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माउस फेफड़ों के भीतर चयनात्मक एजेंट जमा में सुधार करने के लिए प्रत्यक्ष Intrabronchial प्रशासन

Published: May 20, 2019 doi: 10.3791/59450
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Medicine, University of Colorado Denver, 2Department of Medicine, Denver Health Medical Center

Summary

चूहों में प्रयोगात्मक एजेंटों के इंट्राट्रेकल (आईटी) प्रशासन अक्सर दूरस्थ फेफड़ों के लिए असममित प्रसव में परिणाम.  इस रिपोर्ट में, हम जीवित चूहों गैर ऑपरेटिव में प्रत्येक फेफड़ों को कम करने के लिए एक सीधा इंट्राब्रोन्कियल (आईबी) दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं।  इस दृष्टिकोण चुनिंदा एक फेफड़ों के लिए एजेंटों प्रशासन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या दोनों फेफड़ों के लिए सममित एजेंट वितरण में सुधार करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Abstract

प्रायोगिक एजेंटों का इंट्राट्रेकल (आईटी) प्रशासन फैलाना फेफड़ों की बीमारियों के murine मॉडल में एक आवश्यक तकनीक है, जैसे ब्लोमाइसिन प्रेरित फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस।  हालांकि, distal माउस फेफड़ों के लिए intratracheally प्रशासित एजेंटों का वितरण अक्सर असममित है, फेफड़ों के पैरेन्काइमल सांद्रता के साथ छोटे में वृद्धि हुई (लेकिन समान रूप से सुलभ) माउस के बाएं फेफड़ों.  इस रिपोर्ट में वर्णित एक उपन्यास इंट्राब्रोन्कियल (आईबी) दृष्टिकोण है जो जीवित चूहों के बाएं और/या दाएं फेफड़ों को गैर-ऑपरेटिव रूप से कम कर सकता है।  यह भी प्रदर्शित किया जाता है कि कैसे इस दृष्टिकोण का उपयोग चुनिंदा रूप से एक फेफड़ों के एजेंटों को प्रशासित करने के लिए किया जा सकता है या (खुराक-समायोजित आईबी डिलीवरी केमाध्यम से) प्रयोगात्मक एजेंटों के फेफड़ों की डिलीवरी के बाएं-दाएं समरूपता में सुधार करने के लिए, जिससे विसरित के मॉडल में सुधार हो सकता है फेफड़ों की बीमारी जैसे ब्लियोमाइसिन प्रेरित फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस।

Introduction

चूहों में प्रयोगात्मक एजेंटों के प्रत्यक्ष फुफ्फुसीय प्रशासन फेफड़ों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं, तीव्र फेफड़ों की चोट, और फेफड़ों की फाइब्रोसिस के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। प्रत्यक्ष फुफ्फुसीय प्रशासन आमतौर पर इंट्राट्रेकल (आईटी) के माध्यम से किया जाता है, जैसा कि पहले 1 ,2,3में वर्णित किया गया था । हालांकि, इस दृष्टिकोण nonselective है, एक nontargeted और अक्सर असममित फैशन में दोनों फेफड़ों को प्रभावित.  फेफड़ों की चोट का प्रायोगिक मॉडलिंग चुनिंदा एक विशिष्ट फेफड़ों को लक्षित करने की क्षमता से लाभ हो सकता है, एक नियंत्रण के रूप में contralateral फेफड़ों के उपयोग के लिए अनुमति देता है. इसके विपरीत, मानव फैलाना फेफड़ों की बीमारियों की सटीक मॉडलिंग द्विपक्षीय फेफड़ों के पैरेन्काइमा के लिए प्रयोगात्मक एजेंटों के सममित वितरण से लाभ.

इस रिपोर्ट का समग्र लक्ष्य माउस के बाएँ या दाएँ फेफड़े में प्रयोगात्मक एजेंटों के चयनात्मक वितरण की विधि का वर्णन करना है (चित्र1)। इस intrabronchial (आईबी) प्रशासन दृष्टिकोण एक माउस फेफड़ों के एकतरफा उपचार के लिए अनुमति देता है और आसानी से द्विपक्षीय mainstem ब्रोंची के लिए एक एजेंट के बराबर वितरण सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. आईबी प्रशासन का उपयोग करके बड़े दाहिने फेफड़े और छोटे संस्करणों के लिए प्रयोगात्मक एजेंटों की बड़ी खुराक देने के लिए छोटे बाएं फेफड़े (यानी, खुराक समायोजित आईबी प्रशासन), इस रिपोर्ट में प्रदर्शित फुफ्फुसीय की एकरूपता में सुधार है प्रयोगात्मक एजेंटों की डिलीवरी, चूहों में फैलाना फेफड़ों की चोट के मॉडल का अनुकूलन. इस प्रकार, यह रिपोर्ट जांचकर्ताओं के लिए मूल्य धारण कर सकती है जो चूहों को या तो एकतरफा प्रयोगात्मक एजेंटों को प्रशासित करने या दोनों फेफड़ों में दवा जमा की समरूपता में सुधार करने की मांग कर रहे हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रोटोकॉल कोलोराडो डेनवर संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है. नीचे वर्णित सभी प्रक्रियाओं (अनुभाग 4-7) दोनों पुरुष और महिला C57BL/6 चूहों का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है. इस दृष्टिकोण शरीर के वजन में 19 से 40 ग्राम से लेकर चूहों का उपयोग कर मान्य किया गया है.

1. आईबी प्रशासन के लिए मंच का निर्माण

  1. मूल 90 डिग्री कोण से आधारी पंख और स्थायी पंख के बीच के बुकेंड को 70 डिग्री (चित्र 2क) मोड़ें।
  2. धातु bookend के खड़े विंग के केंद्र-शीर्ष पर एक छेद ड्रिल (चित्र 2A).
  3. प्लास्टिक बोर्ड की इसी स्थिति में समान आकार के एक छेद ड्रिल। दो छोटे छिद्रों को अवर रूप से और बाद में ड्रिल करें (चित्र 2क) .
  4. प्लास्टिक बोर्ड में इन छोटे छिद्रों के बीच 4:0 रेशम सीवन को ड्रेप करें (चित्र 2क)
  5. हुक और लूप टेप को प्लास्टिक बोर्ड के किनारे पर रखें (चित्र 2क)।
  6. प्लास्टिक बोर्ड को पेंच के साथ धातु के बुकेंड में इकट्ठा करना (चित्र 2ख) । सुनिश्चित करें कि पेंच अखरोट पर्याप्त स्थिति में बोर्ड पकड़ करने के लिए तंग है, जबकि कोण के समायोजन के लिए अनुमति देता है, यदि आवश्यक हो.
  7. सुनिश्चित करें कि प्लास्टिक बोर्ड के रोटेशन दक्षिणावर्त और counterclockwise है, स्वतंत्र रूप से चलती है.
    नोट: दक्षिणावर्त गति एक (+) डिग्री रोटेशन के रूप में इस रिपोर्ट में प्रतिनिधित्व किया है, और counterclockwise एक (-) डिग्री रोटेशन के रूप में प्रतिनिधित्व किया है।
  8. प्लास्टिक बोर्ड को क्रमशः 30 डिग्री, +86,-30,-30, और -74 डिग्री पर रखने के लिए कोण प्रोट्रैक्टर का उपयोग करें और उन्हें क्रमशः बुकएंड पर चिह्नित करें।

2. आईबी एजेंट प्रशासन के लिए विस्तारित कैथेटर का निर्माण

  1. एक मूल 22 जी कैथेटर की नोक पर एक तेज ब्लेड के साथ एक सही कोण कटौती करें (25 मिमी, सामग्री की तालिकादेखें ) ( चित्र3, चरण 1a).
  2. बेवल ([50]-60 डिग्री) ब्लेड के साथ अन्य मूल कैथेटर (25 मिमी) की नोक, फिर हब से सही कोण पर काट दिया (चित्र 3, चरण 1b)।
  3. अपने कुंद पर दो कैथेटर गोंद एक थोड़ा कम से कम 180 डिग्री कोण के साथ समाप्त होता है (चित्र3, चरण 2).
  4. कम तापमान के कारण पिघलकर बेवल्ड टिप को ब्लंट करें (सामग्री की तालिकादेखें )।
  5. चिपका क्षेत्र पर "0" आकार sandpaper और विस्तारित कैथेटर के beveled टिप के साथ विस्तारित कैथेटर पॉलिश (चित्र 3, चरण 3).
  6. 25 मिमी, 30 मिमी, और 35 मिमी (चित्र3, चरण 3) में विभिन्न रंगों के साथ विस्तारित कैथेटर पर मार्क करें।
  7. मार्कर के साथ अपने हब लेबलिंग द्वारा विस्तारित कैथेटर के बेवल पक्ष इंगित करें।
  8. DI पानी के साथ विस्तारित कैथेटर कुल्ला, 70% इथेनॉल के साथ कैथेटर के अंदर फ्लशिंग द्वारा निम्नलिखित. कैथेटर को एयरड्राई करें।
  9. उपयोग करने से पहले 10 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ बाँझ।

3. पूर्व प्रक्रिया की तैयारी

  1. बाँझ तकनीक के तहत एक जैविक सुरक्षा हुड में सभी प्रशासित एजेंटों बनाओ.
  2. 70% इथेनॉल के साथ कार्यस्थल को साफ करें।
  3. 70% इथेनॉल के साथ सभी शल्य चिकित्सा उपकरण बंध्याकरण।
  4. बुकेंड के बेसल विंग को सी-क्लैम ्स्फिक्सिंग करके शोधकर्ता के सामने तुरंत बेंच के सामने कार्य मंच के आधार को ठीक करें।
  5. कई अस्थायी स्पाइरोमीटर उत्पन्न करें, जो ऐसे उपकरण हैं जो चूहों में ज्वारीय वायु प्रवाह का पता लगाने की अनुमति देंगे। संक्षेप में, एक जेल लोडिंग टिप के साथ एक 1 एमएल सिरिंज (प्लांगर हटा दिया) में बाँझ नमकीन के 60 डिग्री एल जमा करें।
    नोट: नमकीन की जमा हुई बूंद बैरल को रोक देती है और ज्वारीय वेंटिलेशन3के संपर्क में आने पर ऊपर और नीचे की ओर जाती है।
  6. अस्थायी स्पाइरोमीटर के लिए एक 22 जी विस्तारित कैथेटर के हब को ढीला करते हैं।
  7. उपयोग में आसानी के लिए मंच के प्रत्येक पक्ष के लिए कांच droppers के प्रत्येक प्लेस.
  8. एक आइसोलुरेन-संगत जैविक सुरक्षा कैबिनेट में कृंतक संज्ञाहरण मशीन (सामग्री की तालिकादेखें) के लिए आइसोलुरेन प्रेरण कक्ष कनेक्ट करें।

4. गैर-ऑपरेटिव आईटी इंटूबेशन दृष्टिकोण

  1. ऑक्सीजन (2 L/min) और 5% isoflurane के साथ एक C57BL/6 माउस (पुरुष या महिला, 8-10 सप्ताह, $ 25 ग्राम) और 5% isoflurane (सामग्री की तालिकादेखें) 4 मिनट के लिए एक प्रेरण कक्ष में एनेस्थेटाइज करें।
  2. प्रयोगात्मक एजेंट को वितरित किया जा करने के लिए प्रेरित करें (जैसे, इवांस नीले रंग या FITC-dextran, के रूप में चित्रा 4में प्रदर्शन) दो pipettes में, तो उन्हें sedation के दौरान मंच के प्रत्येक पक्ष के लिए जगह है.
  3. संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष से माउस को हटाने से पहले लगभग 24-30 सांस/मिनट की श्वसन दर सुनिश्चित करें।
    नोट: Isoflurane संज्ञाहरण आम तौर पर 4 मिनट के लिए रहता है, सभी आईबी प्रक्रियाओं के लिए पर्याप्त. यदि ऑपरेटर तकनीक के साथ कुशल नहीं है, ketamine/xylazine (80 mg/kg/kg और 10 mg/kg inperitoneally, सामग्री की तालिकादेखें) अधिक लंबे समय तक संज्ञाहरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. सुसाइड की स्थिति में ड्रेप्ड सीवन लाइन पर इसके छेदकों द्वारा माउस को निलंबित करें। हुक के दो से तीन टुकड़े के साथ माउस को सुरक्षित और ढीला टेप पाश, वेंटिलेशन के प्रतिबंध से बचने.
  5. एलईडी फाइबर ऑप्टिक illuminator चालू करें (सामग्री की तालिकादेखें , चित्र 2C)।
  6. मंच के पीछे ऑपरेटर स्थिति (माउस के लिए पृष्ठ).
  7. यह त्वचा के माध्यम से गला क्षेत्र illuminates ताकि प्रकाशक के gooseneck उन्मुख. माउस तथा प्रकाश स्रोत के बीच की दूरी 2ण्3 बउ है (चित्र 2ग)।
  8. नीचे सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन करने से पहले एक अंगुली /
  9. प्रमुख हाथ के साथ बाँझ संदंश पकड़ो, तो forceps के साथ मौखिक गुहा से बाहर जीभ आकर्षित।
  10. गैर प्रमुख हाथ के साथ बाँझ डिप्रेसर पकड़ो, तो depressor के साथ जीभ की जड़ समतल oropharynx व्यापक रूप से बेनकाब करने के लिए. इसके बाद बल-पत्र जारी किए जा सकते हैं, जिससे प्रमुख हाथ मुक्त हो सकते हैं।
  11. विस्तारित कैथेटर को मौखिक गुहा के माध्यम से श्वासनली में प्रवेश करने के लिए प्रमुख हाथ का प्रयोग करें (चित्र 2ब्) .
  12. अगर सिरिंज में बुलबुला ऊपर और नीचे प्रत्येक सांस के साथ चलता है देख कर प्लेसमेंट की पुष्टि करें.
  13. आईटी इंटूबेशन के अतिरिक्त विवरण पहलेप्रकाशितकिए जा चुके हैं। कुल प्रक्रिया समय, संज्ञाहरण को छोड़कर, एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित ऑपरेटर के लिए 10-15 s रहता है.

5. गैर-ऑपरेटिव आईबी intubation और वितरण दृष्टिकोण

  1. जिला दाहिने फेफड़े के चयनात्मक लोबार कैनुलेशन के लिए आईबी दृष्टिकोण
    1. IT कनुलन (चरण 4-11) करने के बाद, प्लास्टिक बोर्ड को घुमाएं +30](चित्र 4क)।
    2. कैथेटर के हब को पकड़ो और इसे स्वाभाविक रूप से माउस मिडलाइन के समानांतर मार्गदर्शन करें, इसे सारणी 1में वर्णित भार-आधारित गहराई तक विस्तारित करें।
      नोट: इन गहराई में प्रतिरोध ध्यान दिया जाना चाहिए. इस बिंदु पर, माउस थोड़ा tachypneic हो जाएगा, के रूप में प्रतिनिधि परिणामों में समझाया. एक अनुभवी ऑपरेटर के लिए, प्रयास के लगभग 90% सफलतापूर्वक सही फेफड़ों cannulate कर सकते हैं (tachypnea के साथ उल्लेख किया).
    3. एक जेल लोडिंग टिप के साथ 0.3% इवांस नीले रंग (EBD, सामग्री की तालिकादेखें) के 20 $L उद्धार.
    4. कांच के ड्रॉपर का उपयोग करके वायु के 1-2 ऐलिकोट (0ण्1 एमएल प्रत्येक) का वितरण करें।
      नोट: यह कैथेटर के अंदर से अवशिष्ट EBD समाधान (या प्रयोगात्मक एजेंटों) की निकासी सुनिश्चित करता है.
    5. कैथेटर वापस लेने, तो 30 s के लिए माउस की स्थिति को बनाए रखने.
    6. एक वार्मिंग कंबल पर जानवर प्लेस जब तक यह चेतना हासिल है. वसूली आम तौर पर 2 मिनट के भीतर पूरा हो गया है.
  2. जिला बाएं फेफड़ों के चयनात्मक खंडीय कैनुलेशन के लिए आईबी दृष्टिकोण
    1. IT कनुलन (चरण 4-11) करने के बाद, प्लास्टिक बोर्ड -74 डिग्री (चित्र4ठ)को घुमाएं।
    2. कैथेटर के हब पकड़ो और बाएं mainstem ब्रोंकस में कैथेटर अग्रिम करने के लिए कोमल दबाव लागू करते हैं, जबकि मामूली दबाव दोनों नीचे (90 डिग्री) रखने और bookend की ओर. सारणी 1में नोट की गई गहराई पर प्रचालक को प्रतिरोध को नोट करना चाहिए क्योंकि बाएँ फेफड़े के निचले खंड लगे हुए हैं। यदि tachypnea होता है, कैथेटर को 20-25 मिमी की स्थिति में वापस ले लो, और पुन: प्रयास.
    3. बाएं निचले फेफड़ों के क्षेत्रों को छानने के बाद, एजेंट प्रशासन के लिए गुरुत्वाकर्षण सहायता की अनुमति देने के लिए स्थिति में परिवर्तन की आवश्यकता होती है। प्लास्टिक बोर्ड को घुमाएँ -30डिग्री (चित्र4ठ)
    4. एक जेल लोडिंग टिप के साथ 0.3% EBD के 40 $L उद्धार.
      नोट: यह एजेंट की एक बड़ी मात्रा देने के लिए संभव है क्योंकि बाएं फेफड़े केवल एक पालि है.
    5. कांच के ड्रॉपर का उपयोग करके वायु के 1-2 ऐलिकोट (0ण्1-0ण्3 एमएल प्रत्येक) का वितरण की।
      नोट: यह कैथेटर के अंदर से किसी भी अवशिष्ट EBD (या प्रयोगात्मक एजेंटों) की निकासी सुनिश्चित करता है.
    6. कैथेटर वापस लेने, तो 30 s के लिए माउस की स्थिति को बनाए रखने.
    7. एक वार्मिंग कंबल पर जानवर प्लेस जब तक यह चेतना हासिल है. वसूली आम तौर पर 2 मिनट के भीतर पूरा हो गया है.
  3. आईबी प्रशासन के अनुकूलन के लिए छोड़ दिया है या सही फेफड़ों की संपूर्णता के लिए एजेंट की डिलीवरी की अनुमति
    नोट: यदि ऑपरेटर एजेंटों को वितरित करने के लिए नहीं एक विशिष्ट सही फेफड़ों की पालि या बाएँ फेफड़ों के खंड के लिए करना चाहता है, बल्कि पूरे फेफड़ों के लिए (दाएं या बाएं फेफड़ों), कैथेटर थोड़ा संबंधित mainstem ब्रोंची को वापस ले लिया जाना चाहिए, इस प्रकार है.
    1. सही पूरे फेफड़ों प्रशासन
      1. चरण 4ण्11 के बाद, प्लास्टिक बोर्ड को घुमाएं +30](चित्र 5क)।
      2. कैथेटर के हब को पकड़ो और यह माउस मिडलाइन के समानांतर में स्वाभाविक रूप से मार्गदर्शन, यह सही पक्षीय distal lobar cannulation के लिए आवश्यक गहराई तक पहुँचने (तालिका1).
      3. tachypnea हस्ताक्षर की उपस्थिति की पुष्टि करें.
      4. एजेंट वितरण के लिए गुरुत्वाकर्षण सहायता को सक्षम करने के लिए माउस -74 ] घुमाएँ (चित्र 5B) .
      5. कैथेटर को उस स्थिति में वापस ले लें जो दाएँ मेनस्टेम ब्रोंकस (सारणी1) के टेकऑफ़ से मेल खाती हो । सुनिश्चित करें कि कैथेटर का बेवल नीचे की ओर होता है (चित्र 5ख) ।
      6. एक जेल सही फेफड़ों के लिए टिप लोड हो रहा है के साथ 0.3% EBD के 30 $L उद्धार.
      7. काँच के ड्रॉपर का उपयोग करके वायु का 1-2 ऐलिकोट (0ण्1-0ण्3 ल प्रत्येक) का वितरण की।
      8. कैथेटर वापस लेने, तो 30 s के लिए माउस की स्थिति को बनाए रखने के एक वार्मिंग कंबल पर जानवर प्लेस जब तक यह चेतना हासिल है. वसूली आम तौर पर 2 मिनट के भीतर पूरा हो गया है.
    2. वाम पूरे फेफड़ों प्रशासन
      1. चरण 4-11 के बाद, प्लास्टिक बोर्ड -74 डिग्री (चित्र6क) घुमाएं। वैकल्पिक रूप से, रोटेशन चरण 5.3.1.8 के बाद श्वासनली के लिए कैथेटर वापस लेने के द्वारा हो सकता है, द्विपक्षीय आईबी एजेंट प्रशासन को सक्षम करने.
      2. कैथेटर के हब पकड़ो और बाएं mainstem कैथेटर में कैथेटर अग्रिम करने के लिए कोमल दबाव लागू करते हैं, जबकि मामूली दबाव दोनों नीचे (90 डिग्री) रखने और bookend की ओर. अंतर्विका की गहराई सारणी 1द्वारा निर्देशित होती है।
      3. कोई tachypnea हस्ताक्षर की पुष्टि करें.
      4. माउस घुमाएँ +86] एजेंट प्रशासन के साथ गुरुत्वाकर्षण सहायता के लिए अनुमति देने के लिए.
      5. कैथेटर को बाएं मेनस्टेम ब्रोंकस (दाएं फेफड़े के समान दूरी पर पर्याप्त, सारणी 1) को वापस ले लें और कैथेटर के बेवल को नीचे की ओर घुमाएं (चित्र 6ख)
      6. बाएं फेफड़े के लिए एक जेल लोडिंग टिप के साथ 0.3% EBD के 30 $L उद्धार.
      7. काँच के ड्रॉपर का उपयोग करके वायु का 1-2 ऐलिकोट (0ण्1-0ण्3 ल प्रत्येक) का वितरण की।
      8. कैथेटर वापस लेने, तो 30 s के लिए माउस की स्थिति को बनाए रखने के एक वार्मिंग कंबल पर जानवर प्लेस जब तक यह चेतना हासिल है. वसूली आम तौर पर 2 मिनट के भीतर पूरा हो गया है.

6. प्रत्येक फेफड़ों के लिए एजेंट की खुराक समायोजित मात्रा देने के लिए अनुक्रमिक आईबी cannulation दृष्टिकोण का उपयोग

  1. आईटी प्रशासन समूह
    1. 4-1-4-11 के चरणों में वर्णित IT कनकुलन निष्पादित करें.
    2. 0.05% FITC-dextran के 60 $L उद्धार (सामग्री की तालिकादेखें) एक जेल लोडिंग टिप के साथ (चित्र 1B)।
    3. कांच के ड्रॉपर का उपयोग करके वायु के 1-2 ऐलिकोट (0ण्1-0ण्3 एमएल प्रत्येक) का वितरण की।
    4. 60 s के लिए स्थिति रखें और ऊपर वर्णित के रूप में माउस वसूली के लिए अनुमति देते हैं.
  2. सममित द्विपक्षीय आईबी प्रशासन
    1. चरण 5.3.1.1-5.3.1.8 (दाएं फेफड़े) और कदम 5.3.2.1-5.3.2.8 (बाएं फेफड़े) प्रदर्शन.
    2. फेफड़ों के प्रत्येक पक्ष के लिए 0.05% FITC-dextran (या एक प्रयोगात्मक एजेंट) के बराबर मात्रा (30 जेडएल) प्रशासन।
  3. खुराक-समायोजित द्विपक्षीय आईबी प्रशासन
    1. चरण 5.3.1.1-5.3.1.8 (दाएं फेफड़े) और चरण 5.3.2.1-5.3.2.8 (बाएं फेफड़े) प्रदर्शन.
    2. बड़ा दाहिने फेफड़े के लिए 0.05% FITC-dextran की बड़ी मात्रा (40 डिग्री सेल्सियस) प्रशासन, और छोटे बाएं फेफड़ों के लिए 0.05% FITC-dextran की एक छोटी मात्रा (20 डिग्री सेल्सियस)। FITC-dextran के बदले में, एक प्रयोगात्मक एजेंट प्रशासित किया जा सकता है.

7. खुराक समायोजित आईबी प्रशासन का उपयोग एकल खुराक ब्लियोमाइसिन की समरूपता में सुधार करने के लिए (बीएलएम)-प्रेरित फेफड़ों की चोट

  1. BLM प्रशासन समूहों
    1. खुराक-समायोजित आईबी-बीएलएम (1.2 मिलीग्राम/किग्रा, सामग्री की तालिकादेखें ) प्रशासन समूह: 60 $L (बाएं फेफड़ों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस और क्रमशः बाएं फेफड़े के लिए 40 डिग्री सेल्सियस) बीएलएम समाधान के चूहों को दिया गया (द $ 5)। नियंत्रण (द र् 5) को लवण के समान खंड प्राप्त हुए।
      नोट: चरण 5.3.1 और 5.3.2 करने के लिए देखें।
    2. आईटी प्रशासन समूह: BLM समाधान के 60 $L आईटी प्रशासन तकनीकों के साथ चूहों को दिया गया.
      Note: 6.1.1.6.1.4 चरणों को देखें.
  2. फेफड़ों के समारोह माप
    1. BLM या नमकीन के बाद 21 दिन, केटामाइन के एक इंट्रापेरिटोनल (आईपी) इंजेक्शन (160 मिलीग्राम/किलोग्राम) और xylazine (32 मिलीग्राम/किलोग्राम) के साथ चूहों एनेस्थेटाइज।
    2. पंजा /टू पिंच द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की पुष्टि करने के बाद, 18 जी कैनुला के साथ एक ट्रेकोस्टोमी करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    3. चूहों को वेंटीलेटर से कनेक्ट करें और श्वसन यांत्रिकी को मापें जैसा कि पहले वर्णित4.
  3. फेफड़ों के ऊतकों के संग्रह और प्रसंस्करण
    1. फुफ्फुसीय यांत्रिकी के माप के बाद, कार्डियक पंचर द्वारा एनेस्थेटाइज्ड चूहों को इच्छामृत्यु दें।
    2. छाती की दीवार खोलें और द्विपक्षीय न्यूमोथोरेस को प्रेरित करें।
    3. पीबीएस में 1% कम पिघल agarose (40 डिग्री सेल्सियस)5 के साथ फेफड़ों को एक सुसंगत दबाव (42 सेमी एच2हे) पर फुलाना।
    4. लंबे अक्ष अनुप्रस्थ साथ फेफड़ों के चार से पांच टुकड़े कट, 10% formalin में ठीक है, और पैराफिन में एम्बेड.
    5. कोलेजन जमाव कल्पना करने के लिए Masson के ट्राइक्रोम के साथ 5 डिग्री मीटर वर्गों और दाग कट।

8 पोस्ट-प्रक्रिया देखभाल

  1. अस्तित्व प्रक्रियाओं के अंत में, यह चेतना हासिल जब तक एक वार्मिंग कंबल पर जानवर जगह है. वसूली आम तौर पर 2 मिनट के भीतर पूरा हो गया है.

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Representative Results

चुनिंदा आईबी इंटूबेशन विशिष्ट लोब (दाएं फेफड़े) या बेसिलर खंडों (बाएं फेफड़े) को लक्षित करता है।

आईबी प्रशासन EBD के सही फेफड़ों के लिए किया गया था के रूप में अनुभाग 5.1 में वर्णित. प्रयोग के पूरा होने के बाद, चूहों intraperitoneal ketamine/xylazine की एक घातक खुराक प्रशासित किया गया, और फेफड़ों EBD वितरण के प्रदर्शन के लिए काटा गया (चित्र 4A, सही). फेफड़ों की सकल उपस्थिति दर्शाता है कि प्रयास के 90% सही फेफड़ों के छोटे पीछे पालि cannulated, जबकि प्रयास के 10% अवर पालि लक्षित. यह अनुमान लगाया जाता है कि इन खण्डों की छोटी मात्रा में डिस्टल कैनुलेशन के दौरान माउस के प्रतिपूरक टैकपनेया को समझाया जाता है (कैथेटर के माध्यम से मिनट वेंटिलेशन बनाए रखने के लिए)।

आईबी प्रशासन के बाएं फेफड़े के लिए EBD के रूप में वर्णित किया गया था अनुभाग 5.2. 100% प्रयास बाएं फेफड़े के निम्न खंडों को लक्षित करते हैं (चित्र 4ख) । दाएँ तरफा intubation के विपरीत, कोई tachypnea इस सगाई के साथ होता है, बड़ा बाएँ फेफड़ों के क्षेत्रों के intubation (और वेंटिलेशन) को दर्शाती है.

चयनात्मक आईबी कैनुलेशन तकनीक का अनुकूलन पूरे बाएं या दाएं फेफड़ों को लक्षित कर सकता है।

एक बार आईबी कैनुलेशन किया जाता है, आईबी कैथेटर की वापसी (और माउस स्थिति में परिवर्तन, के रूप में अनुभाग में विस्तृत 5.3) सही फेफड़ों के सभी खण्डों के लिए एजेंटों की डिलीवरी में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (और बाएं फेफड़े के सभी क्षेत्रों). सही फेफड़े के लिए ईबीडी समाधान का संकेत (खंड 5.3.1) सफलतापूर्वक सभी सही पालियों को लक्षित किया, जैसा कि चित्र 5Cमें दिखाया गया है। बाएं फेफड़े के लिए EBD समाधान का instillation (अनुभाग 5.3.2) सफल लक्षित सभी बाएँ क्षेत्रों (चित्र 6C) .

आईटी प्रशासन या सममित आईबी प्रशासन लब्धि असममित फेफड़ा पैरेन्काइमल एजेंट सांद्रता, जिसे आईबी खुराक-समायोजन द्वारा सही किया जा सकता है।

चूहे ने बाएं फेफड़े के लिए 0.05% FITC-dextran के 30 $L के द्विपक्षीय प्रशासन और 0.05% FITC-dextran के रूप में अनुभाग 6.2 में वर्णित सही फेफड़ों के लिए किया. वैकल्पिक रूप से, चूहों को अनुभाग 6.1 के अनुसार 0.05% FITC-dextran इंट्राट्रेकली के 60 $L प्राप्त हुए। प्रयोग के अंत में, चूहों टर्मिनल संज्ञाहरण अधिक मात्रा के माध्यम से ethanized थे (ketamine/ फेफड़ों को तुरंत काटा गया और homogenized. FITC-fluorence (ऑप्टिकल घनत्व द्वारा परिमाणित) 96 अच्छी तरह से प्लेट रीडर के साथ मापा गया था. दो समूह तुलना के लिए छात्र के टी परीक्षण के साथ दिनांक का विश्लेषण किया गया.

चित्र 7में विस्तृत रूप में , दोनों IT (चित्र 7A) और सममित आईबी प्रशासन ( FITC-dextran केचित्र 7B) के कारण असममित फेफड़े की पैरेन्काइमल FITC फ्लोरोसेंट हुआ, अधिक सापेक्ष सांद्रता के साथ (वजन के लिए सामान्यीकृत) में उल्लेख किया गया बाएं फेफड़े. यह पता चलता है कि आईटी प्रशासन के बाद प्रयोगात्मक एजेंटों के असममित फेफड़ों की डिलीवरी प्रत्येक mainstem ब्रोंकस के लिए इन एजेंटों के असममित प्रस्तुति का परिणाम नहीं है. इसके बजाय, यह परिकल्पना की गई थी कि समान मेनस्टेम डिलीवरी (सममित आईबी प्रशासन द्वारा सुनिश्चित) फेफड़ों के वजन/मास में अंतर से पतला हो गया था, जैसा कि तालिका 2में देखा गया है।

सममित वितरण में इन मतभेदों को दूर करने के लिए, 0.05% FITC-dextran के 40 $L बड़ा सही फेफड़ों के लिए प्रशासित किया गया था और छोटे बाएं फेफड़े के लिए 20 $L, अनुभाग 6.3 के अनुसार. इस "डोज-समायोजित आईबी प्रशासन" ने फेफड़ों के पैरेन्काइमल एजेंट डिलीवरी की सममिति में सुधार किया (चित्र 8क)। इस सुधार के बावजूद, हमने दाहिने फेफड़े के विभिन्न खण्डों में लगातार विषमता देखी (चित्र 8ख)।

BLM प्रेरित फेफड़ों की चोट विभिन्न वितरण प्रणाली में:

यह प्रदर्शित करने के लिए कि प्रयोगात्मक एजेंटों की खुराक समायोजित आईबी प्रशासन फैलाना फेफड़ों की बीमारी की मॉडलिंग में सुधार कर सकते हैं, हम BLM प्रशासित (फाइब्रोसिंग फेफड़ों की चोट का एक माउस मॉडल) या तो intratracheally या खुराक के माध्यम से समायोजित आईबी प्रशासन, अनुभाग के अनुसार 7. चोट के इस मॉडल के साथ उम्मीद के रूप में, दोनों आईटी और BLM के आईबी इंजेक्शन फेफड़ों की चोट और प्रणालीगत बीमारी के लिए नेतृत्व (वजन के नुकसान के साथ). इस प्रणालीगत बीमारी 7 दिनों में हल. 21 दिन की मृत्यु दर आईटी समूह में 20% (1/5) और खुराक-समायोजित आईबी समूह में 0% (0/5) थी।

आईटी- या आईबी-बीएलएम प्रशासन के 21 दिन बाद, चूहों को फेफड़ों के ऊतकों के लिए काटा गया। के रूप में प्रतिनिधि हिस्टोलॉजिक छवियों में प्रदर्शन (चित्र 9A),

फाइब्रोटिक फेफड़ों की चोट के इस बेहतर बाएँ-दाएँ एकरूपता शारीरिक रूप से प्रासंगिक है, तो यह निर्धारित करने के लिए, यह देखा गया कि बीएलएम की खुराक समायोजित आईबी प्रशासन ने श्वसन क्षमता (आईसी) और श्वसन प्रणाली अनुपालन का अधिक सुसंगत नुकसान प्रदान किया (क्र), साथ ही श्वसन तंत्र में सामंजस्य वृद्धि (एर्स) (चित्र9ख)।

Figure 1
चित्र 1: माउस एयरवे कैनुलेशन की एनाटॉमी। (ए) एक माउस एयरवे कास्ट सिलिकॉन इलैस्टोमर के साथ एक माउस फेफड़े (एक 25 ग्राम माउस से फसली) inflating द्वारा बनाया गया था। (बी) मानक आईटी प्रशासन के लिए कैथेटर प्लेसमेंट। (सी) आईबी प्रशासन के लिए कैथेटर प्लेसमेंट। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: कार्य प्लेटफ़ॉर्म के लिए सेटअप करें. (ए) धातु का पुत्तन (90 डिग्री कोण) 70 डिग्री की मुड़ी हुई है। एक पेंच छेद एक चल लंगर के लिए शीर्ष midline में रखा गया है (80 मिमी x 150 मिमी). हुक और पाश टेप और एक निलंबित सीवन बोर्ड पर एक एनेस्थेटाइज्ड माउस की स्थिति की अनुमति देने के लिए रखा जाता है। (बी) प्लास्टिक बोर्ड धातु bookend पर एक पेंच के साथ लंगर है. पेंच पर्याप्त रूप से एक दक्षिणावर्त (+) या counterclockwise (-) दिशा में बोर्ड के रोटेशन की अनुमति देने के लिए ढीला है। (C) एक एनेस्थेटाइज्ड माउस को हुक और लूप टेप (0.75"W) IT/IB एजेंट प्रशासन के लिए उपयोग करके स्थित किया जाता है. सिर स्थिरीकरण की अनुमति देने के लिए माउस छेदक के नीचे सीवन पारित किया जाता है। ऑपरेटर माउस के पृष्ठीय पहलू पर तैनात है, और गर्दन एक हंस गर्दन दीपक के माध्यम से प्रबुद्ध है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: आईबी प्रशासन के लिए अनुकूलित कैथेटर का निर्माण। (चरण 1) mainstem ब्रोंची संलग्न करने के लिए पर्याप्त कैथेटर लंबाई सक्षम करने के लिए, दो कैथेटर संयुक्त कर रहे हैं. (चरण 2) कैथेटर्स एक मामूली कोण पर जुड़े हुए हैं, mainstem ब्रोंची के लिए चयनात्मक intubation की सुविधा. (चरण 3) इसके अलावा, जिला कैथेटर टिप beveled है, airway instillation के बेहतर दिशात्मक नियंत्रण की अनुमति. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: चयनात्मक दाएँ/बाएँ फेफड़ों के लोबार कैनुलेशन और प्रशासन के लिए दृष्टिकोण। (ए) सही फेफड़ों को लक्षित करने के लिए, प्लास्टिक बोर्ड को 30 डिग्री घुमाया जाता है, चुनिंदा सही मेनस्टेम ब्रोंकस को आकर्षक बनाने में आसानी में सुधार होता है। कैथेटर उन्नत है (तालिका 1में प्रस्तावित दूरी के अनुसार) चुनिंदा सही तरफा पालियों को संलग्न करने के लिए। 0.3% ईबीडी के 20 $L प्रशासित किया गया था। प्रयासों के $90% में, पश्च पालि को कैनालकिया जाता है। प्रयासके शेष 10% अवर पालि को संलग्न करते हैं। (बी) बाएं फेफड़े को लक्षित करने के लिए, प्लास्टिक बोर्ड को बाएं मेनस्टेम सगाई के लिए पहले घुमाया जाता है -74 डिग्री। कैथेटर के सफल intubation के बाद, रोटेशन तो करने के लिए कम हो जाता है -30 डिग्री गुरुत्वाकर्षण के लिए एजेंट वितरण के साथ सहायता करने के लिए अनुमति देने के लिए. बाईं ओर की चयनात्मक सगाई साबित करने के लिए, 0.3% EBD के 40 $L दिया गया था. इस दृष्टिकोण लगातार (प्रयासों का 100%) लक्षित छोड़ दिया फेफड़ों बेसिलर क्षेत्रों. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: एकपक्षीय रूप से एजेंटों को पूरे दाहिने फेफड़ों में वितरित करने के लिए सममित प्रशासन दृष्टिकोण। (ए ) दायां-सा आईबी अंतर्विद्युति +30 डिग्री पर किया गया था, जो चयनात्मक दाएँ फेफड़े लोबार कनुलन के समान था (चित्र 4क) (ख) प्लास्टिक बोर्ड को तब घुमाया गया था -74 डिग्री एजेंट प्रशासन के दौरान गुरुत्वाकर्षण सहायता के लिए अनुमति देने के लिए. कैथेटर टिप तो तालिका 1में विस्तृत गहराई को वापस ले लिया है, सही mainstem ब्रोंकस के लिए इसी. टिप के बेवल कैथेटर हब घूर्णन द्वारा नीचे की ओर तैनात है। (ग) 30 डिग्री सेल्सियस ईबीडी का वितरण -74 डिग्री पर किया गया था, जो ईबीडी के फैलाना सही फेफड़ों के प्रशासन को साबित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: सममित प्रशासन दृष्टिकोण पूरे बाएं फेफड़ों के लिए एकपक्षीय प्रशासन एजेंटों के लिए . (क) वाम-पक्षीय आईबी अंतर्विद्युति -74 डिग्री पर किया गया था, जो चयनात्मक बाएं फेफड़े के लोबर कैनुलेशन के समान था (चित्र 4ख) (बी) एक सफल intubation के बाद, प्लास्टिक बोर्ड तो घुमाया गया था +86] एजेंट प्रशासन के दौरान गुरुत्वाकर्षण सहायता के लिए अनुमति देने के लिए. कैथेटर टिप तो तालिका 1में विस्तृत गहराई से वापस ले लिया है. टिप के बेवल कैथेटर हब घूर्णन द्वारा नीचे की ओर स्थानांतरित कर दिया है। (सी) ईबीडी के 30 डिग्री एल जेल लोडिंग टिप के साथ दिया गया था, साबित ईबीडी के फैलाना छोड़ दिया फेफड़ों प्रशासन. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्रा 7: प्रयोगात्मक एजेंटों के आईटी प्रशासन समान रूप से mainstem ब्रोंची को दिया जाता है, फिर भी अलग फेफड़ों के पैरेन्काइमल सांद्रता की ओर जाता है। (ए) 0.05% FITC-dextran के आईटी प्रशासन (60 डिग्री सेल्सियस) बाएं फेफड़ों में उच्च फ्लोरोसेंट प्रदान किया, वितरित एजेंट के असमान फेफड़ों सांद्रता का सुझाव. (बी) यह असमान फेफड़े का पैरेन्काइमल फ्लोरोसेंट तब भी बना रहता है जब 0.05% FITC-dextran (30 $L) की बराबर मात्रा प्रत्येक मेनस्टेम ब्रोंकस को प्रशासित की जाती है। यह लगातार पैरेन्काइमल असंतुलन, समान दाएँ/बाएँ mainstem वितरण के बावजूद, पता चलता है कि फेफड़ों के एजेंट सांद्रता में मतभेद बड़ा सही फेफड़ों में कमजोर पड़ने को प्रतिबिंबित (एन $ 10 प्रति समूह). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: खुराक-समायोजित आईबी द्वारा एजेंट जमा की बेहतर एकरूपता प्रशासन. (ए) फेफड़ों की पैरेन्काइमल प्रसव की विषमता में सुधार होता है जब एजेंट का एक बड़ा अनुपात (40 डिग्री सेल्सियस 0.05% FITC-dextran) बड़े दाहिने फेफड़ों के लिए प्रशासित किया जाता है और एजेंट का एक कम अनुपात (20 $ 0.05% FITC-dextran) छोटे बाएं फेफड़ों के लिए. (ख) इस बेहतर बाएँ-दाएँ समरूपता के बावजूद, एजेंट निक्षेपण (काला: श्रेष्ठ पालि; पीला: मध्य पालि; नीला: निम्न पालि; हरा: पश्च पालि; लाल: बाएं फेफड़े) की लोबार विषमता बनी हुई है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: खुराक समायोजित आईबी प्रशासन का उपयोग कर माउस BLM प्रेरित फेफड़ों फाइब्रोसिस मॉडल का सुधार. (क) बीएलएम का आईटी प्रशासन (1.2 मिलीग्राम/किग्रा 60 डिग्री सेल्सियस समाधान में) 21 दिन बाद बाएं तरफ के प्रमुख फेफड़ों की चोट/फाइब्रोसिस को प्रेरित करता है, जो इस छोटे फेफड़ों में एजेंट की उच्च फेफड़ों की सांद्रता के अनुरूप होता है। बाएं-दाएँ समरूपता फेफड़ों के प्रत्येक पक्ष के लिए BLM की मात्रा का समायोजन करके सुधार: समाधान के 40 डिग्री एल बड़े दाहिने फेफड़ों के लिए प्रशासित किया जाता है और समाधान के 20 डिग्री एल छोटे बाएं फेफड़ों के लिए प्रशासित किया जाता है। मैं: अवर पालि, एम: मध्य पालि, एस: बेहतर पालि, पी: पीछे पालि. छवियाँ एक एकल, प्रतिनिधि माउस से lobes प्रतिनिधित्व करते हैं. (बी) वितरण की बेहतर समरूपता के अनुरूप, बीएलएम की खुराक-समायोजित आईबी प्रशासन फेफड़ों की फाइब्रोसिस के शारीरिक मॉडलिंग में सुधार करता है, श्वसन प्रणाली में अधिक प्रतिनिधि वृद्धि के साथ (एर्स) और कम हो जाता है श्वसन क्षमता (आईसी) और गतिशील श्वसन प्रणाली अनुपालन (सी.आर.एस.)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

शरीर का वजन (छ) परीक्षण किए गए चूहों की संख्या कैथेटर गहराई (मिमी)
चयनात्मक कैनुलेशन के लिए		 पूरे फेफड़ों के कैनुलेशन के लिए कैथेटर गहराई (मिमी)
दायाँ फेफड़े बाएँ फेफड़े
15 - 19 17 37 38 26
20 - 25 22 38 39 27
25 - 30 29 39 40 28
और 30 11 40 41 31

तालिका 1: कैथेटर प्रविष्टि की सुझाई गई गहराई. संभावित कैथेटर गहराई चुनिंदा distal और समीपस्थ फेफड़ों cannulate करने के लिए आवश्यक अनुभवजन्य विभिन्न वजन के C57BL/6 चूहों का उपयोग कर निर्धारित किया गया (कुल $ 79 चूहों).

शरीर का वजन (छ) परीक्षण किए गए चूहों की संख्या फेफड़ों के वजन का अनुपात
14 - 10 25 २.०१ ] 0.16
20 - 25 35 1.88 ] 0.27
25 - 30 15 1.88 ] 0.27
और 30 6 २.०९ ०९०९a ।

तालिका 2: दाएँ: बाएँ फेफड़ों के वजन अनुपात. फेफड़ों के वजन में अंतर 81 C57BL/6 चूहों में मनाया सही आईबी दवा प्रशासन के लिए तर्क प्रदर्शित करता है. फेफड़ों को काट दिया गया और केटामाइन और जाइलज़ीन की घातक खुराक के बाद तौला गया।

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Discussion

फेफड़ों की चोट को बीएलएम 6 जैसे हानिकारक एजेंटों के आईटी प्रशासन का उपयोग करते हुए कृन्तकों में शास्त्रीय रूप से मॉडलिंग की गईहै. इस तरह के आईटी प्रशासन, तथापि, केवल पैची चोट की ओर जाता है, इस दृष्टिकोण7के साथ फेफड़ों की डिलीवरी के nontargeted प्रकृति को दर्शाती है. मॉडलिंग फेफड़ों की चोट की इन सीमाओं शिक्षाप्रद चुनौतियों का सामना करना पड़ रहे हैं जब इस तरह के दवाओं के रूप में गैर हानिकारक प्रयोगात्मक एजेंटों, के आईटी वितरण का प्रयास, siRNA, या सेलुलर चिकित्सा.

इस रिपोर्ट में, हम प्रयोगात्मक एजेंटों के प्रत्यक्ष आईबी प्रशासन का वर्णन करते हैं। इस दृष्टिकोण आईटी प्रशासन के लिए क्लासिक दृष्टिकोण पर दो अलग लाभ प्रदान करता है. सबसे पहले, दृष्टिकोण एक फेफड़ों के लिए चयनात्मक एकतरफा प्रशासन के लिए अनुमति देता है, contralateral फेफड़ों के बख्शने के लिए अनुमति देता है. यह दृष्टिकोण एक एकतरफा घायल फेफड़ों में दवाओं के चयनात्मक प्रशासन के लिए उपयोगीहै (उदाहरण के लिए, इस्किमिया-रिफ्यूजन चोट 8), unnizured फेफड़ों में nonspecific प्रभाव से बचने. इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं के निर्देश ित प्रशासन contralateral से प्राथमिक ट्यूमर विकास भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मेटास्टैटिक प्रसार9,10.

दूसरे, रिपोर्ट में आईबी प्रशासन के पहले से अपरिचित लाभ का विवरण दिया गया है। चित्रा 7Aमें विस्तृत के रूप में, आईटी प्रशासन अपेक्षाकृत छोटे बाएँ फेफड़ों के भीतर प्रयोगात्मक एजेंटों ध्यान केंद्रित. इस विषमता को एजेंट की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा को बड़े दाएँ फेफड़े (सारणी 2 )को देने के द्वारा ठीक किया जा सकता है, जबकि छोटे बाएँ फेफड़े में एक छोटी मात्रा प्रदान करते हुए ( चित्र8क) . BLM प्रेरित फाइब्रोटिक फेफड़ों की चोट के लिए इस खुराक समायोजित आईबी प्रशासन की प्रासंगिकता यहाँ प्रदर्शन किया गया था. खुराक समायोजन बाएं फेफड़े की चोट को कम करता है (जो कम बीएलएम प्राप्त करता है), जबकि दाएं फेफड़े में चोट बढ़ रही है (चित्र 9क)। यह बढ़ी हुई सममिति फेफड़ों की चोट की कम परिवर्तनशीलता के साथ मेल खाती है, जैसा कि फुफ्फुसीय फलन के मापन द्वारा परिमाणित किया गया है (चित्र 9ख)।

वहाँ प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम हैं, आसानी से और बार बार पशु स्थिति बदलने में सक्षम एक स्टैंड की जरूरत भी शामिल है (यानी, रोटेशन). अधिक महत्वपूर्ण यह निर्धारित करने की क्षमता है कि चयनात्मक फेफड़ों के कैनुलेशन को कब हासिल किया गया है। के रूप में खंड 4.12 में वर्णित है, एक स्पाइरोमीटर का उपयोग (जिसमें एक पानी स्तंभ ज्वारीय वेंटिलेशन को दर्शाता है) सफल श्वासनली cannulation3सुनिश्चित करता है. माउस tachypnea का अवलोकन distal दाएँ फेफड़ों खंड cannulation के साथ संगत है, जबकि dyspnea की अनुपस्थिति (कैथेटर प्रविष्टि के साथ प्रतिरोध महसूस कर के बावजूद) बाएं फेफड़े के cannulation का सुझाव दिया. इन गैर ऑपरेटिव स्थानीयकरण तकनीकों का उपयोग करना, ऑपरेटर सही आईबी cannulation और प्रयोगात्मक एजेंट बयान मार्गदर्शन करने में सक्षम होना चाहिए.

इस दृष्टिकोण की कई सीमाएँ हैं. एजेंट वितरण का आईटी मॉडल अपनी सादगी में आकर्षक है। यह अभ्यास और तकनीकी कौशल के एक मध्यम डिग्री की आवश्यकता है, हालांकि एक कुशल ऑपरेटर अभी भी तेजी से isoflurane संज्ञाहरण की खिड़की के भीतर इस तकनीक प्रदर्शन कर सकते हैं. तथापि, अपेक्षित अतिरिक्त तकनीकी कौशल/अभ्यास को प्रयोगों में इस दृष्टिकोण के लाभ से आसानी से ऑफसेट किया जा सकता है जो या तो चयनात्मक एजेंट/siRNA/सेल वितरण को प्राथमिकता देते हैं या एजेंट जमा करने की एकरूपता में वृद्धि करते हैं। इस विधि के लिए एक अतिरिक्त सीमा कैथेटर प्रविष्टि की लंबाई के बारे में अनिश्चितता है. तालिका 1में विस्तृत के रूप में , 79 पुरुष और महिला चूहों चयनात्मक आईबी cannulation के लिए आवश्यक कैथेटर प्रविष्टि की गहराई का अनुमान लगाने के लिए मापा गया. ये डेटा हमारे प्रोटोकॉल को निष्पादित करने के लिए ऑपरेटर का मार्गदर्शन करने के लिए एक संसाधन के रूप में कार्य करते हैं। हालांकि, हम आत्मविश्वास से अन्य माउस उपभेदों के लिए हमारे संसाधन extrapolate नहीं कर सकते (नॉकआउट चूहों सहित) या morbidly मोटापे से ग्रस्त चूहों. इसके अलावा, हम मापा नहीं है अगर वहाँ हवाई क्षेत्र की मात्रा में मतभेद हैं (लोबार, खंडीय) कि वजन के आधार पर भिन्न. इस प्रकार, यह संभव है कि बड़े चूहों को आईबी प्रशासन के साथ बड़े instillation मात्रा को समायोजित करने में सक्षम हो सकता है. इस प्रकार, ऑपरेटर एक प्रारंभिक अनुकूलन / समस्या निवारण कदम (EBD instillation का उपयोग करके) यह सुनिश्चित करने के लिए कि हमारी तकनीक अच्छी तरह से वांछित माउस मॉडल के लिए adapted है प्रदर्शन करना चाहिए.

संक्षेप में, यह रिपोर्ट एक उपन्यास आईबी तकनीक का वर्णन करती है जिसका उपयोग चुनिंदा रूप से एक फेफड़े के प्रयोगात्मक एजेंटों को प्रशासित करने के लिए किया जा सकता है या दोनों फेफड़ों में सममित वितरण सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ये लाभ मानक आईटी तकनीकों की तुलना में जटिलता में मामूली वृद्धि का औचित्य साबित करते हैं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को एनएचएलबीआई द्वारा ई.पी.एस. को एचएल125371 अनुदान और डीओडी (CDMRP) अनुदान W81XWH-17-1-0051 द्वारा Y.Y. को वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 G shielded IV Catheter BD 381423
Bleomycin Enzo life sciences BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine  DRE Veterinary 9280
Evans blue dye Sigma-Aldrich E2129
FITC-dextran Sigma-Aldrich FD150
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator AmScope LED-30W
Low temperature cautery with fine tip  Bovie AA02
Precisionglide needle, 18G x 1" BD 305195 Beveled tip, 12 mm in length 
Xylazine AKORN NDC 59399-110-20
Zatamine VetOne NDC 13985-702-10  Ketamine

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References

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Liao, S., Eickelberg, O., Schmidt, E. P., Yang, Y. Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung. J. Vis. Exp. (147), e59450, doi:10.3791/59450 (2019).

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