Dette papiret beskriver to metoder for kvantifisere forsvar responser i Arabidopsis thaliana etter eksponering for immun elicitors: forbigående oksidativt utbrudd, og hemming av frøplante vekst.
Planter har utviklet seg et robust immunsystem til å oppfatte patogener og beskytte mot sykdom. Dette papiret beskriver to analyser som kan brukes til å måle styrken av immun aktivering i Arabidopsis thaliana etter behandling med elicitor molekyler. Presentert først er en metode for å fange den raskt indusert og dynamisk oksidativt utbrudd, som kan overvåkes ved hjelp av en luminol-basert analyse. Presentert andre er en metode som beskriver hvordan å måle immun-indusert hemming av frøplante vekst. Disse protokollene er rask og pålitelig, ikke krever spesialisert opplæring eller utstyr, og er mye brukt til å forstå det genetiske grunnlaget for anlegget immunitet.
Å oppfatte og forsvare seg mot patogener, har planter utviklet membran-bundet mønstergjenkjenning reseptorer (PRRs) som oppdager bevarte mikrobielle molekyler utenfor cellen kjent som mikrobe-assosiert molekylær mønstre (MAMPs)1. Bindingen av MAMPs til deres beslektet PRRs initierer protein kinase-mediert immun signalering resulterer i bredspektret sykdom motstand2. En av de tidligste svarene etter PRR aktivering er fosforylering og aktivering av integrert plasma membran RESPIRATORISK BURST OKSIDASE HOMOLOGE (RBOH) proteiner som katalysere produksjonen av ekstracellulære reaktive oksygen arter (ROS)3 , 4. ros spiller en viktig rolle i å etablere sykdomsresistens, opptrer både som sekundær budbringere å spre immun signalering samt direkte antimikrobielle agenter5. Den første observasjon av en immun-elicited oksidativt utbrudd ble beskrevet ved hjelp av potet knoller av CV. Rishiri etter Phytophthora infestans inoculation6. ROS produksjonen har blitt evaluert i flere plantearter ved hjelp av blad plater7, celle suspensjon kulturer8, og protoplasts6. Beskrevet her er en enkel metode for assaying mønster-utløst ROS produksjon i blad plater av Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).
Som et svar på MAMP persepsjon, aktivert RBOH proteiner katalysere produksjon av superoxide radikaler (O2–), hydroksyl radikaler (• Oh), og singlet oksygen (1O2) som omdannes til hydrogen peroxide (H2o 2) i ekstracellulære plass9. H2O2 kan bli kvantifisert av luminol-baserte kjemiluminescens i nærvær av oksiderende agent pepperrot peroksidase (HRP)10. HRP oksiderer H2O2 GENERERER en natriumhydroksid (Oh−) og oksygen gass (O2) som reagerer med luminol for å produsere en ustabil mellomliggende som frigjør et foton av lys10. Foton utslipp kan være kvantifisert som relative lys enheter (RLU) ved hjelp av en mikroplate leser eller imager i stand til å oppdage luminescence, som har blitt standard stykker av utstyr i de fleste molekylære laboratorier. Ved å måle lyset som produseres over et 40-60-minutters intervall, kan en forbigående oksidativt burst oppdages så tidlig som 2-5 minutter etter elicitor behandling, med topp på 10-20 minutter, og tilbake til basal nivåer etter ~ 60 minutter11. Den kumulative lys produsert over denne tiden kurset kan brukes som et mål på immunforsvaret tilsvarende aktivering av RBOH proteiner12. Beleilig, ikke denne analysen ikke krever spesialisert utstyr eller tungvint prøve forberedelser.
Topp kort tid etter MAMP deteksjon, er oksidativt utbrudd betraktet som en tidlig immunrespons, sammen med MAPK aktivering og etylen produksjon5. Senere uimottakelig responser inkluderer transcriptional omprogrammering, nålene nedleggelse, og callose deponering2,5. Langvarig eksponering for MAMPs kontinuerlig aktiverer energisk-kostbare immun signalering resulterer i Hemming av plantevekst, antyder en trade-off mellom utvikling og immunitet13. Mønster-utløst frøplante veksthemming (SGI) er mye brukt til å vurdere immunforsvaret i Arabidopsis og har vært integrert i identifisering av flere viktige komponenter i immun signalering inkludert PRRs14,15 ,16. Derfor er dette papiret i tillegg presenterer en analyse for mønster-utløst SGI i Arabidopsis, der frøplanter dyrkes i multi-brønn plater som inneholder standard Media eller Media supplert med en immun elicitor for 8-12 dager og deretter veide ved hjelp av en analytisk målestokk.
For å demonstrere hvordan ROS og SGI analyser kan brukes til å overvåke PRR-mediert signalering, tre genotyper som representerer varierende uimottakelig utganger ble valgt: (1) den ville typen Arabidopsis tiltredelse Columbia (Col-0), (2) den dominerende-negative bak1-5 mutant der multi-funksjonell PRR co-reseptor BRASSINOSTEROID ufølsom 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) er ikke-funksjonell i immun signalering17,18, og (3) den resessivt cpk28-1 mutant, som mangler regulatoriske protein kalsium-avhengige protein KINASE 28 (CPK28) og viser økt immun-utløst svar19,20. ROS og SGI analyser er presentert som svar på en syntetisk-produsert elf18 peptid epitope av bakteriell forlengelse Factor Tu (EF-TU), anerkjent i Arabidopsis av PRR EF-Tu RESEPTOR (EFR)15. Disse protokollene kan brukes med andre immune elicitors som bakteriell motilitet protein flagellin14 eller endogene Plant Elicitor proteiner (AtPeps)16, men det bør bemerkes at plante respons varierer avhengig av elicitor21. Sammen kan ROS og SGI analyser brukes for rask og kvantitativ vurdering av tidlig og sent PRR-mediert svar.
Dette papiret beskriver to metoder for assaying av mønster-utløst immunresponser i Arabidopsis, tilbyr kvantitative tilnærminger til evaluering av immunforsvaret uten bruk av spesialisert utstyr. I kombinasjon, mønster-utløst ROS og SGI kan brukes til å vurdere tidlig og sent svar på mikrobe persepsjon, henholdsvis.
Den store begrensningen av oksidativt burst-analysen er variasjon. Av grunner som ikke er helt forstått, absolutt RLU ofte forskjellig med en størrelsesorden mell…
The authors have nothing to disclose.
Arbeid i laboratoriet vårt er finansiert gjennom naturressurser og engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery program, den kanadiske stiftelsen for innovasjon John R. Evans Leader ‘ s Fund, og Queen ‘ s University. KS og er støttes av tandem Ontario Graduate stipender og NSERC Canada Graduate stipend for Master ‘ s Students (CGS-M).
20-20-20 Fertilizer | Plant Prod | 10529 | Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth. |
4 mm Biopsy Punch | Medical Mart | 232-33-34-P | A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used. |
48-Well Sterile Plates with Lid | Sigma-Aldrich | CLS3548 | |
Analytical Scale with Draft Sheid | VWR | VWR-225AC | Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal. |
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) | Sartorius | 725240 | Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary. |
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | EZ Biolab | cp7211 | Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C. |
Forceps | Fisher Scientific | 22-327379 | |
Horseradish Peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light. |
Luminol | Sigma-Aldrich | A8511 | Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light. |
Murisage and Skoog Basal Salts | Cedarlane Labs | MSP09-100LT | Store at 4C. |
Soil | SunGrow Horticulture | Sunshine Mix #1 | Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots. |
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module | Molecular Devices | Must request a quote | Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays. |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389-1KG | Store at room temperature. |
White Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-589 |