factor TU (EF-TU), erkend in Arabidopsis door de PRR EF-TU receptor (EFR)15. Deze protocollen kunnen worden gebruikt met andere immuun uitlokken, zoals de bacteriële motiliteit proteïne flagellin14 of endogene plant lokaas eiwitten (AtPeps)16, echter, opgemerkt moet worden dat de reactie van de plant verschilt afhankelijk van de elicitor21. Samen kunnen ROS en SGI assays worden gebruikt voor de snelle en kwantitatieve beoordeling van vroegtijdige en late PRR-gemedieerde reacties.
Dit artikel beschrijft twee methoden voor het aszeggen van patroon-geactiveerde immuunresponsen in Arabidopsis, het aanbieden van kwantitatieve benaderingen voor het evalueren van immune output zonder het gebruik van gespecialiseerde apparatuur. In combinatie, patroon-geactiveerde ROS en SGI kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van vroege en late reacties op microbe perceptie, respectievelijk.
De belangrijkste beperking van de oxidatieve burst-assay is variabiliteit. Om redenen …
The authors have nothing to disclose.
Het werk in ons lab wordt gefinancierd door de Natural Resources and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Program, de Canadian Foundation for Innovation John R. Evans Leader ‘ Fund en Queen’s University. KS en wordt ondersteund door tandem Ontario Graduate beurzen en NSERC Canada Graduate beurzen voor master’s Students (CGS-M).
20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |